質(zhì)粒DNA的微量制備及電泳檢測

專業(yè)：姓名：專業(yè)：姓名：學(xué)號：日期：2013年6月4日地點：生物實驗中心310裝訂線課程名稱：生物化學(xué)實驗指導(dǎo)老師：成績：__________________實驗名稱：質(zhì)粒ＤＮＡ的微量制備及電泳檢測實驗類型：同組學(xué)生姓名：無一、實驗?zāi)康暮鸵螅ū靥睿? 二、實驗內(nèi)容和原理（必填）三、實驗材料與試劑（必填）四、實驗器材與儀器（必填） 五、操作方法和實驗步驟（必填）六、實驗數(shù)據(jù)記錄和處理 七、實驗結(jié)果與分析（必填）八、討論、心得實驗?zāi)康?、學(xué)習(xí)并掌握質(zhì)粒DNA的提取原理和方法2、了解瓊脂糖凝膠電泳檢測核酸的原理和操作3、學(xué)習(xí)并掌握對電泳檢測結(jié)果的初步分析實驗原理質(zhì)粒是一種染色體（核質(zhì)體）外的寄生性的自主復(fù)制子，存在于細菌等細胞中，為雙鏈閉環(huán)的DNA分子，大小在1-200kb（千堿基）之間，具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄功能,能表達例如抗性、菌毒素等細胞非必需的遺傳信息，但其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄必須要利用依賴宿主細胞（細菌）基因組DNA編碼的一些酶和蛋白質(zhì)。質(zhì)粒能夠自發(fā)的或人為的在細胞間轉(zhuǎn)移，因此是基因工程技術(shù)中將外源基因?qū)胧荏w細胞的重要載體。細菌DNA和質(zhì)粒DNA形狀上均為雙鏈環(huán)形，但二者的分子量相差較大，細菌DNA的分子量在D左右，而質(zhì)粒DNA的分子量在---D左右。提取純化質(zhì)粒的過程中，細菌DNA大多數(shù)斷裂成線狀分子，而質(zhì)粒DNA則多數(shù)仍為雙鏈環(huán)狀，從而可以將二者分開。2.從細菌細胞中抽提質(zhì)粒DNA分為三個步驟：細菌培養(yǎng)使質(zhì)粒大量擴增；收集和裂解細胞,并去掉細菌碎片和核質(zhì)體DNA；進一步除去蛋白、脂類、RNA等雜質(zhì)，分離和純化質(zhì)粒DNA。本實驗采用堿裂解法來分離純化質(zhì)粒DNA：在EDTA存在下，經(jīng)過SDS處理使細胞膜裂解，從而使菌體充分裂解，利用在堿性條件下（NaOH），使核質(zhì)體DNA與質(zhì)粒DNA的變性；加入乙酸鉀，在中性條件下，核質(zhì)體DNA與質(zhì)粒DNA又存在復(fù)性的差異，質(zhì)粒DNA很快得以復(fù)性，而細菌核質(zhì)體DNA分子難以復(fù)性，核質(zhì)體DNA會纏繞附著在細胞膜碎片上通過離心被沉淀下來，質(zhì)粒DNA則留在上清液內(nèi)；上清液中還含有可溶性蛋白質(zhì)、核糖核蛋白和少量核質(zhì)體DNA以及脂質(zhì)類雜質(zhì)等，可通過堿性酚-氯仿-異戊醇混合液的抽提去除；含有質(zhì)粒DNA的上清液用無水乙醇或異戊醇沉淀，這是由于當(dāng)加入無水乙醇時，其會奪去核酸周圍的水分子，使其失水而易于聚合。一般用2倍體積的乙醇或1倍體積的異丙醇沉淀DNA和RNA。獲得較純的質(zhì)粒DNA。４.堿性SDS法的分離原理：當(dāng)溶液的pH值調(diào)節(jié)到大于12時，雙鏈DNA中的氫鍵被破壞，于是染色體DNA的雙鏈便分離成單鏈；而超螺旋狀態(tài)的質(zhì)粒DNA僅僅是部分氫鍵被破壞，并且只發(fā)生部分雙鏈解離成單鏈的變化。