生化分離工程課件

2005-3-211

萃取分離基本概念2.1有機(jī)溶劑萃取2.2雙水相萃取2.3反膠團(tuán)萃取2.4超臨界流體萃取2005-3-212基本概念萃取extraction

是利用液體或超臨界流體為溶劑提取原料中目標(biāo)產(chǎn)物的分離純化操作。萃取劑extractant

萃取分離中的流體。有機(jī)溶劑萃取organicsolventextraction，簡(jiǎn)稱溶劑萃取solventextraction液固萃取或浸取leaching超臨界流體萃取supercriticalfluidextraction雙水相萃取aqueoustwo-phaseextraction反膠團(tuán)萃取reversedmicelleextraction液膜萃取2005-3-213基本概念反萃取

backextraction

為進(jìn)一步純化目標(biāo)產(chǎn)物，在溶劑萃取分離過(guò)程中，調(diào)節(jié)水相條件，將目標(biāo)產(chǎn)物從有機(jī)相轉(zhuǎn)入水相的萃取操作。物理萃取溶質(zhì)根據(jù)相似相溶的原理在兩相間達(dá)到分配平衡而進(jìn)行萃取的分離過(guò)程?；瘜W(xué)萃取利用脂溶性萃取劑與溶質(zhì)之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成脂溶性複合分子實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)向有機(jī)相分配的過(guò)程。萃取劑與溶質(zhì)之間的化學(xué)反應(yīng)包括離子交換和絡(luò)合反應(yīng)等?；瘜W(xué)萃取中通常用煤油、己烷、四氯化碳和苯等有機(jī)溶劑溶解萃取劑，改善萃取相的物理性質(zhì)，此時(shí)的有機(jī)溶劑稱為稀釋劑diluent。2005-3-2142.1溶劑萃取分配定律在溶劑萃取過(guò)程中，將供提取的溶液稱為料液；從料液中待提取的物質(zhì)稱為溶質(zhì)；用來(lái)萃取目的產(chǎn)物的溶劑稱為萃取劑；溶質(zhì)轉(zhuǎn)移到萃取劑中與萃取劑形成的溶液稱為萃取液；被萃取出溶質(zhì)後的料液稱萃餘液。平衡時(shí)溶質(zhì)在兩相中的濃度之比為一常數(shù)K，即：K＝萃取相濃度/萃餘相濃度＝

c1／c2(2-1)常溫下K為常數(shù)，c的單位通常用mol/L或U/ml。式(2-1)應(yīng)用條件：(1)稀溶液；(2)溶質(zhì)對(duì)溶劑之互溶度沒(méi)有影響；(3)必須是同一種分子類型，即不發(fā)生締合或離解。2005-3-215弱酸或弱鹼性溶質(zhì)還要考慮弱電解質(zhì)在水相中的電離平衡。如penicillin是一類弱酸，在水中會(huì)有一部分離解成負(fù)離子(P·COO－)，在萃取相乙酸丁酯等有機(jī)相中則僅以游離酸分子(P·COOH)的形態(tài)存在。兩相中的游離酸分子的分配平衡用分配係數(shù)K0表徵電離平衡用電離常數(shù)KP來(lái)表徵。圖2-1青黴素的分配平衡與電離平衡

2005-3-216K0和KP是客觀存在的，但一般測(cè)定得到的是[P·COOH＋P·COO－]的總濃度c2，在這種情況下，c1／c2＝K這裏的K稱之為表觀分配係數(shù)。而K和K0、KP的關(guān)係式可經(jīng)理論推導(dǎo)如下：

K＝K0[H＋]／(Kp＋[H＋])(弱酸)(2-2)

K＝K0Kp／(Kp＋[H＋])(弱鹼)(2-3)由此可見(jiàn)，溶質(zhì)在不互溶兩相中的分配不僅與本身的性質(zhì)(決定KP)、萃取溶劑(決定K0)有關(guān)，也與水相的pH有關(guān)。2005-3-217分離因數(shù)若原來(lái)的料液中除溶質(zhì)A以外，還含有溶質(zhì)B，則由於A、B的分配係數(shù)不同，A和B就得到了一定程度的分離。如A的分配係數(shù)較B大，這樣萃取劑對(duì)溶質(zhì)A和B分離能力的大小可用分離因數(shù)β來(lái)表徵：β＝(c1A/c1B)／(c2A/c2B)＝(c1A/c2A)／(c1B/c2B)＝KA／KB(2-4)下標(biāo)1、2分別代表萃取相和萃餘相，A、B為溶質(zhì)如果A是產(chǎn)物，B為雜質(zhì)，分離因數(shù)可寫為：β＝K產(chǎn)／K雜β越大，A、B的分離效果越好，即產(chǎn)物與雜質(zhì)越容易分離。2005-3-218水相條件的影響由於產(chǎn)物所在的水相中往往還存在與產(chǎn)物性質(zhì)相近的雜質(zhì)、未完全利用的底物、無(wú)機(jī)鹽、其他營(yíng)養(yǎng)成分等。必須考慮這些物質(zhì)對(duì)萃取過(guò)程的影響。(1)pH值根據(jù)式(2-2)、(2-3)可見(jiàn)，pH值直接影響表觀分配係數(shù)。pH除影響K外，還可能對(duì)選擇性有影響。如青黴素在pH2萃取時(shí)，乙酸丁酯萃取液中青黴烯酸可達(dá)青黴素含量的12.5％，而在pH3的條件下萃取，則可降低至4％。另外，pH值還應(yīng)儘量選擇在使產(chǎn)物穩(wěn)定的範(fàn)圍內(nèi)。2005-3-219(2)溫度溫度會(huì)影響生化物質(zhì)的穩(wěn)定性。影響分配係數(shù)K。(3)鹽析無(wú)機(jī)鹽類如硫酸銨、氯化鈉等一般可降低產(chǎn)物在水中的溶解度而使其更易於轉(zhuǎn)入有機(jī)溶劑相中，另一方面還能減小有機(jī)溶劑在水相中的溶解度。如提取維生素B12時(shí)，加入硫銨，可促使維生素B12自水相轉(zhuǎn)移到有機(jī)相中；提取青黴素時(shí)加入NaCl，也有利於青黴素從水相轉(zhuǎn)移到有機(jī)溶劑相中。2005-3-2110(4)帶溶劑為提高分配係數(shù)K，常添加帶溶劑。帶溶劑是指能和產(chǎn)物形成複合物，促使產(chǎn)物更易溶於有機(jī)溶劑相中，在一定條件下又要容易分解的物質(zhì)。青黴素作為一種酸，可用脂肪堿作為帶溶劑。青黴素能和正十二烷胺、四丁胺等形成複合物而溶於氯仿中。這樣萃取收率能夠提高，且可以在較有利的pH範(fàn)圍內(nèi)操作。這種正負(fù)離子結(jié)合成對(duì)的萃取，也稱為離子對(duì)萃取。檸檬酸在酸性條件下，可與磷氧鍵類萃取劑如磷酸三丁酯(TBP)形成中性絡(luò)合物而進(jìn)入有機(jī)相(C6H8O7·3TBP·2H2O)，這種形成絡(luò)合物的萃取稱為反應(yīng)萃取。2005-3-2111萃取方式和理論收得率工業(yè)上萃取操作通常包括三個(gè)步驟：混合—分離—溶劑回收因而工業(yè)萃取的流程中須有混合器(如攪拌混合器)、分離器(如碟片式離心機(jī))和溶劑回收裝置(如蒸餾塔)?；旌陷腿『头蛛x也可在同一臺(tái)設(shè)備內(nèi)完成。一般萃取過(guò)程很快，如果接觸表面足夠大，則在15~60s之內(nèi)就可完成。萃取操作流程可分為單級(jí)萃取和多級(jí)萃取。2005-3-2112單級(jí)萃取如圖2-2所示。

圖2-2單級(jí)萃取流程圖

2005-3-2113萃取操作理論收得率的計(jì)算須符合以下兩個(gè)假定：①萃取相和萃餘相很快達(dá)到平衡②兩相完全不互溶，在分離器中能完全分離。設(shè)K為分配係數(shù)，VF為料液體積，VS為萃取劑體積，E為萃取因數(shù)(extractionfactor)即萃取平衡後，溶質(zhì)在萃取相與萃餘相中品質(zhì)的比值，則：E＝K·VS／VF＝K／m(2-5)式中m＝VF／VS＝料液體積／萃取劑體積令未被萃取的體積分?jǐn)?shù)為φ，則：φ＝1／(E＋1)(2-6)而理論收得率為：1－φ＝E／(E＋1)(2-7)2005-3-2114多級(jí)萃取為提高收率常常採(cǎi)用多級(jí)萃取，多級(jí)萃取又有多級(jí)逆流萃取和多級(jí)錯(cuò)流萃取流程，如圖2-3和圖2-4所示。圖2-3多級(jí)錯(cuò)流萃取流程圖2-4多級(jí)逆流萃取流程

