二代測(cè)序技術(shù)在血液系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用淺談?wù)n件

二代測(cè)序技術(shù)

在血液系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用1精選課件SequencingtheHumanGenomeYearprice2010199720081086422010:10K$,

afewdays?2007:4541M$,3months2001:Celera100M$,3years2001:HumanGenomeProject2.7G$,11yearsTrendsinSequencingTechnology2003Sanger2008:ABISOLiD60K$,2weeks2009:Illumina,Helicos40-50K$2012:5K$,<24hrs?2015:1K$,<24hrs?20152精選課件三代測(cè)序技術(shù)1

1代測(cè)序－雙脫氧終止法（Sanger）22代測(cè)序(454,solexa,SOLiD)33代測(cè)序(單分子測(cè)序)

TrendsinSequencingTechnology3精選課件1代測(cè)序——SangerSequencing利用DNA聚合酶和雙脫氧鏈終止測(cè)定DNA核苷酸序列的方法。英國劍橋分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的生物化學(xué)家FredSanger及其同事在1997年發(fā)明的。

優(yōu)點(diǎn)片段長度(~900bps)適用于小片段

缺點(diǎn)低通量費(fèi)用高、耗時(shí)長TrendsinSequencingTechnology4精選課件二代測(cè)序，高通量測(cè)序（NextGenerationSequencing、High-throughputSequencing、DeepSequencing）:一次性對(duì)幾百萬到十億條DNA分子進(jìn)行并行測(cè)序，從而可對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行深入、細(xì)致、全貌的分析。目前主要有LifeTech的SOLiD系列、IonTorrentPGM和IonTorrentProton；Illumina的HiSeq和MiSeq序列；羅氏公司的Roche/454GSFLX和Junior。TrendsinSequencingTechnology2代測(cè)序——NextGenerationSequencing(NGS)通量高準(zhǔn)確度高分辨率高成本下降5精選課件TrendsinSequencingTechnology6精選課件HighParallelismisAchievedinPolonySequencingPolonySanger7精選課件3代測(cè)序——單分子測(cè)序：HeliScopeDNA測(cè)序時(shí)，不需要經(jīng)過PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了對(duì)每一條DNA分子的單獨(dú)測(cè)序。第三代測(cè)序技術(shù)基因組也叫從頭測(cè)序技術(shù)，即單分子實(shí)時(shí)DNA測(cè)序。第三代測(cè)序技術(shù)發(fā)明人：StephenWTurner&JonasKorlach博士基因測(cè)序技術(shù)逐漸成為臨床分子診斷中重要技術(shù)手段第三代測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用在測(cè)序、甲基化研究、突變鑒定（SNP檢測(cè)）8精選課件三代技術(shù)對(duì)比閱讀長度Readlength測(cè)序技術(shù)SequencingTechnology輸出數(shù)據(jù)Throughput(perrun)費(fèi)用Cost(1mbp)*Sanger~800bpSanger400kbp500$454~400bpPolony500Mbp60$Solexa75bpPolony20Gbp2$SOLiD75bpPolony60Gbp2$Helicos30-35bpSinglemolecule25Gbp1$*Source:Shendure&Ji,NatBiotech,20089精選課件基于NGS腫瘤研究思路10精選課件DNA水平全基因組重測(cè)序（Wholegenomesequencing）外顯子組測(cè)序（Wholeexomesequencing）RNA水平轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（Transcriptomesequencing）數(shù)字表達(dá)譜測(cè)序（Digitalexpressionprofiling）小RNA測(cè)序（SmallRNAsequencing）長鏈非編碼RNA測(cè)序（LongchainnoncodingRNAsequencing）表觀遺傳水平免疫共沉淀技術(shù)(ChromatinImmunoprecipitation，ChIP)全基因組甲基化測(cè)序（Wholegenomemethylationsequencing）簡化甲基化測(cè)序（Simplifiedmethylationsequencing）NGS幾種方法11精選課件全基因組測(cè)序繪制體細(xì)胞突變圖譜在全基因組范圍內(nèi)鑒定基因組變異信息。統(tǒng)計(jì)變異類型。篩選變異基因。注釋突變基因功能全基因組范圍12精選課件外顯子組測(cè)序捕獲外顯子區(qū)域DNA進(jìn)行進(jìn)行高通量測(cè)序統(tǒng)計(jì)變異類型篩選變異基因注釋突變基因功能1-2%基因組序列13精選課件轉(zhuǎn)錄組測(cè)序針對(duì)樣品在特定組織特定狀態(tài)下的全部mRNA進(jìn)行分析鑒定轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)變異鑒定差異表達(dá)基因變異基因及差異表達(dá)基因功能注釋14精選課件數(shù)字表達(dá)譜測(cè)序簡便快速的定量檢測(cè)疾病、不同階段和特定狀態(tài)下的組織基因表達(dá)的種類和表達(dá)水平信息。鑒定差異表達(dá)基因差異表達(dá)基因功能注釋15精選課件小RNA測(cè)序快速發(fā)掘鑒定并定量分析不同組織、不同疾病狀態(tài)下已知和潛在miRNA及其差異表達(dá)。鑒定差異表達(dá)miRNA差異表達(dá)miRNA及其靶基因功能注釋16精選課件長鏈非編碼RNA測(cè)序系統(tǒng)識(shí)別、鑒定lncRNA，比較分析不同組織間的lncRNA差異表達(dá)信息。lncRNA序列變異分析鑒定差異表達(dá)lncRNA差異表達(dá)lncRNA功能注釋17精選課件免疫共沉淀測(cè)序通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(ChIP)將獲得的數(shù)百萬條序列標(biāo)簽精確定位到基因組上，從而獲得全基因組范圍內(nèi)與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等相互作用的DNA區(qū)段信息統(tǒng)計(jì)測(cè)序數(shù)據(jù)在參考基因組peak區(qū)不同樣品差異分析差異基因功能注釋18精選課件甲基化測(cè)序DNA進(jìn)行重亞硫酸鹽處理并高通量測(cè)序,檢測(cè)所有的甲基化位點(diǎn)，繪制單堿基分辨率的DNA甲基化圖譜差異甲基化區(qū)域分析多樣品間差異甲基化分析19精選課件NGS在血液系統(tǒng)疾病中的臨床應(yīng)用

