妊娠早期胎兒染色體非整倍體的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測主要內(nèi)容

妊娠早期胎兒染色體非整倍體的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測主要內(nèi)容摘要：關鍵詞：妊娠早期胎兒染色體非整倍體胎兒DNA片段孕婦體重早孕期無創(chuàng)產(chǎn)前檢測目的：檢測212名812孕周孕婦血漿樣本用以評價無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(NIPT)在早孕期檢測的可行性。方法：參與本研究的高危孕婦來自同一家醫(yī)院，運用大規(guī)模平行測序檢測母體血漿DNA，確定胎兒是否存在21號、18號、13號、X和Y染色體的非整倍體。所有孕婦均需經(jīng)絨毛膜取樣或羊水穿刺，并通過核型分析確認其NIPT結果。跟蹤所有NIPT陰性孕婦至分娩，新生兒隨訪對可能出現(xiàn)的染色體疾病進行臨床評估。結果：NIPT檢測出了包括T21(n=2)、T18(n=1)、T13(n=1)在內(nèi)的常染色體非整倍體，并經(jīng)核型分析驗證。存在一例45,X假陽性和兩例47，XXY和45X[16]/47，XXX[14]假陰性。平均血漿DNA含量為8.54%，胎兒游離DNA含量從8周至12周逐漸遞增。絕大多數(shù)孕婦(95%)血漿中胎兒游離DNA含量超過NIPT的檢測下限4%。早孕期胎兒DNA含量與孕婦體重存在輕微的負相關(R2=0.186)。結論：NIPT用于8-12孕周的早孕期檢測仍有很高的可靠性和準確性。背景無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(NIPT)運用大規(guī)模平行測序檢測胎兒游離DNA，現(xiàn)已作為孕婦常規(guī)產(chǎn)前保健用于多個國家1,2。前瞻性臨床研究結果顯示3-5，NIPT高度可靠，對T21、T18、T13三種常見的染色體綜合征靈敏度和特異性超過99%，但是性染色體非整倍體（SCAs）的假陽性率和假陰性率卻很高。雙胎消失綜合征（vanishingtwin）、DNA含量過低或操作失誤可以部分解釋SCAs假陽性或假陰性1，不過胎盤嵌合6-10和母體染色體異常11才是導致NIPT結果不符的常見原因。目前，用于NIPT的母血漿樣本通常從10孕周至整個中孕期取樣1。在這一妊娠期間，胎盤向母體循環(huán)釋放胎兒游離DNA片段，其含量在10孕周至21孕周維持在10-20%7,12,13。同一孕周的胎兒游離DNA含量往往差異很大7,14,表明不同孕婦之間顯著的生理差異。許多因素會影響胎兒游離DNA含量，其中孕周、孕婦體重和胚胎數(shù)量1,12,15影響最為顯著。已報道的前瞻性臨床研究3證實，NIPT在檢測中孕期胎兒染色體非整倍體方面具有很高的敏感度和特異性。如果將NIPT擴展到早孕期應用，就需證實NIPT在早孕期具有同等的可靠性和精確性。本前瞻性臨床研究共招募212名具有胎兒染色體非整倍體高風險孕婦，以評判NIPT在早孕期8-12孕周的檢測效果。方法試驗設計本研究隨機招募213名高齡（＞35歲）單胎孕婦（圖1）。實驗設計經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)院（PUMCH）倫理審查委員會批準，所有受試者均充分知情。采用Streck管采集8-12孕周的血液樣本，每一樣本配以唯一條碼。孕周通過末次月經(jīng)計算，并于孕7-8周時超聲進一步確認。