2005-3-2115由理論推導(dǎo)，經(jīng)n級(jí)萃取後，兩種多級(jí)萃取流程的產(chǎn)物收率分別為：多級(jí)錯(cuò)流萃取流程：1－φ＝1－[1／(E1＋1)(E2＋1)…(En＋1)](2-8)多級(jí)逆流萃取流程：1－φ＝(En＋1－E)／(En＋1－1)(2-9)圖2-5三級(jí)逆流萃取設(shè)備流程2005-3-2116例1：赤黴素在10℃、pH值2.5時(shí)的分配係數(shù)(乙酸乙酯／水)為35，用等體積乙酸乙酯單級(jí)萃取一次問(wèn)理論收得率為多少？解1：E＝35×1／1＝35理論收得率1－φ＝35／(35＋1)＝97.2％例2：赤黴素二級(jí)錯(cuò)流萃取時(shí)，第一級(jí)用1/2體積乙酸乙酯，第二級(jí)用1/10體積乙酸乙酯，問(wèn)理論收得率為多少？解2：E1＝35／2＝17.5E2＝35／10＝3.5理論收得率1－φ＝1－1／[(17.5＋1)×(35＋1)]＝98.79％2005-3-2117多級(jí)錯(cuò)流萃取由於溶劑分別加入各級(jí)萃取器，故萃取推動(dòng)力較大，萃取效果較好。缺點(diǎn)是需加入大量的溶劑，因而產(chǎn)品濃度稀，需消耗較多的能量回收溶劑。

例3：赤黴素進(jìn)行二級(jí)逆流萃取，乙酸乙酯用量為1/2體積，問(wèn)理論收得率為多少？解3：E＝35／2＝17.5n＝2理論收得率1－φ＝[17.53－17.5]／[17.53－1]＝99.7％由上可見(jiàn)三種萃取過(guò)程中，以逆流萃取收率最高，溶劑用量最少。因而也是工業(yè)上普遍採(cǎi)用的流程。2005-3-21185.2雙水相萃取

過(guò)濾和離心依賴於被分離顆粒的尺寸或密度的差異，當(dāng)希望收集微生物的細(xì)胞器、分離去除細(xì)胞碎片、提取和濃縮胞內(nèi)物質(zhì)時(shí)，普通的過(guò)濾和離心技術(shù)就顯得力不從心了。溶劑萃取法難於應(yīng)用於蛋白質(zhì)分離。值得注意的是溶液的分相不一定完全依賴於有機(jī)溶劑，在一定條件下，水相也可以形成兩相甚至多相。於是有可能將水溶性的酶、蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)從一個(gè)水相轉(zhuǎn)移到另一水相中，從而完成分離任務(wù)。2005-3-21191896年Beijerinck觀察到當(dāng)把明膠與瓊脂或把明膠和可溶性澱粉的水溶液混合時(shí)，先得到一混濁不透明的溶液，隨後分成兩相，上相含有大部分明膠，下相含有大部分瓊脂(或可溶性澱粉)。再如圖2-6中，2.2％的葡聚糖水溶液與等體積的0.72％甲基纖維素鈉的水溶液相混合並靜置後，可得到兩個(gè)粘稠的液層。圖2-6葡聚糖與甲基纖維素鈉的雙水相體系

2005-3-2120上述現(xiàn)象稱為聚合物的不相溶性(incompatibility)。如果多種不相溶的聚合物混在一起，就可得到多相體系，如硫酸葡聚糖、葡聚糖、羥丙基葡聚糖和聚乙二醇相混時(shí)，可形成四相體系。聚合物的不相溶性主要是由於聚合物分子的空間阻礙作用，相互間無(wú)法滲透，當(dāng)聚合物的濃度達(dá)到一定值時(shí)，就不能形成單一的水相，所以具有強(qiáng)烈的相分離傾向。某些聚合物的溶液與某些無(wú)機(jī)鹽的溶液相混合時(shí)，只要濃度達(dá)到一定值，也會(huì)形成兩相，即聚合物-鹽雙水相體系，成相機(jī)理尚不清楚，一種解釋為“鹽析”作用。2005-3-2121某些親水性高分子聚合物的水溶液超過(guò)一定濃度後可形成兩相，並且在兩相中水分均占很大比例，即形成雙水相系統(tǒng)(twoaqueousphasesystem)。利用親水性高分子聚合物的水溶液可形成雙水相的性質(zhì)，Albertsson於50年代後期開(kāi)發(fā)了雙水相萃取法(twoaqueousphaseextraction)，又稱雙水相分配法(twoaqueousphasepartitioning)。70年代以後，Kula，Hustedt和Johansson等發(fā)展了雙水相萃取技術(shù)在生物分離過(guò)程中的應(yīng)用，為蛋白質(zhì)特別是胞內(nèi)蛋白質(zhì)的分離與純化開(kāi)闢了新的途徑。現(xiàn)在的研究已涉及到酶、核酸、生長(zhǎng)激素、病毒等各種物質(zhì)的分離和提純。2005-3-21222.2.1雙水相分離理論

雙水相體系廣泛應(yīng)用的雙水相體系是聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dex)體系。聚合物與無(wú)機(jī)鹽的混合溶液，例如，PEG/磷酸鉀、PEG/磷酸銨、PEG/硫酸鈉等常用於生物產(chǎn)物的雙水相萃取。分離某一生物大分子，兩相系統(tǒng)的選擇原則，必須有利於目的物的萃取和分離，同時(shí)又要兼顧到聚合物的物理性質(zhì)。如甲基纖維素和聚乙烯醇，因其粘度太高而限制了它們的應(yīng)用。PEG和Dex因其無(wú)毒性和良好的可調(diào)性而得到廣泛應(yīng)用。

2005-3-2123相圖

雙水相的形成條件和定量關(guān)係常用相圖表示，圖2-7是PEG／Dex體系的相圖。TCB稱為雙節(jié)線(binodal)，雙節(jié)線以上的區(qū)域?yàn)閮上鄥^(qū)。上相組成用T(Top)表示，下相組成用B(Bottom)表示。連接T、B兩點(diǎn)的線段TB稱為系線(tieline)，系線上各點(diǎn)處系統(tǒng)的總濃度不同，但均分成組成相同而體積不同的兩相。兩相的體積近似服從杠桿規(guī)則。圖2-7PEG／Dex體系相圖2005-3-2124如點(diǎn)M為整個(gè)系統(tǒng)的組成，該系統(tǒng)實(shí)際上由T、B所代表的兩相組成，vT表示上相體積，vB表示下相體積，則：vT／vB＝BM／MT(2-10)系線的長(zhǎng)度是衡量?jī)上嚅g相對(duì)差別的尺度，系線越長(zhǎng)，兩相間的性質(zhì)差別越大。當(dāng)點(diǎn)M向下移動(dòng)時(shí)，系線長(zhǎng)度縮短，兩相差別減小，到達(dá)C點(diǎn)時(shí)，系線長(zhǎng)度為0，兩相間差別消失而成為一相，因此C點(diǎn)為系統(tǒng)臨界點(diǎn)(criticalpoint)。雙節(jié)線的位置和形狀與聚合物的相對(duì)分子品質(zhì)有關(guān)。聚合物Dex的相對(duì)分子品質(zhì)越高，相分離所需的濃度越低；兩種聚合物相對(duì)分子品質(zhì)相差越大，雙節(jié)線的形狀越不對(duì)稱，見(jiàn)圖2-8。2005-3-2125PEG的相對(duì)分子品質(zhì)固定(PEG6000)而Dex的相對(duì)分子品質(zhì)如下：1.D5(Mn2800，Mr3400)2.D17(Mn23000，Mr30000)3.D24(Mn23000)4.D37(Mn88000，Mr179000)5.D43(Mn180000，Mr460000)6.D170(Mn630000，Mr2200000)Mn—數(shù)均分子量Mr—重均分子量圖2-8PEG／Dex體系的雙節(jié)線和臨界點(diǎn)2005-3-2126物質(zhì)在兩相中的分配和溶劑萃取法一樣，物質(zhì)在兩水相中的分配用分配係數(shù)K表示。K＝cT／cB

式中cT、cB分別代表上相、下相中溶質(zhì)的濃度。K與溫度、壓力以及溶質(zhì)和溶劑的性質(zhì)有關(guān)，與溶質(zhì)的濃度無(wú)關(guān)。影響分配係數(shù)的主要因素，可用Gerson公式表示：－lgK＝AΔγ＋δΔφ＋β(2-11)式中A——表面積；Δγ——兩相表面自由能之差δ——電荷數(shù)；Δφ——電位差；β——標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)位和活度係數(shù)等組成的常數(shù)2005-3-2127表面自由能可用來(lái)量度表面的相對(duì)憎水性，改變成相聚合物的種類。聚合物的平均分子量和相對(duì)分子品質(zhì)分佈，都能影響相的疏水性。一般地，大分子的表面積A都很大，Δγ的微小變化都會(huì)引起蛋白質(zhì)大分子的分配係數(shù)產(chǎn)生很大變化；加入系統(tǒng)的鹽，以及體系的pH會(huì)影響相間電位差Δφ和蛋白質(zhì)所帶的電荷數(shù)δ，因而也對(duì)分配係數(shù)產(chǎn)生大的影響。由於影響分配係數(shù)的因素很多，加上各因素間又互相影響，因此定量地將蛋白質(zhì)的一些分子性質(zhì)與分配係數(shù)關(guān)聯(lián)起來(lái)是困難的，最佳的雙水相操作條件還得依靠實(shí)驗(yàn)來(lái)獲得。2005-3-21282.2.2影響分配平衡的參數(shù)