當(dāng)再將溶液的pH值調(diào)回中性時，單鏈DNA互相纏繞并且與蛋白質(zhì)結(jié)合生成網(wǎng)絡(luò)狀大分子，而超螺旋地質(zhì)粒發(fā)生復(fù)性反應(yīng)后仍然是小分子，通過離心的方法將兩者分開。５.實驗過程步驟原理圖如下：溶菌酶SDS細菌破細胞壁破細胞膜（含質(zhì)粒）NaOH（細菌DNA和質(zhì)粒DNA均通過變性成為線狀分子）冰醋酸細菌DNA與變性蛋白和細胞碎片纏繞在一起（不能復(fù)性)離心質(zhì)粒DNA經(jīng)復(fù)性后變?yōu)楣矁r閉合環(huán)狀沉淀：細菌DNA、細胞碎片等酚：氯仿上清：質(zhì)粒DNA、RNA、可溶性蛋白等離心下層：酚、氯仿中層：變性蛋白無水乙醇上清（水層）：質(zhì)粒DNA、RNA等離心上清：可溶性雜質(zhì)等RNase沉淀：質(zhì)粒DNA、RNA等質(zhì)粒DNA６.DNA的瓊脂糖凝膠電泳鑒定:核酸是一種兩性電解質(zhì)（堿基、磷酸），在pH8.0下，核酸帶負電荷，電泳時向正極移動，根據(jù)核酸分子所帶電荷的多少，分子的大小及構(gòu)型的差異，可用電泳的方法對核酸進行分離和鑒定。DNA分子在瓊脂糖凝膠中有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在堿性溶液中（pH8.3緩沖液）帶負電荷，它在電場作用下向正極泳動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即具有不同的相對分子量的DNA片段泳動速度不同，并能區(qū)分出不同的區(qū)帶。DNA片斷在凝膠中當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙錠（EB）染色后，在紫外光下可見橙紅色帶，并可確定DNA片斷在凝膠中的位置。７.影響DNA泳動速率（遷移率）的因素有：⑴DNA分子質(zhì)量的影響：雙鏈DNA分子遷移的速率與DNA分子量對數(shù)成反比。分子量越大，遷移率越小。⑵DNA構(gòu)型的影響：超螺旋DNA＞線狀DNA＞開環(huán)DNA⑶膠濃度的影響：濃度越低，相同核酸分子遷移越快，一般常用的凝膠濃度為1％～2％；⑷電場強度的影響：電場強度愈大，帶點顆粒的泳動越快。但凝膠的有效分離范圍隨著電壓增大而減小，所以電泳時一般采用低電壓，（一般5V/cm）（電場強度）。而對于大片段電泳，甚至用0.5～1.0V/cm電泳過夜。進行高壓電泳時，只能使用聚丙烯酰胺凝膠。⑸EB：溴化乙錠（EB）插入雙鏈DNA造成其負電荷減少、剛性和長度增加。⑹電泳緩沖液的影響:核酸電泳常采用TAE、TBE、TPE三種緩沖系統(tǒng)，但它們各有利弊。TAE價格低廉，但緩沖能力低，必須進行兩極緩沖液的循環(huán)。TPE在進行DNA回收時，會使DNA污染磷酸鹽，影響后續(xù)反應(yīng)。所以多采用TBE緩沖液。在緩沖液中加入EDTA，可以鰲合二價離子，抑制DNase，保護DNA。緩沖液pH常偏堿性或中性，此時核酸分子帶負電，向正極移動。⑺堿基組成與電泳溫度的影響:一般影響不大８.質(zhì)粒DNA不同構(gòu)型在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移速度：環(huán)形雙鏈DNA分子有三種構(gòu)型。