受試者和樣本的詳細臨床信息均被記錄在數(shù)據(jù)庫中。絨毛膜取樣或羊水穿刺用于產(chǎn)前診斷確診。NIPT和侵入性產(chǎn)前診斷均對受試者免費，分別在貝瑞和康和協(xié)和醫(yī)院進行雙盲檢測。所有NIPT陰性孕婦均最終分娩，并由協(xié)和醫(yī)院兒科醫(yī)師對新生兒進行染色體疾病相關表型的臨床評估。侵入性產(chǎn)前診斷胎兒細胞樣本來自于絨毛膜取樣（11W-13W+6）或羊水穿刺（18W-21W+6）。隨后細胞培養(yǎng)，分辨率320條帶的G顯帶技術分析至少20個細胞。非侵入性產(chǎn)前檢測制備母血漿DNA樣本，構建文庫并添加序列標簽，在illuminaHiseq20平臺上完成測序，并用已發(fā)表文獻中的方法進行數(shù)據(jù)分析3,16。每個NIPT樣本產(chǎn)生5M的36bp序列數(shù)據(jù)，其中約3.5M數(shù)據(jù)可唯一比對到人類基因組圖譜。Z-值（-3<Z<3為正常值）用于判斷胎兒24條染色體的非整倍體狀況。NIPT陽性樣本均經(jīng)測序檢測母血白細胞（WBC）的拷貝數(shù)變異狀況11，以排除陽性來自于母體嵌合的可能。根據(jù)正常男性血漿樣本中Y染色體比例與懷有正常男性胎兒孕婦血漿中的Y染色體比例的百分比，來計算孕婦血漿中男性胎兒的DNA含量14。如早先報道17,通過計算待測樣本和參考樣本之間胎兒DNA異常染色體的比例來判斷是否存在染色體非整倍體。結果2012年5月至2013年8月，共213名>35歲的孕婦同意在北京協(xié)和醫(yī)院參與本研究（圖1）。孕婦平均體重為60.02±8.83kg范圍在41.2-98.0kg）采樣時孕周范圍為8周-12周+6。試驗選擇的212名孕婦中，42名（19.8%）有流產(chǎn)史，13名（6.1%）通過輔助生殖受孕。在收集完213名孕婦血液樣本并進行NIPT后，34名孕婦由于擔心流產(chǎn)或感染風險而拒絕絨毛膜取樣或羊水穿刺。在這34名孕婦中，8名（23.5%）有流產(chǎn)史，3名（8.8%）為輔助生殖受孕。213份樣本中有1份由于紅細胞溶解而未通過QC，后該孕婦未再參與本研究，因此最終參與本研究的為212人。212名孕婦進而分為兩個亞組，較大的一組由178名孕婦組成（組A），她們同時接受NIPT和侵入性產(chǎn)前診斷，較小的一組由34名只接受了NIPT的孕婦組成（組B）（圖1）。接受NIPT檢測的212名孕婦年齡分布和孕周分布見圖2a和圖2b。孕婦平均年齡為37.25歲（年齡范圍為35-45歲），其中182名（85.8%）女性小于40歲。NIPT樣本均來自于早孕期，平均孕周為9周+6（孕周范圍為8周-12周+6）。但212份樣本中的110份來自更早的8周-9周+6孕周。國PUEUtflld國PUEUtflldoRotnz￡purv￡purv匚牙JO..IID右q已『2

B圖2孕婦群體統(tǒng)計：A,孕婦群體的年齡分布（平均年黔37.25歲）.=B,.孕婦祥體的孕周分布（平均孕周9周祐）組A的178份樣本檢測出5例胎兒染色體非整倍體（表1）,包括T21（n=2）、T18（n=1）,、T13（n=1）和45，X（n=1）。隨后的侵入性產(chǎn)前診斷證實了4例三體綜合征，但1例NIPT結果為45，X的樣本被證實為正常的46，XX核型。此外，2例被NIPT檢測為正常的胎兒經(jīng)侵入性產(chǎn)前診斷證實為47,XXY和45,XX[16]/47,XXX[14]。因此，NIPT對性染色體非整倍體存在1例假陽性（0.56%）和2例假陰性（1.12%）。