流感病毒細(xì)胞分離培養(yǎng)課件

流感病毒細(xì)胞分離培養(yǎng)

2/13/20241一、組織培養(yǎng)概況（一）組織培養(yǎng)定義組織或細(xì)胞培養(yǎng)是指從機(jī)體中取出組織或細(xì)胞，模擬機(jī)體內(nèi)的生理?xiàng)l件在體外進(jìn)行培養(yǎng)，使之生存和生長。2/13/20242（二）、組織培養(yǎng)的原理

組織培養(yǎng)主要是為病毒易感的組織細(xì)胞提供一個(gè)良好的生存環(huán)境，使細(xì)胞對環(huán)境產(chǎn)生適應(yīng)性，獲得生長繁殖的能力。病毒在敏感細(xì)胞中繁殖，?？梢鸺?xì)胞代謝等方面的變化，可出現(xiàn)細(xì)胞病變并釋放病毒到維持液中，這種情況可用細(xì)胞病變、色變法及檢測維持液中病毒抗原的方法，判定病毒的存在及滴度。有些病毒不引起細(xì)胞病變，有些在核內(nèi)繁殖不易釋放到維持液中，前者可用干擾的方法及免疫熒光的方法來檢測病毒，后者常采用凍融破壞細(xì)胞獲得病毒后檢測。

2/13/20243（三）、組織培養(yǎng)所需的材料和條件

1、組織或細(xì)胞來源：

人、猴、嚙齒類、禽的胚胎、臟器以及昆蟲等為組織培養(yǎng)常見的組織來源。用于病毒培養(yǎng)的往往是病毒的自然宿主細(xì)胞。如人類病毒用人和猴組織較敏感，但有些病毒用其他宿主細(xì)胞亦很敏感，如乙腦病毒對白紋伊蚊細(xì)胞系C6/36較人的細(xì)胞更為敏感。流感病毒對狗腎傳代細(xì)胞（Madindarbycaninekidney,MDCK）亦很敏感。

2/13/202442、單細(xì)胞的制備（略）

2/13/202453．細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件：（1）細(xì)胞接種數(shù)：細(xì)胞量越大繁殖的速度越快，接種傳代細(xì)胞一般為10—30萬/ml。（2）合成培養(yǎng)液：如Eagle氏液，RPMI1640，Eagle’sMEM。

不同培養(yǎng)液各有其特點(diǎn)，但往往也適用于各種細(xì)胞培養(yǎng)，其主要成分為氨基酸、碳水化合物、維生素、無機(jī)鹽及其他成分。配制培養(yǎng)液的水一般用單蒸后的去離子水。合成培養(yǎng)液中不含蛋白質(zhì)成分，血清蛋白對組織培養(yǎng)是不可缺少的；不僅能促進(jìn)細(xì)胞增長且能幫助細(xì)胞貼壁，不同血清對細(xì)胞促進(jìn)作用不同，以胎牛血清最好，每批血清使用前需以56℃30分鐘滅活處理。含有10%血清的培養(yǎng)液能促進(jìn)細(xì)胞增殖，稱為生長液。

2/13/20246（3）酸堿度：細(xì)胞生長最適宜的PH范圍是7.0–7.4。培養(yǎng)環(huán)境偏酸較偏堿更宜于細(xì)胞貼壁。PH的變化主要取決于，HCO3-濃度、二氧化碳分壓，細(xì)胞糖代謝能力。使用二氧化碳培養(yǎng)箱，能提供穩(wěn)定的5%二氧化碳?？勺詣诱{(diào)節(jié)細(xì)胞代謝引起的PH改變。（4）溫度：細(xì)胞培養(yǎng)的最適溫度與細(xì)胞來源的動物體溫一致，溫度增加2–3℃對細(xì)胞產(chǎn)生不良影響，使之在24h內(nèi)死亡。低溫對細(xì)胞影響較小。

2/13/20247（5）無菌條件：細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵之一是要有無菌概念，要防止污染。在細(xì)胞培養(yǎng)中，可能發(fā)生污染的來源很多，有組織培養(yǎng)液、器皿、組織本身、工作者本身、空氣等。因此要對培養(yǎng)液、器皿用具、操作室進(jìn)行徹底消毒，在操作時(shí)要嚴(yán)格實(shí)行無菌操作。（6）培養(yǎng)器皿的處理：培養(yǎng)器皿處理的好壞與否對于細(xì)胞的貼壁生長影響很大。常用的器皿主要有玻璃及塑料二大類。玻璃器皿一般須用清潔液浸泡過夜、清水洗10次后再用蒸餾水洗2次，烤干備用。塑料板一般用2%NaOH浸泡1小時(shí)后，清水洗凈再用1N