第一種是共價閉合環(huán)狀DNA(coalentlyclosecircularDNA，cccDNA)，它的兩條鏈都保持完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，通常呈超螺旋構(gòu)型，遷移速度最快；第二種是開環(huán)DNA(opencircularDNA，ocDNA)，它的雙鏈中的一條保持完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，另一條單鏈上有一到幾個切口兩條核苷酸鏈中只有一條保持完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)，即OC構(gòu)型，遷移速度最慢；第三種是線狀DNA，這種質(zhì)粒的雙鏈斷裂呈線狀,通稱L構(gòu)型。這三種構(gòu)型的同一種質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠中電泳時，出現(xiàn)不同的遷移速率，走得最快的是超螺旋構(gòu)型，其次是線性構(gòu)型，最慢的是開環(huán)構(gòu)型。質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠中電泳結(jié)果出現(xiàn)：一條帶是最好的（超螺旋構(gòu)型），二或三條帶也是正常的。主要儀器設(shè)備恒溫培養(yǎng)箱37℃；恒溫搖床37℃；高壓滅菌鍋；超凈工作臺；臺式離心機；振蕩器；微量移液槍(10，20，200，1000ul)；槍頭（10，20，1000ul）及槍頭盒；離心管1.5ml及離心管架；制冰機；冰箱；干式恒溫器37℃、50℃；微波爐；電泳儀及電泳槽；紫外檢測儀。實驗試劑及其用途1、實驗材料含重組質(zhì)粒菌種2、實驗試劑⑴LB液體培養(yǎng)基⑵氨芐青霉素：100mg/ml⑶溶液Ⅰ【溶液Ⅰ：葡萄糖：增加溶液的黏度，減少抽提過程中的機械剪切作用，防止破壞質(zhì)粒DNA。EDTA：絡(luò)合掉Mg等二價離子，防止DNA酶對質(zhì)粒分子的降解作用。Tris·HCl：使溶菌液維持溶菌作用的最適pH范圍?！竣热芤孩颉救芤孩颍篠DS：解聚核蛋白并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之變性。NaOH：破壞氫鍵，使DNA分子變性。】⑸溶液Ⅲ【溶液Ⅲ：中和溶液Ⅱ的堿性，使染色體DNA復(fù)性而發(fā)生纏繞，并使質(zhì)粒DNA復(fù)性。高鹽的3mol/LNaAc或者5mol/LKAc(本實驗中所用為KAc）有利于變性的大分子核質(zhì)體DNA以及K/Na離子會與SDS形成溶解度很低的鹽并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去。】⑹酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）【酚／氯仿/異戊醇：酚:一種強烈的蛋白質(zhì)變性劑，能非常有效地去除蛋白質(zhì)，同時抑制了核酸酶的降解作用。氯仿:有強烈的溶脂傾向，可以溶解細胞膜，同時溶解去除脂質(zhì)類雜質(zhì)，此外具有使蛋白質(zhì)變性并分相的作用。異戊醇:減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。】⑺無水乙醇【乙醇或異丙醇——可以沉淀核酸，當(dāng)加入乙醇時，其會奪去核酸周圍的水分子，使其失水而易于聚合。一般用2倍體積的乙醇或1倍體積的異丙醇沉淀DNA和RNA?！竣?0%乙醇【70％的乙醇——用于洗滌核酸沉淀，其目的是去除鹽及揮發(fā)性較小的異丙醇。】⑼TE緩沖液（pH8.0）⑽RNaseA（1mg/ml）【RNaseA——用于消化質(zhì)粒DNA溶液中的殘余RNA?！竣?.5×TBE緩沖液（pH8.0）⑿瓊脂糖⒀6×加樣緩沖液⒁1mg/ml溴化乙錠（EB）五、實驗步驟（一）、細菌培養(yǎng)質(zhì)粒DNA大量擴增挑單菌落（有Amp抗性）接種于5ml含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。