對NIPT檢測不符的3例性染色體非整倍體（SCAs）進行母血漿白細胞測序（WBCs），確定母親為正常的46，XX核型，表明NIPT結果為胎兒特異。所有6名懷有染色體非整倍體胎兒的孕婦選擇了終止妊娠。其余172名陰性孕婦繼續(xù)妊娠，在北京協(xié)和醫(yī)院或其相關醫(yī)院分娩，兒科醫(yī)師對172名新生兒進行染色體綜合征的檢查，排除了新生兒患病的可能。侵入性產(chǎn)前診斷和新生兒檢查表明，nipt對三體綜合征的檢測高度準確，靈敏度(95%CI為T211%(19.79-1%)、T181%(5.46-1%)、T131%(5.46-1%)。特異性(95%CI)為T211%(97.35-1%)、T181%(97.35-1%)、T131%(97.35-1%)。NIPT對性染色體檢測的特異性(95%CI)為99.43%(96.39-99.97%)。表Lnipt陽性或不良妊撮荼昌的受試者信息匚總研敖群樣滴號孕辨齡孕周胎兒DNA含量NIH^果胎J蜘妊娠結局組A（r=17S）hjiPTfn僵入護前診斷12B299388S.50%1（男性）47,X￥,+21遂itm.12B0663995.96%TNU女性）4了雙+21終止姮娠12B26241115.45%Tlfi(男性)47rKVta終止垠娠12B156391011.55%T1M女性）47.XX.+13終也I娠laeioo3695.65%45A順XX足月妊娠4296.06%46.XY47.XXY12G256389未御倒45,47JXXX[li]谿itm.蛆B(n-34)任宜NIPT12BOSS361112.53%女性）未做終止妊娠（胎兒死12B26842114.80%T2(女性)未撤摟（胎兒死1207^839811.B5%45應未做終iBtf娠（心臟畸形）12B0313S97.42%46rX￥未做12B1753510未檢刪到未伐自痢苛12B1763597.%46.XY未做自墉秒12G2S637106.54%未做12B3833710B.27%46.XY未伐在拒絕進行產(chǎn)前診斷的34名孕婦（組B）中，NIPT檢測到3例染色體非整倍體，分別為T21、45，X和T2（表1）。由于胎兒死亡或存在明顯的心臟異常，孕婦選擇了終止妊娠。另有5名孕婦在NIPT取樣后的1-2周發(fā)生了自然流產(chǎn)。遺憾的是，發(fā)生自然流產(chǎn)的孕婦未在協(xié)和醫(yī)院留下記錄，因此沒有相應的流產(chǎn)組織來證實NIPT結果。其余26名NIPT正常的孕婦順利分娩，并由兒科醫(yī)生對新生兒進行檢查，排除了其患有染色體綜合征的可能。我們對1份（47.2%）懷有男性胎兒的孕婦血漿樣本（圖3）進行二次分析，以確認胎兒游離DNA含量與早期孕周的關系。8-12孕周的平均胎兒DNA含量為8.54%，廣泛的分布在2.69%-18.75%。從8周到12周，胎兒游離DNA含量呈現(xiàn)輕微的上升，但8周、9周、10周和12周的胎兒DNA含量方差分析沒有顯著性差異（p=0.18）。具有重要臨床意義的是，1份樣本中有5份（5%）胎兒游離DNA含量低于4%（檢測染色體非整倍體的切割值），其孕周分別為8周+1、10周、11周+1、12周+4和12周+6。1份樣本的胎兒DNA含量與孕婦體重（圖4）呈負相關（R2值為0.186（p<0.1））。5份胎兒DNA含量低于4%的樣本，孕婦體重均高于群體平均值。國m.旦孕期盼兒ONA國m.旦孕期盼兒ONA含量分布.IB。名懷有另性怕凡孕掃的平均SHJLdna^-S；學3閉為

7.09%：孚9云為玷1%，孕：.習為？W褊3111^^7,53%-孕亶.田為9.1814*方菱分析昱