影響物質(zhì)分配的因素主要有：聚合物及成相鹽的種類及濃度聚合物的平均分子量體系的pH值及其他鹽的種類及濃度菌體或細(xì)胞的種類及含量、體系溫度等。2005-3-2129聚合物及其分子量的影響

不同聚合物，水相系統(tǒng)顯示不同的疏水性，水溶液中聚合物的疏水性依下列次序遞增：葡萄糖硫酸鹽＜甲基葡萄糖＜葡萄糖＜羥丙基葡聚糖＜甲基纖維素＜聚乙烯醇＜聚乙二醇＜聚丙三醇，這種疏水性的差別對(duì)目的產(chǎn)物與相的相互作用是重要的。同一聚合物的疏水性隨分子量增加而增加，其大小的選擇依賴於萃取過(guò)程的目的方向，若想在上相獲得較高的蛋白質(zhì)收率，對(duì)於PEG/鹽系統(tǒng)，應(yīng)降低PEG聚合物的平均分子量，相反，若想在下相獲得較高的蛋白質(zhì)收率則平均分子量應(yīng)增加。2005-3-2130雙水相萃取糖化酶的結(jié)果(見(jiàn)表5-4)表明，PEG平均分子量增大，分配係數(shù)減少。當(dāng)分子量為400時(shí)，K＞1，酶主要分佈於上相，當(dāng)分子量大於400時(shí)，K＜1，酶主要分佈於下相。主要原因是隨著PEG分子量的增大，其端基數(shù)目減小，因而疏水性增加，使糖化酶在上相的表面張力增大，而使λ＜0，從而轉(zhuǎn)入下相，為了使酶分佈於上相，應(yīng)選用分子量為400的PEG。表2-1PEG平均分子量對(duì)分配平衡的影響系統(tǒng)K相體積產(chǎn)率％PEG400(31.36％)—(NH4)2SO4(14.05％)6.284.7596.8PEG1000(21.77％)—(NH4)2SO4(12.76％)0.263.043.5PEG4000(12.67％)—(NH4)2SO4(12.14％)0.304.159.8PEG6000(15.76％)—(NH4)2SO4(12.34％)0.031.22.12005-3-2131在PEG/Dex雙水相系統(tǒng)中，PEG分子量的減少，會(huì)使蛋白質(zhì)的K值明顯增大，如圖5-13。Dex水解程度的不同，對(duì)K值也有一定的影響。

○普魯蘭酶(12％PEG，1％DexT500，100mmol／LNa3PO4，pH7.5)□1,4-α-葡聚糖磷酸酶(9.3％PEG，7％DexT500，50mmol／LNa3PO4，pH7.8)●亮氨醯基-tRNA合成酶9.2％PEG，6.3％DexT500，73mmol／LNa3PO4，pH7.8)圖2-9PEG平均分子量對(duì)分配率的影響2005-3-2132系線長(zhǎng)度對(duì)分配平衡的影響相圖中系線長(zhǎng)度由組成的總濃度決定，在臨界點(diǎn)附近，系線長(zhǎng)度趨向於零，上相和下相的組成相同，因此，分配係數(shù)應(yīng)該是1，隨著聚合物和成相鹽濃度增大，系線長(zhǎng)度增加，上相和下相相對(duì)組成的差別就增大，產(chǎn)物如酶在兩相中的表面張力差別也增大，這將會(huì)極大地影響分配係數(shù)，使酶富集於上相。仍以PEG—(NH4)2SO4系統(tǒng)雙水相萃取糖化酶為例，增加PEG400的濃度有利於酶在上相的分配，當(dāng)PEG400濃度在25％～27％時(shí)，分配係數(shù)高達(dá)47.3，濃度過(guò)高則不利於酶的分配；在PEG400濃度固定為26％時(shí)，增加(NH4)2SO4的濃度，糖化酶的分配係數(shù)也增大，這主要是由於(NH4)2SO4鹽析作用影響增強(qiáng)的緣故，最適濃度為16％，過(guò)高也不好，酶蛋白會(huì)因鹽析作用過(guò)強(qiáng)而產(chǎn)生沉澱。

2005-3-2133體系中無(wú)機(jī)鹽離子的影響在PEG/Dex中，無(wú)機(jī)鹽離子在兩相中也有不同的分配(見(jiàn)表2-2)，因此在兩相間形成電位差。由於各相要保持電中性，這對(duì)帶電生物大分子，如蛋白質(zhì)和核酸等的分配，產(chǎn)生很大的影響。表2-2一些無(wú)機(jī)離子的分配係數(shù)正離子分配係數(shù)K＋

負(fù)離子分配係數(shù)K－K＋0.824I－1.42Na＋0.889Br－1.21NH4＋0.92Cl－1.12Li＋0.996F－0.9122005-3-2134在體系中加入適當(dāng)?shù)柠}類，會(huì)大大促進(jìn)帶相反電荷的兩種蛋白質(zhì)的分離。當(dāng)pH6.9時(shí)，溶菌酶帶正電，卵蛋白帶負(fù)電。在PEG/Dex體系中加入NaCl，產(chǎn)生電位差，上相電位小於下相電位，導(dǎo)致帶正電荷的溶菌酶大量遷移到上相，其K值增大，而帶負(fù)電荷的卵蛋白遷移到下相，從而使溶菌酶和卵蛋白得以較好地分離。圖2-10加入NaCl對(duì)卵蛋白和溶菌酶分配的影響相系統(tǒng)：8％Dex500；8％PEG4000，0.5mmol／LNa3PO4；pH6.92005-3-2135體系pH的影響pH會(huì)影響蛋白質(zhì)中可離解基團(tuán)的離解度，因而改變蛋白質(zhì)所帶電荷和分配係數(shù)；另外，pH還影響系統(tǒng)緩衝物質(zhì)磷酸鹽的離解程度，從而影響分配係數(shù)。pH微小的變化有時(shí)會(huì)使蛋白質(zhì)的K改變2～3個(gè)數(shù)量級(jí)。對(duì)一種特定的蛋白質(zhì)，在不同鹽系統(tǒng)中，pH和其分配係數(shù)之間的關(guān)係應(yīng)不同，而在等電點(diǎn)時(shí)，得到的均為不帶電時(shí)分子的分配係數(shù)。對(duì)不同的鹽系統(tǒng)，其等電點(diǎn)時(shí)的分配係數(shù)應(yīng)相等，兩條pH和分配係數(shù)關(guān)係的曲線必交於一點(diǎn)，該點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的pH值即為該特定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。根據(jù)這一原則測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的方法，稱為交錯(cuò)分配法(Crosspartitioning)，如圖2-11所示。2005-3-2136圖2-11血清蛋白在兩種鹽系統(tǒng)中分配係數(shù)K與pH的關(guān)係(交錯(cuò)分配)2005-3-2137體系溫度的影響溫度影響相圖，同時(shí)影響分配率和蛋白質(zhì)的生物活性。一般地，臨界點(diǎn)附近，溫度對(duì)分配率的影響較大，遠(yuǎn)離臨界點(diǎn)時(shí)，影響較小。在考慮溫度對(duì)分配率的影響時(shí)，必須考慮到過(guò)程的冷量消耗和分離過(guò)程中蛋白質(zhì)的停留時(shí)間。由於親水聚合物的多元醇或多糖結(jié)構(gòu)保護(hù)了蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)在雙水相中的穩(wěn)定性增加，所以一般都可在室溫下操作。從省掉冷卻系統(tǒng)的室溫操作過(guò)程中各相前後溫度的變化可知，分離後上、下相的溫度上升不多，說(shuō)明無(wú)冷卻系統(tǒng)的室溫操作是可行的。2005-3-21382.2.3雙水相萃取技術(shù)的應(yīng)用