（二）、收集細菌,堿裂解液提取質(zhì)粒DNA，純化質(zhì)粒DNA操作：1、取1.5ml的過夜培養(yǎng)菌液加入1.5ml離心管中，8000r/min離心1min。2、棄上清液，將管倒置于吸水紙上，使液體盡可能流盡。3、將菌體沉淀加100ul溶液Ⅰ，振蕩懸浮菌體，冰浴放置5～10min。（振蕩是為了破細胞壁，故動作比較劇烈，之后步驟中的顛倒混勻需要動作比較輕柔，以免破壞了DNA的結(jié)構(gòu)）4、加200ul溶液Ⅱ，蓋緊管蓋，快速溫和顛倒離心管數(shù)次，確保離心管內(nèi)溶液混勻使之變清，冰浴５min。5、加150ul溶液Ⅲ，蓋緊管口，顛倒數(shù)次使之混勻，冰浴放置5min。6、12000r/min離心8min，將上清液轉(zhuǎn)至另一干凈離心管，加入等體積（大約為450ul）的酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），振蕩混勻，12000r/min離心8min。（離心后，中間分層出若白色物質(zhì)較多，因再加入一定量的酚氯仿混合液進行一次離心，直至中間分層處白色物質(zhì)幾乎看不見，說明蛋白質(zhì)已完全變性，防止DNA的水解酶會將質(zhì)粒DNA分解掉，以至于得不到電泳的結(jié)果）7、上清液移入另一干凈離心管中，加入2倍體積的無水乙醇，混勻后置于-20℃冰箱中20min。（核酸在2/3的乙醇中不溶，所以應(yīng)加入兩倍體積無水乙醇，可多不可少）8.12000r/min離心8min，棄上清液，將溶液管口倒置于吸水紙上，使液體盡可能流盡。9、加入1ml70﹪乙醇洗沉淀一次（動作要輕），棄70﹪乙醇溶液，將管口倒置于吸水紙上，使液體盡可能流盡，50℃干燥5min。10、將沉淀溶于50ulTE緩沖液（pH8.0，含20mg/LRNaseA）中，置37℃恒溫器中保溫30min后，取質(zhì)粒DNA樣液做瓊脂糖凝膠電泳鑒定。（三）瓊脂糖凝膠電泳1、制膠（1.0％瓊脂糖凝膠）在膠模上架好梳子。稱取1.0g瓊脂糖，置于250ml錐形瓶中，加100ml0.5×TBE電泳緩沖液，加熱熔化至無顆粒狀瓊脂糖，待其冷卻至50～60℃后，加入EB，使其終濃度為0.5mg/L，搖勻后立即倒入準備好的膠模中，待膠凝固后，放入電泳槽中，倒入適量0.5×TBE（剛好淹過膠面），拔去梳子備用。（注：EB為誘變劑、致癌物，接觸凝膠必須戴手套操作）2、加樣取6ul純化的質(zhì)粒DNA樣品，與1ul6×電泳加樣緩沖液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中（注：勿劃破或戳穿加樣孔，勿帶入氣泡）。若DNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個樣品要換槍頭以防互相污染。注意上樣時要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。3、電泳加完樣后，蓋上電泳槽蓋，立即接通電源，使電壓調(diào)到100V，恒壓電泳。當(dāng)溴酚藍條帶移動到距凝膠前緣約2cm時，停止電泳（約需30～60min）。4、觀察和拍照取出膠塊置于紫外燈下觀察，DNA存在處可顯示出肉眼可辨的橘紅色熒光帶，再用成像儀進行拍照，以便于分析。（注：紫外光對眼睛有害，觀察時戴上防護鏡或眼鏡，或隔著玻璃或有機玻璃觀察）。實驗結(jié)果及分析質(zhì)粒ＤＮＡ電泳方向點樣孔質(zhì)粒ＤＮＡ電泳方向點樣孔從結(jié)果中可以看出，只有一條區(qū)帶，說明只有一種構(gòu)型的DNA----超螺旋構(gòu)型。