周'9周、F周、”捆的臘兒DMA含址沒有E奢差異（p=O.ia）PwODDIR=-O.431weigh!出#i圈4.分析1全懷有男性胎幾孕婦的體重與脂兒CINA含量的關系.運用皮爾遜相關性分析孕婦體重和胎兒DNA含量兩者之間的關聯(lián)。圖中三角形標識顯示胎兒DNA含量低于4%。討論在對212名孕婦胎兒染色體非整倍體的初步研究中，評估了NIPT用于早孕期的檢測效果。178名孕婦同時接受了NIPT和侵入性產(chǎn)前診斷，34名孕婦只接受7NIPT?；?78份的NIPT、產(chǎn)前診斷以及新生兒隨訪結果，NIPT檢測T21、T18和T13沒有出現(xiàn)假陽性和假陰性。不過NIPT另有1例SCA假陽性和2例SCAs假陰性，假陽性率和假陰性率分別為0.56%和1.12%?？傮w來看，本項針對早孕期高危人群的NIPT研究，取得了與近期報道的1741例中國孕婦、1982例廣東孕婦和1914例美國孕婦4的三個前瞻性試驗相一致的檢測靈敏度和特異性，不過這三個試驗的血液樣本均采集于中孕期。為了解釋3例與核型分析不一致的NIPT結果，我們對所有NIPT結果和臨床數(shù)據(jù)進行了回顧°45，X假陽性案例中的胎兒DNA含量為較低的5.65%，但仍足夠進行精確的NIPT檢測。推測這例NIPT不一致是由45，X限制性胎盤嵌合（CPM）造成，此現(xiàn)象在最近一篇47,XXX的案例中報道過10。遺憾的是，嬰兒出生后我們沒有得到相關的胎兒組織進行驗證。47，XXY假陰性孕婦通過IVF移植兩個未知性別的胚胎而受孕，盡管6.06%的胎兒DNA含量相對較低，但NIPT未檢出的原因可能是雙胎消失的男性胎兒對胎兒游離DNA含量額外貢獻了46,XY序列，這有效的中和了本應從存活的47，XXY胎兒中獲得的額外X染色體片段。孕7周價hCG檢測為64659mIU/ml，這一水平與消失的雙胎水平接近18，這也支持了上述假設。此外，孕7周的超聲顯示存在兩個孕囊和一個胎心，這也意味著存在一個未能存活的胎兒。第二例NIPT假陰性的胎兒核型為45,X[16]/47,XXX[14]嵌合體，進入血液循環(huán)的X染色體片段被相對等量的45,X和47，XXX所中和，故NIPT得出正常女性的結論。盡管如此，這樣的極端案例表明NIPT不能全部檢出實際為嵌合體的胎兒。大部分的T21、T18和T13三體綜合征的胎兒會在早孕期死亡，表現(xiàn)為自然流產(chǎn)19。34名沒有接受侵入性產(chǎn)前診斷的孕婦群體中，NIPT檢測到T21、T2和45，X三個陽性胎兒，其胎兒游離DNA含量分別為12.53%>4.8%和11.85%。根據(jù)臨床記錄，T21和T2兩個胎兒在NIPT取樣后幾天就停止了發(fā)育，45,X的胎兒繼續(xù)發(fā)育但卻出現(xiàn)嚴重的心臟畸形。這三個案例中的胎兒都進行了人工流產(chǎn)，但并未保留胎兒流產(chǎn)組織驗證NIPT結果。同時此組另有5例NIPT陰性的胎兒發(fā)生了自然流產(chǎn)，這5例樣本的胎兒DNA含量在6.94-8.27%之間。由此8個案例可發(fā)現(xiàn)，無論是胎兒生長停滯還是自然流產(chǎn)都不是導致胎兒游離DNA含量低于檢測極限4%的原因。在對1名男性胎兒的研究中發(fā)現(xiàn)，8-12孕周平均胎兒DNA含量為8.54%,5%樣本的胎兒DNA含量低于4%檢測切割值。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)在8周、9周、10周和12孕周胎兒游離DNA含