雙水相萃取技術(shù)目前較多地應(yīng)用於胞內(nèi)酶的提取和精製上。用雙水相萃取技術(shù)處理細(xì)胞勻漿液，既可方便地除去細(xì)胞碎片，還可使酶得到精製。要成功地運(yùn)用雙水相萃取方法，應(yīng)滿足下列條件①欲提取的酶和細(xì)胞碎片應(yīng)分配在不同的相中；②酶的分配係數(shù)應(yīng)足夠大，使在一定的相體積比時(shí)一次萃取，就能得到較高的收率；③兩相用離心機(jī)很容易分離。2005-3-2139在雙水相體系中，通常將目的蛋白質(zhì)分配在上相(PEG)，而細(xì)胞碎片分配在下相(鹽)。表5-6中蛋白質(zhì)在多數(shù)情況下收率能達(dá)到90％；分配係數(shù)K在2～20之間，一般能大於3；很多雜蛋白也能同時(shí)除去。PEG／鹽系統(tǒng)應(yīng)用得很廣泛，主要由於PEG價(jià)格低廉以及該系統(tǒng)選擇性。萃取操作時(shí)單位重量相系統(tǒng)中勻漿液的加入量一般每1kg萃取相系統(tǒng)以處理200～400g濕菌體為宜。使用PEG／鹽系統(tǒng)提取胞內(nèi)酶時(shí)，使細(xì)胞碎片分配到下相中是比較容易的，如用18%的PEG1550、7％磷酸鉀系統(tǒng)處理20％濕細(xì)胞碎片時(shí)，細(xì)胞碎片能全部轉(zhuǎn)入下相(鹽相)。2005-3-2140圖2-12三步萃取流程示意圖2005-3-2141分配在上相中的蛋白質(zhì)可通過(guò)加入適量的鹽(有時(shí)也補(bǔ)充適量的PEG)，進(jìn)行第二次雙水相萃取，目的是除去核酸和多糖，它們的親水性較強(qiáng)，因而易分配在鹽相中，蛋白質(zhì)就停留在上相PEG中在第三次萃取中，應(yīng)使蛋白質(zhì)分配在鹽相(如調(diào)節(jié)pH)，以便和主體PEG分離，色素因其憎水性而通常分配在上相；鹽相中的蛋白質(zhì)可用超濾法棄除殘餘的PEG，主體PEG可迴圈使用。雙水相萃取法另一優(yōu)點(diǎn)為易於放大，分配係數(shù)K值重複性好，故可直接放大。下麵以甲酸脫氫酶(FDH)的分步提取和純化來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明雙水相在胞內(nèi)酶提取中的應(yīng)用。2005-3-2142

圖2-13連續(xù)萃取流程示意圖2005-3-21432.2.4雙水相萃取技術(shù)的進(jìn)展進(jìn)一步提高目的蛋白的純度

目的物還含有少量的核酸和多糖，進(jìn)一步提高目的蛋白的純度，可從雙水相體系和萃取操作方式兩方面進(jìn)行改進(jìn)。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的PEG衍生物。如在PEG上引入親和基團(tuán)或離子基團(tuán)：(CH3)3N＋-PEG-N＋(CH3)3，ConA-PEG-ConA等。目的蛋白的得率和純度都有很大的提高?？蓲?cǎi)用多級(jí)萃取。2005-3-2144廉價(jià)雙水相體系的開(kāi)發(fā)生物工程中得到應(yīng)用的兩種雙水相體系，即高聚物／高聚物和高聚物/鹽體系。兩種體系比較見(jiàn)表2-3。表2-3兩種雙水相體系的比較體系優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)PEG/dextran鹽濃度低，活性損失小價(jià)格貴，粘度大，分相困難PEG/鹽成本低、粘度小鹽濃度高，活性損失大，介面吸附多從表可見(jiàn)，高聚物/高聚物體系對(duì)活性物質(zhì)變性作用小，介面吸附少，但價(jià)格高。因而尋找廉價(jià)的高聚物/高聚物雙水相體系是雙水相萃取技術(shù)應(yīng)用的一個(gè)重要發(fā)展方向。2005-3-2145目前比較成功的是用變性澱粉PPT（hydroxypropylderivativeofstarch）代替昂貴的Dextran。PPT/PEG體系比PEG/鹽體系穩(wěn)定。和PEG/dextran體系相圖非常相似：①蛋白質(zhì)溶解度大。蛋白質(zhì)在PPT濃度到15％以前沒(méi)有沉澱，而在PEG濃度大於5％時(shí)，溶解度顯著地減小。②粘度小。PPT的動(dòng)力粘度只是粗Dextran的1/2，因而可以大大改善傳質(zhì)效果。③價(jià)格便宜。2005-3-2146雙水相萃取技術(shù)同其他分離技術(shù)結(jié)合①雙水相體系同生物轉(zhuǎn)化相結(jié)合將雙水相萃取同生物轉(zhuǎn)化結(jié)合在一起，可解決在許多生物轉(zhuǎn)化中存在的兩個(gè)問(wèn)題：一是由於雙水相體系對(duì)菌體及酶沒(méi)有毒性，同時(shí)又可將產(chǎn)物萃入上相，所以可消除產(chǎn)物抑制效應(yīng)；二是使分佈在下相的細(xì)胞(酶)迴圈使用，從而為固定化細(xì)胞及酶的應(yīng)用開(kāi)闢了新路。②雙水相萃取同膜分離技術(shù)結(jié)合可解決雙水相體系容易乳化和生物大分子在兩相介面的吸附等問(wèn)題並能加快萃取速率。2005-3-2847

反膠團(tuán)萃取

反膠團(tuán)（reversedmicelles）是兩性表面活性劑在非極性有機(jī)溶劑中親水性基團(tuán)自發(fā)地向內(nèi)聚集而成的，內(nèi)含微小水滴的，空間尺度僅為納米級(jí)的集合型膠體。是一種自我組織和排列而成的，並具熱力學(xué)穩(wěn)定的有序構(gòu)造。2005-3-2848反膠團(tuán)的微小介面和微小水相具有兩個(gè)特異性功能：①具有分子識(shí)別並允許選擇性透過(guò)的半透膜的功能；②在疏水性環(huán)境中具有使親水性大分子如蛋白質(zhì)等保持活性的功能。因此，反膠團(tuán)可作為生物膜的簡(jiǎn)化模型；作為顯示酶類性質(zhì)的一種模型進(jìn)行基礎(chǔ)性研究；作為具有新型功能的疏水性反應(yīng)場(chǎng)；作為酶和微生物的一種新型的固定化方法；作為微小型的生物反應(yīng)器；在生物技術(shù)領(lǐng)域中作為生理活性物質(zhì)以及生物活性大分子的特異性分離場(chǎng)（分離、濃縮等方法）。2005-3-28492.3.1反膠團(tuán)萃取技術(shù)的特點(diǎn)反膠團(tuán)萃取技術(shù)的突出優(yōu)點(diǎn)①有很高的萃取率和反萃取率並具有選擇性；②分離、濃縮可同時(shí)進(jìn)行，過(guò)程簡(jiǎn)便；③能解決蛋白質(zhì)（如胞內(nèi)酶）在非細(xì)胞環(huán)境中迅速失活的問(wèn)題；④表面活性劑往往具有細(xì)胞破壁功效，可直接從完整細(xì)胞中提取具有活性的蛋白質(zhì)和酶；⑤成本低，溶劑可反復(fù)使用等。2005-3-28502.3.2反膠團(tuán)的形成反膠團(tuán)的構(gòu)造當(dāng)向水溶劑中加入表面活性劑時(shí)，如表面活性劑的濃度超過(guò)一定的數(shù)值時(shí)，形成正膠團(tuán)（normalmicelle）。當(dāng)向非極性溶劑中加入一定量的表面活性劑時(shí)，會(huì)形成反膠團(tuán)或反向膠團(tuán)（reversedmicelles）。在反膠團(tuán)中有一個(gè)極性核心，它包括由表面活性劑極性端組成的內(nèi)表面、平衡離子和水，被稱之為“水池”（waterpool）。這個(gè)“水池”具有極性，可以溶解具有極性的分子和親水性的生物大分子。2005-3-2851常用的表面活性劑AOT（AerosolOT），其化學(xué)名稱是琥珀酸二（2-乙基己基）酯磺酸鈉（Sodiumdi-2-ethyl-hexylsulfosuccinate），結(jié)構(gòu)式下CTAB（溴代十六烷基三甲銨）、TOMAC（氯化三辛基甲銨）、PTEA（磷脂醯乙醇胺）。常用的非極性有機(jī)溶劑有環(huán)己烷、庚烷、辛烷、異辛烷、己醇、矽油等。2005-3-2852反膠團(tuán)的物理化學(xué)特性CMC（criticalmicelleconcentration）0.1～1.0mmol/L的範(fàn)圍內(nèi)。反膠團(tuán)含水率WW用水和表面活性劑的濃度之比來(lái)定義，即W＝c水／c表W是個(gè)非常重要的參數(shù)，W越大，反膠團(tuán)的半徑越大。反膠團(tuán)“水池”中的水與普通水差異大。當(dāng)W＜6～8時(shí)，微水相中的水分子被表面活性劑親水性基團(tuán)強(qiáng)烈地束縛，其表觀粘度可增大到普通水粘度的50倍，且疏水性非常強(qiáng)。另外，其冰點(diǎn)通常低於0℃。這一部分水實(shí)際上起著使表面活性劑的親水性基團(tuán)水合化的作用。因?yàn)檫@一部分水被牢固地束縛著，所以粘度很大，流動(dòng)性很差。2005-3-2853在AOT反膠團(tuán)中，水合化一分子AOT需要6～8個(gè)水分子，而其他水分子則不受束縛，可與普通水一樣自由流動(dòng)，所以當(dāng)W＞16時(shí)，“水池”中的水逐漸接近主體水相粘度，膠團(tuán)內(nèi)也形成雙電層。圖2-14膠團(tuán)變化示意圖2005-3-2854反膠團(tuán)的製備1.液液接觸法即將含蛋白質(zhì)的水相與含表面活性劑的有機(jī)相接觸。2.注入法將含有蛋白質(zhì)的水溶液直接注入到含有表面活性劑的非極性有機(jī)溶劑中去。這種方法的過(guò)程較快並可控制反膠團(tuán)的平均直徑和含水量。3.溶解法對(duì)非水溶性蛋白質(zhì)可用該法。將含有反膠團(tuán)（W＝3～30）的有機(jī)溶液與蛋白質(zhì)固體粉末一起攪拌，使蛋白質(zhì)進(jìn)入反膠團(tuán)中，該法所需時(shí)間較長(zhǎng)。含蛋白質(zhì)的反膠團(tuán)也是穩(wěn)定的。2005-3-2855圖2-15蛋白質(zhì)溶解方式示意圖2005-3-28562.3.3反膠團(tuán)萃取蛋白質(zhì)的基本原理

