纖維素柱填料的制備及其在超氧化物歧化酶提純中的應(yīng)用

纖維素柱填料的制備及其在超氧化物歧化酶提純中的應(yīng)用朱建發(fā)肖靜左濤易威（化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院湖北武漢430072）摘要超氧化物歧化酶（SOD）是生物體內(nèi)一種重要的自由基清除劑豬血液里Cu?Zn-SOD與血紅蛋白共存于紅血球，用有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)，得到粗酶提取液，用纖維素銅氨溶液制備一種成本較低，具有高分辨性能和良好物理性能的新型尺寸排除色譜，用梯度淋洗的方法純化Cu?Zn-SOD。關(guān)鍵詞Cu?Zn-SOD尺寸排除色譜梯度淋洗介紹Cu?Zn-SOD及其分離純化Cu?Zn-SOD與血紅蛋白共存予紅血球中，它是一種重要的自由基清除劑，對(duì)生物有保護(hù)作用。這類酶的發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了自由基生物學(xué)的發(fā)展，并為人類治療多種炎癥，放射病，自身免疫疾病及抗衰老等提供了一個(gè)具有廣泛應(yīng)用前景的藥物[1]。用CHCl3-C2H5OH處理，使血紅蛋白沉淀，Cu?Zn-SOD留在水-乙醇相中，加磷酸氫二鉀可使SOD的含水乙醇相分出，鉀丙酮使SOD沉淀，極性溶劑使蛋白質(zhì)脫去水化層，降低介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)顆粒凝集沉淀。纖維素柱填料及生物高分子的分級(jí)排除色譜過去的三十年中，由于纖維素膜在膜相對(duì)較低的價(jià)格，與生物化合物較好的相容性和明顯的親水性，使得其在分離中已有了廣泛的商業(yè)用途[2，3]。尺寸排除色譜就是使高分子流過孔徑具有一定尺寸分布的色譜柱填料，分子量大的高分子尺寸較大，進(jìn)入孔隙的可能性小，流經(jīng)填料時(shí)間校短，反之，分子量小的，流經(jīng)填料時(shí)間長。此法在生物大分子的實(shí)驗(yàn)室研究和工業(yè)生產(chǎn)中得到了越來越廣泛的應(yīng)用[4，5]。采用PEG－2000和纖維素銅氨溶液共混，制得了強(qiáng)度很好的再生纖維素改性多孔膜，其孔徑是未共混得纖維素膜的4倍。纖維素共混膜在不同凝固條件下可形成多孔膜，且孔徑可通過加入的水溶性高分子的種類、分子量、含量控制，在此基礎(chǔ)上制備了系列多孔色譜柱填料。梯度洗脫法梯度洗脫的能力是逐步增加的，克服了直線洗脫中的拖尾現(xiàn)象，混合物中的各個(gè)組分逐個(gè)進(jìn)入解吸狀態(tài)，因此分辨率大大提高，形成梯度應(yīng)滿足：（1）淋洗液總體積足夠大，洗脫時(shí)間足夠長，使各峰不致丟失；（2）梯度的斜度要足夠平，使各峰分開，但又要足夠陡峭，以免峰形過寬或拖尾；（3）梯度淋洗速度要適當(dāng)，這樣可利用全柱長進(jìn)行無數(shù)次的解吸和再吸附，達(dá)到分離目的；（4）最大分辨率的梯度洗脫應(yīng)在那些對(duì)吸附和洗脫有相近親和力的大分子出現(xiàn)的區(qū)域比較平坦，而在毗鄰大分子的親和力差異較大的區(qū)域是陡峭的，通常要經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，摸索出一個(gè)合適的梯度淋洗配方來調(diào)節(jié)梯度，才能達(dá)到理想結(jié)果。實(shí)驗(yàn)部分實(shí)驗(yàn)試劑和儀器試劑:CuSO4?5H2O,20%NaOH,PEG-2000,棉短絨，4％硫酸，異丙醇，濃氨水，95％乙醇，氯仿，K2HPO4?3H2O,K2HPO4,0.9%NaCl，丙酮，10mmol/LHCl，新鮮豬血500ml，甲醛溶液。儀器：抽濾裝置，HL-2型恒流泵，BSZ-160A型部分自動(dòng)收集器，紫外可見分光光度計(jì)，玻璃色譜柱，低溫高速離心機(jī)等。纖維素柱填料的制備制備Cu（OH）2取16.5g五水硫酸銅，加蒸餾水加熱溶解至沸，停止加熱，緩緩加入25％－28％的濃氨水溶液，并攪拌冷至室溫后，用水將沉淀洗至中性，倒出清液，加水于沉淀中冰水浴條件下加l0％NaOH并攪拌，用水洗至中性，抽濾得天藍(lán)色濕Cu(OH)2。制備纖維素銅氨溶液8g纖維素置于50g濃氨水中，加入13ml水后密封杯口，置于冰箱中冷至10oC以下，將10.4g新制的Cu(OH)2加入到6.4g10％的NaOH里，攪拌均勻后倒入冷卻的纖維素銅氨溶液里，立即攪拌均勻，置于冰箱中冷卻，冷卻后加入少量水，繼續(xù)攪拌，再冷卻再攪拌，變?yōu)樗{(lán)色清亮粘稠液（Ⅰ），纖維素濃度約為8％。