全基因組測(cè)序

（全基因組~3Billionbp）全外顯子測(cè)序

（~30Mbp）

測(cè)序限于基因組?1％的蛋白質(zhì)編碼區(qū)基因突變

髓系MyeloidAML預(yù)后指標(biāo)

–FLT3,NPM1,CEBPA,ASXL1,

IDH1/2骨髓增生異常綜合征(MDS)–凝集素及剪切基因經(jīng)常發(fā)生突變

骨髓增生性腫瘤(MPNs)–JAK2,CALR,MPL,

ASXL1

泛白血病基因淋系Lymphoid

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(BCR信號(hào)通路突變)淋巴細(xì)胞增殖性疾病(JAK-STAT信號(hào)通路突變)

泛淋巴瘤基因檢測(cè)復(fù)雜的基因組異常-拷貝數(shù)變異（CNV）和易位

先天性疾病-骨髓衰竭綜合征，先天性溶血性貧血

高度復(fù)雜的單基因分析

例如：淋巴細(xì)胞克隆性和IGH或TRG/TRB基因20精選課件NGS在血液系統(tǒng)疾病的中臨床應(yīng)用路徑AMLMDSALLMPNAPLCML患者化療靶向治療免疫治療HSCT鞏固治療診斷危險(xiǎn)度分層療效評(píng)價(jià)預(yù)后分析復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)微小殘留病檢測(cè)（MRD)診斷危險(xiǎn)度分層療效評(píng)價(jià)預(yù)后分析復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)微小殘留病檢測(cè)（MRD)輔助診斷指導(dǎo)用藥復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)21精選課件一項(xiàng)癌癥基因組圖譜研究網(wǎng)絡(luò)（TheCancerGenomeAtlasResearchNetwork，TCGA）的研究200例初診的AML患者50例全基因組測(cè)序，150例外顯子測(cè)序AML患者中平均有13個(gè)基因發(fā)生突變23基因突變較為顯著

（>5%的病例）NGS在AML中的應(yīng)用22精選課件AML基因圖譜Blood.2016January7;127(1):29–41.