反膠團(tuán)萃取是有機(jī)相-水相間的分配萃取。是從主體水相向溶解於有機(jī)溶劑相中反膠團(tuán)微水相中的分配萃取。同時(shí)也是一個(gè)濃縮操作。改變水相條件可實(shí)現(xiàn)反萃取。圖2-16反膠團(tuán)萃取蛋白質(zhì)的示意圖2005-3-2857“水殼”模型（water-shellmode））蛋白質(zhì)向非極性溶劑中反膠團(tuán)的納米級(jí)水池中的溶解，有圖2-17所示的四種可能。①大分子蛋白質(zhì)被封閉在“水池”中②蛋白質(zhì)中的親脂部分直接與非極性溶劑的碳?xì)浠衔锵嘟佑|③蛋白質(zhì)被吸附在微膠團(tuán)的“內(nèi)壁”上④蛋白質(zhì)被幾個(gè)微膠團(tuán)所溶解，圖2-17蛋白質(zhì)向反膠團(tuán)溶解的可能模型2005-3-2858酶、蛋白質(zhì)萃取特性分離場(chǎng)（膠團(tuán)）-分離目標(biāo)物質(zhì)（蛋白質(zhì)））間的相互作用及其影響因素等見(jiàn)表2-4。表2-4決定分配係數(shù)K的分離場(chǎng)-分離物質(zhì)間相互作用相互作用分離場(chǎng)分離物質(zhì)靜電性相互作用pH、鹽的種類和離子強(qiáng)度pI、表面電荷液狀離子交換體濃度、膠團(tuán)內(nèi)雙重電荷層立體性相互作用膠團(tuán)尺度、含水率W、表分子量面活性劑濃度疏水性相互作用溶劑、膠團(tuán)親水疏水基、親水疏水殘基含水率特異性相互作用親和配體構(gòu)象2005-3-2859下麵以研究得較多的AOT／異辛烷體系為對(duì)象，以立體性、靜電性、疏水性相互作用的分離特性及效果作以下的歸納。酶、蛋白質(zhì)等生物大分子的空間尺度與反膠團(tuán)的大小相接近。因而包括立體性相互作用在內(nèi)，表5-11中所有的相互作用關(guān)係雖都很重要，但在多數(shù)場(chǎng)合下，是它們之間的複合作用占主導(dǎo)地位。有些蛋白質(zhì)其構(gòu)象很小的變化就可能對(duì)這些相互作用的結(jié)果產(chǎn)生很大的影響。2005-3-28601.靜電性相互作用以細(xì)胞色素C、溶菌酶、核糖核酸酶a為例，考察它們從主體水相向反膠團(tuán)內(nèi)微水相中的萃取或反方向的反萃取時(shí)靜電性相互作用以及pH對(duì)這種作用的影響。①對(duì)於Mr＜20000小分子蛋白質(zhì)，pH＞pI時(shí)，蛋白質(zhì)不能溶入膠團(tuán)內(nèi)，但在等電點(diǎn)附近，急速變?yōu)榭扇?。?dāng)pH＜pI時(shí)，即在蛋白質(zhì)帶正電荷的pH範(fàn)圍內(nèi)，它們幾乎完全溶入膠團(tuán)內(nèi)。2005-3-2861圖2-18pH對(duì)蛋白質(zhì)萃取率的影響

2005-3-2862②蛋白質(zhì)相對(duì)分子品質(zhì)增大到一定程度，即使將pH向酸性一側(cè)偏離pI，萃取率也會(huì)降低（即立體性相互作用效果增大）。③相對(duì)分子品質(zhì)更大的BSA，全pH範(fàn)圍內(nèi)幾乎都不能萃?。挫o電相互作用效果無(wú)限小，可忽略不計(jì)）。此時(shí)，AOT濃度如較通常條件（50～100mmol/L）增加到200～500mmol/L，逐漸變?yōu)榭奢腿?。④降低pH，正電荷量增加，似乎有利於萃取率的提高。事實(shí)上，緩慢減小pH，萃取率從某一pH開(kāi)始，急速減小。這被認(rèn)為是蛋白質(zhì)的pH變性所造成的。蛋白質(zhì)和微量的AOT在靜電、疏水性等的相互作用下，在水相中生成了複合體而變性。2005-3-2863⑤添加KCl等無(wú)機(jī)鹽，萃取率下降（圖2-19）。圖2-19鹽濃度對(duì)蛋白質(zhì)溶解率的影響

2005-3-2864而且，它對(duì)有機(jī)相具有脫水作用（W減小，見(jiàn)下圖），使立體性相互（排斥）作用增大。圖2-20鹽濃度對(duì)反膠團(tuán)含水率的影響

AOT（mmol／L）＝（○）50（△）100，（□）200，（

）3002005-3-28652.立體性相互作用隨著蛋白質(zhì)分子量的增大，蛋白質(zhì)分子和膠團(tuán)間的立體性相互作用增加，萃取率有下降趨勢(shì)。用動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)定，發(fā)現(xiàn)反膠糰粒徑存在一粒徑分佈，膠團(tuán)的粒徑分佈（分離場(chǎng)）隨鹽濃度和AOT濃度的增加而發(fā)生顯著的變化。與蛋白質(zhì)溶入與否沒(méi)有關(guān)係。分離場(chǎng)不受蛋白質(zhì)種類的影響，可通過(guò)控制反膠糰粒徑，高效分離純化蛋白質(zhì)。隨著蛋白質(zhì)分子量的增加，分配係數(shù)KpI迅速下降，相對(duì)分子品質(zhì)20000左右的蛋白質(zhì)的高效分離是可能的。萃取溶入膠團(tuán)的蛋白質(zhì)的種類和相對(duì)分子品質(zhì)不同，分離場(chǎng)的特性（膠團(tuán)平均直徑和含水率）幾乎不變。2005-3-28663.其他的相互作用疏水性相互作用對(duì)蛋白質(zhì)分配特性的影響不大2005-3-28672.3.4反膠團(tuán)萃取過(guò)程多步間歇混合／澄清萃取過(guò)程

圖2-21是在pH9時(shí)，核糖核酸酶的溶解率很小，保留在水相而與其他兩種蛋白質(zhì)分離；相分離得到的反膠團(tuán)相（含細(xì)胞色素C和溶菌酶）與0.5mol/L的KCl水溶液接觸後，細(xì)胞色素C被反萃到水相，而溶菌酶的保留在反膠團(tuán)相。此後，含有溶菌酶的反膠團(tuán)相與2.0mol/LKCl，pH11.5的水相接觸，將溶菌酶反萃回收到水相中。2005-3-2868圖2-21反膠團(tuán)萃取分離蛋白質(zhì)的工藝過(guò)程2005-3-2869連續(xù)迴圈萃取-反萃取過(guò)程

圖2-22為連續(xù)迴圈萃取-反萃取過(guò)程，該過(guò)程由兩個(gè)混合／澄清單元構(gòu)成，左側(cè)單元用於反膠團(tuán)萃取，經(jīng)沉降澄清器後反膠團(tuán)相進(jìn)入右側(cè)單元的混合器進(jìn)行反萃取。圖2-22連續(xù)迴圈萃取與反萃取過(guò)程示意圖2005-3-28702.4超臨界流體萃取