柱填料的制備將上步制得的纖維素銅氨溶液裝入注射器中，均勻用力，推出絲狀溶液，直接在10％NaOH溶液中凝固15min，將絲狀物轉(zhuǎn)移到4％的稀硫酸中，放置30min，得到透明均勻細(xì)絲，用水洗去酸，剪成1mm以下圓柱體，保存在20％異丙醇和2％甲醇水溶液中備用。酶的制備取新鮮豬血500ml，3000轉(zhuǎn)/min離心20min，收集紅細(xì)胞后，加入等體積0.9％NaCl溶液，充分?jǐn)嚢韬螅俅坞x心，棄上層清液（反復(fù)3次），收集洗滌的紅細(xì)胞，加蒸餾水，將燒杯置于冰浴中攪拌溶血40min以上，得血溶液。往血溶液中緩慢加入在4oC下預(yù)冷過的95％C2H5OH（0.25倍體積），然后緩緩加入在4oC下預(yù)冷過的CHCl3（0.15倍體積），攪拌，室溫下3000轉(zhuǎn)/min離心20min，棄去沉淀（血紅蛋白），收集上層清液約，即粗酶提取液。往上述溶液中加K2HPO4?3H2O(按43gK2HPO4?3H2O/100ml)，分液，收集上層乙醇－氯仿相，室溫下離心（3500轉(zhuǎn)/min）25min棄去沉淀，得上層清液.向上一步所得清液中加（0.75倍）在4oC下預(yù)冷過的丙酮，使Cu?Zn-SOD沉淀下來，室溫下3500轉(zhuǎn)/min離心20min收集灰白沉淀物，將其溶于少量蒸餾水中，4oC下，在2.5mmol/L(Ph=7.6)的磷酸鉀緩沖溶液中透析每30min換一次透析液，共換4－5次，透析內(nèi)液出現(xiàn)沉淀，在室溫下3500轉(zhuǎn)/min離心，棄去沉淀，收集上層清液。纖維素柱層析：將填料裝入色譜柱使填料均勻，無氣泡。裝好后，填料上步用濾紙片覆蓋，填料頂部保持平整。用2.5mmol/L緩沖液作柱層析平衡液，進(jìn)行梯度洗脫。洗脫方法：用滴管將粗酶制劑沿柱內(nèi)壁加到纖維素柱表面，慢慢放松活塞，使樣品液面降到柱表面，再加少許洗脫液洗滌柱壁，反復(fù)兩次。梯度洗脫裝置圖:A—儲(chǔ)液瓶；B－混合瓶；C－電磁攪拌器；D，E－活塞；F－攪拌磁子；G－色譜柱；H－BSZ-160型部分自動(dòng)收集器；I－HL_2型恒流泵洗脫前，開動(dòng)攪拌器，打開活塞D、E，B中濃度線性遞增；關(guān)閉活塞D、E，在A中加200mmol/L、Ph=7.6的磷酸鉀緩沖溶液100ml,B中加2.5mmol/LpH＝7.6緩沖溶液100ml，打開活塞D、E，用恒流泵控制流速40ml/h,用自動(dòng)部分收集器收集流出液，每管4ml，共30管。以蒸餾水為參比，在280nm處用紫外吸收法測(cè)每管的吸光度，繪制淋洗曲線。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制出的淋洗曲線如下圖所示：四、討論關(guān)于纖維素柱填料：從纖維素銅氨溶液制備的柱填料強(qiáng)度高、尺寸穩(wěn)定性好、分辨率高，但孔徑太小，分級(jí)范圍窄，使用受到限制，用PEG－2000和纖維素銅氨溶液共混，制得強(qiáng)度好的再生性纖維素改性多孔膜，其孔徑是未共混的4倍，但共混時(shí)難混均勻，液體與粘稠物兩相分離，不易制得均勻的絲狀物。關(guān)于酶的制備：Cu?Zn-SOD與血紅蛋白共存與紅血球，通過離心，可除去血清，收集紅細(xì)胞，用極性有機(jī)溶劑使蛋白質(zhì)脫去水化層并降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間相互作用，致使蛋白質(zhì)顆粒凝集而沉淀，此法要求低溫操作，并盡量縮短處理時(shí)間，避免蛋白質(zhì)變性。Cu?Zn-SOD的pI=4.95，在Ph=7.6的條件下帶負(fù)電，通過纖維素陰離子交換柱可進(jìn)一步純化。關(guān)于梯度淋洗：洗脫的梯度在柱層析中是首要因素，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)計(jì)各種方法，常用的梯度混合器由兩個(gè)容器構(gòu)成，二者體積相等，放在同一水平臺(tái)上，一個(gè)盛起始淋洗液，另一個(gè)盛上限淋洗液，兩者用管連通，淋洗液從第一個(gè)容器流入柱時(shí)，第二個(gè)容器中的淋洗液自動(dòng)補(bǔ)足，使上限淋洗液濃度線性增加，改變梯度容器的相對(duì)大小和形狀可產(chǎn)生凹形或凸形梯度，形成梯度應(yīng)滿足：淋洗總體積足夠大；梯度的斜度足夠平緩，使各峰分開；又要足夠陡峭，以免峰變寬或拖尾；梯度升降速度要合適；要反復(fù)實(shí)驗(yàn)，摸索出合適的梯度洗脫配方來調(diào)節(jié)梯度。參考文獻(xiàn)[1]余瑞元等.北京鴨紅細(xì)胞超氧化物歧化酶－分離純化和性質(zhì).北京大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1990，26（4）：475[2]GYang,LZhang.JMembranceSci,1996(114):149~155[3]GYang,LZhang,XXiong,etal.Chin