23精選課件NGS在MDS中的應(yīng)用738例MDS,MDS‐MPN患者通過NGS檢測(cè)了111個(gè)癌癥相關(guān)基因，結(jié)果顯示：78%的患者至少有1種致癌基因的突變骨髓或外周血提取DNA沒有系統(tǒng)差異致癌基因突變的總數(shù)越多，結(jié)果越差24精選課件髓系腫瘤突變圖譜AML,MDS,MPN,MDS/MPNMatyniaetaletal.2015.ArchivesofPathologyandLaboratoryMedicine.25精選課件總生存率復(fù)發(fā)率Iveyetal.,NEnglJMed2016;374:422-33MRDinStandard-RiskAML有MRD的患者預(yù)后差，復(fù)發(fā)率高26精選課件Iveyetal.,NEnglJMed2016;374:422-33MRDinStandard-RiskAML有MRD攜帶FLT3-ITD的患者復(fù)發(fā)率高復(fù)發(fā)無FLT3-ITDmutations復(fù)發(fā)有FLT3-ITDmutations27精選課件Iveyetal.,NEnglJMed2016;374:422-33MRDinStandard-RiskAML有MRD攜帶DNMT3A的患者復(fù)發(fā)率低復(fù)發(fā)withoutDNMT3Amutations復(fù)發(fā)withDNMT3Amutations28精選課件NGS在T-ALL中的應(yīng)用

NGS（外顯子測(cè)序，全基因組測(cè)序或轉(zhuǎn)錄組測(cè)序）已經(jīng)鑒定出T-ALL中突變的100多個(gè)基因。只有兩個(gè)基因NOTCH1和CDKN2A/2B在超過50％的T-ALL病例中突變，其余基因以較低的頻率突變29精選課件63個(gè)基因的靶向測(cè)序（TGS）相關(guān)信號(hào)通路相關(guān)基因NOTCH信號(hào)通路NOTCH1、FBXW7NF-κB信號(hào)通路MYD88、RIPK1、DDX3X、TRAF3、TRAF2、SAMHD1、BIRC3、BRAF、EGR2、IRF4、BCOR、BTK、NFKBIE、TNFAIP3、CD79B、ITPKB、CARD11、PLCG2Wnt信號(hào)通路MED12、FUBP1、MGA、MYCDNA損傷及細(xì)胞周期相關(guān)POT1、ATM、CHEK2、DYRK1A、BRCC3、TP53表觀遺傳學(xué)相關(guān)HIST1H1B、HIST1H1E、DDX3X、ZMYM3、CHD2、EZH2、KMT2C、KMT2D、BAZ2A、TET2、CREBBP、EP300、ASXL1、IKZF3RNA和核糖體加工SF3B1、EWSR1、NXF1、XPO4、RPS15OthersFAT1、FAT3、IGLL5、MTOR、CACNA1E、BCL6、PRDM1、BCL2、PIM1、KIT、KLHL6、CXCR4、PIK3CA、SOCS1NGS在CLL臨床診療中的應(yīng)用30精選課件不同的panel針對(duì)不同的需求IG/TCR產(chǎn)品名稱檢測(cè)方法ALL（10種）NGS檢測(cè)AML-MDS-MPN（34基因）NGS檢測(cè)MPN/MDS（25種）NGS檢測(cè)髓系-large（58種）NGS檢測(cè)AML（22種）NGS檢測(cè)ABL激酶區(qū)NG