超臨界流體萃取supercriticalfluidextraction，SCFE，也叫氣體萃取gasextraction、流體萃取fluidextraction、稠密氣體萃?。╠ensegasextraction）或蒸餾萃?。╠estraction），由於萃取中的一個(gè)重要因素是壓力，有效的溶劑萃取過(guò)程也可以在非臨界狀態(tài)下實(shí)現(xiàn)，因此廣義地也稱之為壓力流體萃取pressurefluidextraction。它是利用超臨界流體（supercriticalfluid，SCF），即其溫度和壓力略超過(guò)或靠近臨界溫度（Tc）和臨界壓力（pc），介於氣體和液體之間的流體作為萃取劑，從固體或液體中萃取出某種高沸點(diǎn)或熱敏性成分，以達(dá)到分離和提純的目的。2005-3-2871作為一個(gè)分離過(guò)程，超臨界流體萃取過(guò)程介於蒸餾和液-液萃取過(guò)程之間。即此過(guò)程同時(shí)利用了蒸餾和萃取的現(xiàn)象——蒸汽壓和相分離均在起作用。超臨界流體萃取，是適用面很廣的一門新型分離技術(shù)。超臨界流體萃取的操作需在高壓下運(yùn)行，但因萃取溶劑是“氣體”，操作中可以方便地改變其壓力和溫度，還可改變超臨界流體的組成，因此能自由地改變它對(duì)物質(zhì)的溶解能力。萃取、分離和溶劑回收都能在很低的溫度下進(jìn)行。2005-3-28722.4.1超臨界CO2的溶劑特徵

超臨界CO2的相圖利用不同密度下的CO2對(duì)物質(zhì)溶解能力的差異就可以實(shí)現(xiàn)萃取和分離的操作，即通過(guò)壓力或溫度的改變就可能有效地萃取和分離溶質(zhì)。圖2-23CO2的相圖2005-3-2873萃取溶劑CO2的性質(zhì)

表2-5一些超臨界萃取溶劑的臨界點(diǎn)性質(zhì)溶劑臨界溫度臨界壓力臨界密度

(℃)(MPa)(kg/m3)乙烷32.34.88203丙烷96.94.26220丁烷152.03.80228乙烯9.95.12227氨132.411.28235

二氧化碳31.37.38460二氧化硫157.67.88525水374.322.11326氟里昂-1328.833.95782005-3-2874CO2在工業(yè)上應(yīng)用廣泛。它無(wú)毒，無(wú)腐蝕性，不可燃燒，純度高且價(jià)格低。又有優(yōu)良的傳質(zhì)性能，擴(kuò)散係數(shù)大，粘度低，而且和其他用做超臨界流體的溶劑相比，CO2具有相對(duì)較低的臨界壓力和臨界溫度，適合於處理某些熱敏性生物製品和天然物產(chǎn)品。在超臨界流體萃取技術(shù)的應(yīng)用中，某些場(chǎng)合的目的是得到萃取物，而在另一些場(chǎng)合下，是為獲得萃取後的餘留物質(zhì)，萃取物則為其次。超臨界CO2（supercriticalcarbondioxide，SC-CO2）萃取技術(shù)適用於上述兩種情況。2005-3-2875將1≤Tr≤1.4，1＜pr＜5的區(qū)域作為SC-CO2的工作區(qū)。圖2-24SC-CO2對(duì)比壓力、對(duì)比溫度、對(duì)比密度關(guān)係2005-3-2876溶質(zhì)在SC-CO2中的分配平衡及萃取動(dòng)力學(xué)與溶質(zhì)在SC-CO2中的擴(kuò)散係數(shù)及SC-CO2的粘度有關(guān)。如圖2-25所示，SC-CO2中溶質(zhì)的擴(kuò)散係數(shù)為溫度和壓力的函數(shù)。溶質(zhì)在SC-CO2中的擴(kuò)散係數(shù)比在通常液體中高出50～100倍。因此，對(duì)動(dòng)物或植物組織中有效成分進(jìn)行萃取時(shí)，具有相當(dāng)高的品質(zhì)傳遞速率。2005-3-2877圖2-25SC-CO2中溶質(zhì)的擴(kuò)散係數(shù)2005-3-2878SC-CO2的粘度在（0.03～0.09）×10-3

Pa·s的範(fàn)圍內(nèi)，與通常的有機(jī)溶劑粘度（0.2～3.0）×10-3

Pa·s相比，僅為後者的幾十分之一。這使得SC-CO2萃取有可能在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)完成。2005-3-28792.4.2SC-CO2萃取以及拖帶劑的作用添加拖帶劑即輔助溶劑（entrainer）以增加物質(zhì)的溶解度和萃取選擇性，是實(shí)際運(yùn)行中常用的方法之一。如在CO2中添加約14%的丙酮後，甘油酯的溶解度增加了22倍。純CO2幾乎不能從咖啡豆中萃取咖啡因，但在加濕（水）的SC-CO2中，因?yàn)樯闪司哂袠O性的H2CO3，在一定的條件下，能選擇性地溶解萃取極性的咖啡因。2005-3-28802.4.3SC-CO2萃取流程

SC-CO2萃取基本工藝流程

超臨界萃取工藝過(guò)程主要由萃取釜和分離釜二部分組成，並適當(dāng)配合壓縮裝置和熱交換設(shè)備所構(gòu)成。對(duì)於原料為固體的萃取過(guò)程可歸納為3種基本工藝流程——等溫法、等壓法和吸附法。圖2-26表示基本流程示意圖。2005-3-2881圖2-26超臨界CO2流體萃取的三種基本流程（a）等溫法T1＝T2

p1＞p21—萃取釜；2—減壓閥；3—分離釜；4—壓縮機(jī)（b）等壓法T1＜T2

p1＝p21—萃取釜；2—加熱器；3—分離釜；4—高壓泵；5—冷卻器（c）吸附法T1＝T2

p1＝p21—萃取釜；2—吸附劑；3—分離釜；4—高壓泵2005-3-2882上述工藝過(guò)程原理可以用萘的溶解度與超臨界CO2溫度和壓力關(guān)係圖加以說(shuō)明。圖2-27萘在超臨界CO2中溶解度等壓線圖2005-3-2883對(duì)比等溫、等壓和吸附3種基本流程的能耗可見(jiàn)，吸附法理論上不需壓縮能耗和熱交換能耗，應(yīng)是最省能的過(guò)程。但該法只適用於可使用選擇性吸附方法分離目標(biāo)組分的體系，絕大多數(shù)天然產(chǎn)物分離過(guò)程很難通過(guò)吸附劑來(lái)收集產(chǎn)品，所以吸附法只能用於少量雜質(zhì)脫除過(guò)程。溫度變化對(duì)CO2流體的溶解度影響遠(yuǎn)小於壓力變化的影響。等壓法實(shí)用價(jià)值較少。通常超臨界CO2萃取過(guò)程大多採(cǎi)用改變壓力的等溫法流程。2005-3-2884固相物料超臨界CO2萃取工藝過(guò)程1.固相物料的萃取過(guò)程圖2-28固體物料超臨界CO2萃取工業(yè)化流程

2005-3-28852.超臨界CO2萃取與其他分離技術(shù)的聯(lián)用超臨界萃取工藝流程可通過(guò)多級(jí)分離釜將產(chǎn)品分成若干部分。但傳統(tǒng)分離釜只是一個(gè)空的高壓容器，利用不同分離壓力來(lái)達(dá)到分步解析結(jié)果，所以產(chǎn)品往往是不同餾分的混合物。由於天然產(chǎn)物組成複雜，近似化合組分多，因此單獨(dú)採(cǎi)用超臨界萃?。⊿FE）技術(shù)常常滿足不了對(duì)產(chǎn)品純度要求。為此，人們開(kāi)發(fā)了SFE與其他分離手段的聯(lián)用工藝技術(shù)。2005-3-2886①超臨界萃取和精餾聯(lián)用

是將超臨界萃取與精密分餾相結(jié)合，在萃取的同時(shí)將產(chǎn)物按其性質(zhì)和沸程分成若干不同的產(chǎn)品。具體工藝流程是將填有多孔不銹鋼填料的高壓精餾塔代替分離釜，沿精餾塔高度有不同控溫段（見(jiàn)圖2-29）。萃取產(chǎn)物在分離解析的同時(shí)，利用塔中的溫度梯度，改變CO2流體的溶解度，使較重組分凝析而形成內(nèi)回流，產(chǎn)品各餾分沿塔高進(jìn)行氣—液平衡交換，分餾成不同性質(zhì)和沸程的化合物。通過(guò)這種聯(lián)用技術(shù)，可大大提高分離效率，如在魚(yú)油精製中，採(cǎi)用該技術(shù)可得二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）純度達(dá)到90％以上的產(chǎn)品。在日本該聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用於辛香料的萃取—分離也有多篇專利技術(shù)。2005-3-2887圖2-29超臨界CO2萃取與精密分餾塔聯(lián)用示意圖

2005-3-2888②超臨界萃取與尿素包合技術(shù)聯(lián)用

又稱超臨界萃取結(jié)晶法。利用尿素可與脂肪酸化合物形成包合物，而且分子結(jié)構(gòu)和不飽和度不同的化合物與尿素的包合程度不同這一特性來(lái)實(shí)現(xiàn)組分的分離，可用於從魚(yú)油中提純EPA和DHA。③超臨界萃取與色譜分離聯(lián)用

如從向日葵種子中提取維生素E時(shí)同矽膠吸附柱聯(lián)用；從美麗豬屎豆種子中萃取單豬屎豆堿時(shí)同離子交換柱聯(lián)用。2005-3-2889液相物料的超臨界CO2流體萃取

固相物料的超臨界CO2萃取只能採(cǎi)用間歇式操作，即萃取過(guò)程中萃取釜需要不斷重複裝料-充氣，升壓-運(yùn)轉(zhuǎn)-降壓，放氣-卸料-再裝料的操作。因此，裝置處理量少，萃取過(guò)程中能耗和CO2氣耗較大，以至產(chǎn)品成本較高。液相物料超臨界CO2萃取有下列特點(diǎn)。①萃取過(guò)程可以連續(xù)操作②實(shí)現(xiàn)萃取過(guò)程和精餾過(guò)程一體化，可以連續(xù)獲得高純度和高附加值的產(chǎn)品。2005-3-2890圖2-30液相物料連續(xù)逆流萃取塔

該裝置有效利用於超臨界CO2萃取和精餾分離過(guò)程，達(dá)到進(jìn)一步分離、純化的目的。2005-3-28912.4.4SC-CO2萃取技術(shù)的應(yīng)用

生物活性物質(zhì)和生物製品的提取

SC-CO2萃取技術(shù)主要應(yīng)用於有害成分成分的脫除、有效成分的提取、食品原料的處理等幾個(gè)方面。例如：用SFE從咖啡、茶中脫咖啡因；啤酒花萃??；從植物中萃取風(fēng)味物質(zhì)；從各種動(dòng)植物中萃取各種脂肪酸、提取色素；從奶油和雞蛋中去除膽固醇等。

自1978年德國(guó)HAG公司第一套超臨界CO2萃取咖啡因工業(yè)化裝置問(wèn)世以來(lái)，世界各國(guó)紛紛推出各具特色的實(shí)用化裝置，萃取釜規(guī)模從200L到7m3不等，主要以食品工業(yè)的應(yīng)用為主。2005-3-28921.脫咖啡因超臨界流體萃取技術(shù)得到最早大規(guī)模的工業(yè)化應(yīng)用的是天然咖啡豆的脫咖啡因。圖2-31用SF-CO2法從咖啡豆中脫出咖啡因工藝流程

2005-3-28932.啤酒花萃取圖2-32為啤酒花萃取流程。普通的有機(jī)溶劑萃取法制取的啤酒花萃取液為暗綠色膏狀（即啤酒花浸膏），含有許多不純物質(zhì)，而且還殘留有機(jī)溶劑。液體CO2和SC-CO2抽提的酒花萃取物顏色為微欖綠，在20～25MPa，40℃萃取4h，浸膏得率可14％，α-酸提取率近99%，硬樹(shù)脂萃取率僅為5.2%，而且不萃取農(nóng)藥，芳香成分不氧化。2005-3-2894圖2-32SC-CO2萃取啤酒花的生產(chǎn)裝置流程示意圖

2005-3-2895表2-6萃取物的分析結(jié)果（％）成分原料萃餘物萃取液萃取率水分6.05.47.0樹(shù)脂含量30.34.390.089.9軟樹(shù)脂26.61.384.896.5α-酸12.60.241.298.9β-酸14.01.143.694.4硬樹(shù)脂3.73.05.22005-3-28963.其他從工業(yè)性應(yīng)用的萃取分離角度，SC-CO2萃取技術(shù)在醫(yī)藥、食品、化妝品等工業(yè)領(lǐng)域中有較寬的應(yīng)用面①醫(yī)藥工業(yè)

酶、維生素等的精製回收動(dòng)植物中藥效成分的萃取（生物鹼、生育酚、EPA、DHA、鴉片、嗎啡、精油等）醫(yī)藥品原料的濃縮、精煉、脫溶劑脂質(zhì)棍合物的分離、精製（甘抽酯、脂肪酸、卵磷脂）酵母、菌體產(chǎn)物的萃2005-3-2897②食品工業(yè)

植物油脂的萃取（大豆、向日葵、棕櫚、可哥豆、咖啡豆等）動(dòng)物油脂的萃?。~(yú)油、肝油等）奶脂中脫除膽固醇等食品脫脂（炸土豆片、油炸食品、無(wú)脂澱粉）咖啡、紅茶脫咖啡因、酒花萃取香辛料萃取（胡椒、肉豆蔻、肉桂等）植物色素的萃?。ɡ苯贰d子等）共沸混合物分離，含醇飲料的軟化脫色、脫臭，煙草脫尼古丁2005-3-2898③化妝品及香料工業(yè)天然香料萃取，合成香料的分離和精製化妝品原料萃取，精製（介面活性劑、脂肪酸脂、甘油單酯等）2005-3-2899超臨界狀態(tài)下的酶促反應(yīng)

除了用SC-CO2作萃取劑外，作為特殊的非水相的酶反應(yīng)溶劑，近年來(lái)受到越來(lái)越多的關(guān)注。許多酶蛋白在SC-CO2中不失去活性，且有催化功能。由於在自然界中酶的催化反應(yīng)是在水相介質(zhì)中進(jìn)行的，所以酶在SC-CO2介質(zhì)中的催化行為，引起人們的強(qiáng)烈興趣。根據(jù)目前的工作，SC-CO2作為酶催化反應(yīng)的介質(zhì)有以下優(yōu)點(diǎn)：2005-3-28100①脂溶性底物和產(chǎn)物可溶於SC-CO2中，酶蛋白不溶解，有利於三者的分離。②產(chǎn)品回收時(shí)，不需要處理大量的稀水溶液，因而不產(chǎn)生廢水污染問(wèn)題。③與其他非水相有機(jī)溶劑中的酶催化反應(yīng)相比，SC-CO2更適合與生物、食品相關(guān)的產(chǎn)品體系，產(chǎn)物分離簡(jiǎn)單。④與萃取一樣，SO-CO2中的品質(zhì)傳遞速度快，在臨界點(diǎn)附近，溶解能力和介電常數(shù)對(duì)溫度和壓力敏感，可控制反應(yīng)速度和反應(yīng)平衡。目前研究的有酯化反應(yīng)、酯水解反應(yīng)等。反應(yīng)條件溫和，部分反應(yīng)如表5-14所示。2005-3-28101SC-CO2的細(xì)胞破壁技術(shù)SC-CO2滲透力強(qiáng)，能快速滲入細(xì)胞內(nèi)並達(dá)到細(xì)胞內(nèi)外壓力平衡。此時(shí)如突然降壓，由於細(xì)胞內(nèi)外壓差較大，細(xì)胞劇烈膨大而發(fā)生脹裂。SC-CO2的以下一些性質(zhì)有利於細(xì)胞破碎：①在近臨界點(diǎn)，SC-CO2的微小壓力變化導(dǎo)致其體積變化很大，其能量變化很大，所以SC-CO2可破壞較厚的細(xì)胞壁，如常見(jiàn)的酵母等。②SC-CO2對(duì)細(xì)胞壁中的少量脂類有萃取作用，會(huì)破壞細(xì)胞壁的化學(xué)結(jié)構(gòu)，造成細(xì)胞壁在某些位置上的損壞。這種方式破壞的細(xì)胞壁碎片較大，使下游分離過(guò)程易於進(jìn)行。③CO2節(jié)流膨脹是吸熱降溫過(guò)程，這個(gè)性質(zhì)可防止通常破碎過(guò)程的升溫而引起的熱敏性物質(zhì)的破壞。2005-04-04膜分離102

膜分離Membraneseparation是利用特殊製造的、具有選擇透過(guò)性能的膜，在外力推動(dòng)下對(duì)混合物進(jìn)行分離、提純、濃縮的一種分離方法。

主要內(nèi)容3.1膜分離概述

3.2膜分離的基本理論

3.3膜組件的結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)3.4膜分離在生物工程中的的應(yīng)用3.5液膜分離

3.6膜萃取

3.1膜分離概述膜的定義在一種流體相間有一薄層凝聚相物質(zhì)，把流體相分隔開(kāi)來(lái)成為兩部分，這一薄層物質(zhì)稱為膜。是均勻的一相或是由兩相以上凝聚物質(zhì)所構(gòu)成的複合體，厚度應(yīng)在0.5mm以下，具有兩個(gè)介面；膜還必須具有高度的滲透選擇性；面積可以很大，也可以非常微小。膜分離的基礎(chǔ)①根據(jù)物理性質(zhì)的不同根據(jù)品質(zhì)、體積和幾何形態(tài)差異進(jìn)行分離。如過(guò)濾（Fitration，F(xiàn)）、微濾（Microfiltration，MF）和超濾（Ultrafiltration，UF）。圖3-1②根據(jù)化學(xué)性質(zhì)的不同物質(zhì)通過(guò)分離膜的速度取決於溶解速度（從膜表面接觸的混合物中進(jìn)入膜內(nèi)的速度）和進(jìn)入膜內(nèi)後從膜的表面擴(kuò)散到膜的另一表面的擴(kuò)散速度。溶解速度完全取決於被分離物與膜材料之間化學(xué)性質(zhì)的差異，擴(kuò)散速度除化學(xué)性質(zhì)外還與物質(zhì)的分子量有關(guān)。例如反滲透（ReverseOsmosis，RO）可用於海水淡化。是因?yàn)榉礉B透膜是親水性的高聚物，水分子很容易進(jìn)入膜內(nèi)，而水中的無(wú)機(jī)鹽離子則較難進(jìn)入。膜分離過(guò)程的推動(dòng)力表3-1主要膜分離過(guò)程的推動(dòng)力

推動(dòng)力膜過(guò)程壓力差反滲透、超濾，微濾、氣體分離電位差電滲析濃度差透析、控制釋放濃度差（分壓差）滲透氣化濃度差加化學(xué)反應(yīng)液膜、膜感測(cè)器膜分離的特點(diǎn)①分離效能高。②膜分離過(guò)程都不發(fā)生相變，能耗低。③膜分離過(guò)程的工作溫度在室溫附近，膜分離設(shè)備本身沒(méi)有運(yùn)動(dòng)的部件，結(jié)構(gòu)緊湊、維修費(fèi)用低，易於自動(dòng)化。④設(shè)備體積小，占地少。⑤膜分離設(shè)備可以直接插入已有的生產(chǎn)工藝流程。

膜分離存在的問(wèn)題①在操作中膜面會(huì)發(fā)生污染，使膜性能降低；②膜的耐壓性、耐熱性、耐溶劑是有限的，故應(yīng)用範(fàn)圍受限制；③僅採(cǎi)用膜分離技術(shù)分離效果有限，往往需要與其他分離工藝組合起來(lái)使用。膜分離的應(yīng)用及市場(chǎng)1950年與膜分離技術(shù)相關(guān)的工業(yè)產(chǎn)品年銷售量為500萬(wàn)美元。1981年增加到5億美元?，F(xiàn)在已經(jīng)超過(guò)100億美元。在大多數(shù)企業(yè)膜的費(fèi)用占設(shè)備費(fèi)用的25～40％。根據(jù)1990年的統(tǒng)計(jì)：美國(guó)占55％，日本占18％，西歐占23％。膜分離的種類繁多，它涉及不同的過(guò)程和眾多的應(yīng)用領(lǐng)域，要想在應(yīng)用和市場(chǎng)上取得成功，不僅要有優(yōu)良的膜及膜組件，而且還需要許多週邊部件，包括泵和監(jiān)控設(shè)備這類專門的硬體以及工程、工藝設(shè)計(jì)和特殊應(yīng)用技術(shù)等軟體。圖3-2膜分離市場(chǎng)份額膜的分類

按膜結(jié)構(gòu)分類對(duì)稱膜

symmetricmembrane非對(duì)稱膜

asymmetricmembrane由Loeb-Sourirajan浸沉相轉(zhuǎn)移法制得。複合膜complexmembrane按膜孔徑大小分類微濾膜0.025～20μm超濾膜0.001～0.02μm（1～20nm）反滲透膜0.0001～0.001μm（0.1～1nm）納米過(guò)濾膜平均直徑2nm。按材料分類合成高分子材料主要有聚碸、聚丙烯腈、聚醯亞胺、聚醯胺、聚烯類和含氟聚合物等。聚碸膜的耐高溫，適用pH範(fàn)圍廣，耐氯能力強(qiáng)，可調(diào)節(jié)孔徑為1～20nm。但操作壓力極限為0.5～1.0MPa。聚醯胺膜的耐壓能力較高，對(duì)溫度和pH都有很好的穩(wěn)定性，使用壽命較長(zhǎng)，常用於反滲透。天然高分子材料醋酸纖維膜的截鹽能力強(qiáng)，常用作反滲透膜。一般使用溫度低於45～50℃，pH3～8。無(wú)機(jī)材料主要有陶瓷、微孔玻璃等。目前實(shí)用化的無(wú)機(jī)膜主要有孔徑0.1μm以上的微濾膜和截留分子量10kD以上的超濾膜，其中以陶瓷材料的微濾膜最為常用。多孔陶瓷膜主要利用氧化鋁、矽膠、氧化鋯和鈦等陶瓷微粒燒結(jié)而成，膜厚方向不對(duì)稱。特點(diǎn)是機(jī)械強(qiáng)度高，耐高溫、耐化學(xué)試劑和耐有機(jī)溶劑，但造價(jià)較高。動(dòng)態(tài)膜（dynamicmembrane）為一類無(wú)機(jī)微孔濾膜，是氧化鋯等膠體微粒沉積在陶瓷管等多孔介質(zhì)表面形成的膜。動(dòng)態(tài)膜透過(guò)通量大，通過(guò)改變pH值容易形成或除去沉積層，因此清洗比較容易，但穩(wěn)定性差。其他分類荷電膜

即離子交換膜。液膜

將在3.5中討論。3.2膜的基本理論在膜分離過(guò)程中，通過(guò)膜相際有三種基本傳質(zhì)形式。圖3-3通過(guò)膜相際傳質(zhì)過(guò)程基本形式示意圖膜過(guò)程中的物質(zhì)傳遞過(guò)程

以非對(duì)稱膜為例溶質(zhì)或溶劑在膜中的滲透率取決於膜兩邊溶液的條件和膜本身的化學(xué)和物理性質(zhì)，傳質(zhì)總阻力為邊界層和膜層阻力之和。圖3-4物質(zhì)經(jīng)過(guò)非對(duì)稱膜的傳遞示意圖孔模型用來(lái)描繪微孔過(guò)濾、超濾等過(guò)程所用的高孔率膜。溶劑的滲透流率取決於膜的孔隙率、孔徑、溶液的粘度、溶劑在膜中的擴(kuò)散曲折途徑和膜上、下游壓力差，可表達(dá)為：J=εd2Δp/（32﹡μ﹡L）式中J——溶液通量[m3/（m2·s）]ε——膜的孔隙率d

——圓柱型孔道的直徑（m）L——膜的有效厚度，為擴(kuò)散曲折率×膜厚（m）Δp——膜兩側(cè)壓力差（kPa）

μ——溶液的粘度（Pa·s）溶解—擴(kuò)散模型反滲透膜的表皮層沒(méi)有孔道。物質(zhì)的滲透能力，取決於它在膜中的溶解度和擴(kuò)散係數(shù)。對(duì)於稀溶液，總體積通量J=A（Δp－Δp滲）式中A——總滲透?jìng)S數(shù)（A=A1Mr/ρ）A1——溶劑滲透?jìng)S數(shù)[kmol/（m2·s·kPa）]ρ——溶液密度（kg/m3）Mr——溶劑分子量由上式可知，當(dāng)壓力升高時(shí)，溶劑品質(zhì)通量線性增加，但溶質(zhì)通常與壓力無(wú)關(guān)，因而透過(guò)液濃度降低。優(yōu)先吸附-毛細(xì)管流動(dòng)模型Sourirajan等人提出。膜的表面如對(duì)某一組分的吸附能力較強(qiáng)，則該組分就在膜面上形成一層吸附層。高壓側(cè)常壓側(cè)圖3-5優(yōu)先吸附—毛細(xì)管流動(dòng)模型示意圖

膜的性能參數(shù)

膜孔道參數(shù)membraneporosityparameters孔道特徵包括孔徑（poresize）、孔徑分佈和孔隙度?？讖椒謥眩╬oresizedistribution）是指膜中一定大小的孔的體積占整個(gè)孔體積的百分?jǐn)?shù)?？紫抖龋╡ffectivenumberofpores）是指整個(gè)膜中孔所占的體積百分?jǐn)?shù)。0.5μm0.5μm3μm20μm圖3-6膜的電鏡照片水通量waterfluxpermeateflux水通量為每單位時(shí)間內(nèi)通過(guò)單位膜面積的水體積流量，也叫透水率，即水透過(guò)膜的速率。水通量的大小取決於膜的物理特性（如厚度、化學(xué)成分、孔隙度）和系統(tǒng)的條件（如溫度、膜兩側(cè)的壓力差、接觸膜的溶液的鹽濃度及料液平行通過(guò)膜表面的速度）。在實(shí)際使用中，水通量將很快降低，在處理蛋白質(zhì)溶液時(shí)，水通量通常為純水的10％。截留率和截?cái)喾肿恿拷亓袈剩╮ejectioncoefficient）是指對(duì)一定相對(duì)分子品質(zhì)的物質(zhì)，膜能截留的程度，定義為：δ=1－cP/cB式中cP——某一瞬間透過(guò)液濃度（kmol/m3）cB——截留液濃度（kmol/m3）如δ=1，則cP=0，表示溶質(zhì)全部被截留；如δ=0，則cP=cB，表示溶質(zhì)能自由透過(guò)膜。用已知相對(duì)分子品質(zhì)的各種物質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定其截留率，得到的截留率與相對(duì)分子品質(zhì)之間的關(guān)係稱為截?cái)嗲€。較好的膜應(yīng)該有陡直的截?cái)嗲€。截?cái)喾肿恿浚╩olecularweightcut-off，MWCO）定義為相當(dāng)於一定截留率（通常為90％或95％）的相對(duì)分子品質(zhì)。圖3-7

截?cái)嗲€

截留率