HCl浸泡1小時(shí)，用清水洗后再用蒸餾水漂洗。37℃干燥后，紫外線照射消毒。

2/13/20248(四）組織培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用范圍：優(yōu)點(diǎn)：可提供大量生物性狀相同的細(xì)胞作為研究對象，對疫苗生產(chǎn)來說，其抗原性更接近于自然流行株，可減少宿主蛋白成分，減少變態(tài)反應(yīng)。缺點(diǎn)：病毒復(fù)制后滴度低，不易保存，保存時(shí)易使病毒滴度丟失，傳代細(xì)胞含致癌因子，不宜用于疫苗生產(chǎn)。且隨著細(xì)胞代數(shù)增加，對病毒敏感性也隨之下降。應(yīng)用范圍：目前組織培養(yǎng)技術(shù)已應(yīng)用于病毒學(xué)的各個(gè)部門，不僅應(yīng)用于病毒性疾病的診斷及疫苗制備，也深入應(yīng)用到病毒學(xué)基礎(chǔ)理論的研究

2/13/20249二、組織培養(yǎng)分離流感病毒流感監(jiān)測最主要的目的是及時(shí)發(fā)現(xiàn)并分離到有意義的流感病毒新變種，尤其大流行株，用于診斷試劑的制備、疫苗的生產(chǎn)及疫情預(yù)報(bào)。組織培養(yǎng)技術(shù)是分離，診斷流感病毒最常用和最可靠的方法之一。

人流感病毒最初是通過雪貂分離出，但雪貂繁殖慢，量少，價(jià)錢昂貴并難飼養(yǎng)，故無法加以廣泛應(yīng)用。上世紀(jì)30年代中開始，多用雞胚來分離流感病毒。

2/13/202410近來由于PCR技術(shù)突習(xí)猛進(jìn)地發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了通過雞胚所分離到的流感病毒，其抗原性與原始標(biāo)本的有所不同，而通過MDCK細(xì)胞分離出的，其抗原性與原始標(biāo)本的相似。近來由于“O”相毒株的重現(xiàn)，MDCK等一些細(xì)胞對“O”相毒株的敏感性大大超出雞胚的敏感性。因此，MDCK等一些細(xì)胞已成為各流感病毒分離不可缺少的一種宿主系統(tǒng)。由于MDCK等一些傳代細(xì)胞屬腫瘤細(xì)胞系，用其分離的病毒不能用于疫苗制備，故要求進(jìn)行流感病毒分離時(shí)，同時(shí)采用雞胚和MDCK細(xì)胞。

2/13/202411（一）MDCK細(xì)胞分離流感病毒

1、實(shí)驗(yàn)材料：

MDCK細(xì)胞（最好是早代的）Eagle氏培養(yǎng)液（日本產(chǎn)的含谷氨酰胺的以抽濾為好）Hank氏溶液0.25%胰酶和Versene消化液雙抗(青、鏈霉素)或慶大霉素和抗真菌素胎?；蛐∨Ｑ?.6%或7.5%的NaHCO3.2/13/202412（1）細(xì)胞生長液配制

90mlEagle’s液+含終濃度為100u/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素+10ml小牛血清+2ml5.6%NaHCO3PH調(diào)至7.2-7.4。（2）細(xì)胞維持液配制:

同生長液，但不含胎?；蛐∨Ｑ?，而含終濃度為2–3ug/ml胰酶，用前用NaHC03將PH調(diào)至中性或偏堿。維持液的作用是使細(xì)胞停止繁殖，但仍保持代謝。

2/13/2024132、MDCK細(xì)胞傳代（1）先把需用的Eagle’s和Versene放37℃水浴預(yù)溫，其它試劑不得放入。（2）已成片的MDCK細(xì)胞，將其生長液倒掉。用Versene洗2遍。（3）把Versene與0.25%胰酶按7∶1比例配成消化液。（4）置37℃恒溫箱5—10min，當(dāng)細(xì)胞變圓，細(xì)胞與細(xì)胞間互不相聯(lián)，表明消化時(shí)間已到。如細(xì)胞仍連成片，表明消化時(shí)間未到。

（5）倒掉消化液，瓶內(nèi)留少許流體，再放37℃2’–3’，取出手上輕輕拍打幾下，這時(shí)可加已配好的生長液，稍加吹打即可。一般情況下，1瓶細(xì)胞傳3瓶，每2-3天需傳一代。2/13/2024143、MDCK細(xì)胞保存及復(fù)蘇

MDCK細(xì)胞對流感病毒的敏感性隨其代數(shù)增加而下降，故各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)液氮凍存代數(shù)較低的細(xì)胞作為種子。一般保存液為含10%二甲基亞砜和90%小牛血清。（1）MDCK細(xì)胞保存：將單層細(xì)胞消化分散成為單細(xì)胞，加入0.9ml小牛血清和0.1ml二甲基亞砜混合保存液，每瓶加1ml保存液，緩慢凍存：先放4℃2h，轉(zhuǎn)放–70℃4h，再轉(zhuǎn)放液氮中長期保存。（2）MDCK細(xì)胞復(fù)蘇：細(xì)胞凍存管從液氮罐取出后，速放37℃水浴溶化，1500rpm/分離心1分鐘，棄上清、沉渣加入若干ml培養(yǎng)液，混勻后加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37℃二氧化碳溫箱培養(yǎng)。2/13/2024154、MDCK細(xì)胞對流感病毒敏感性測試

MDCK細(xì)胞對病毒的敏感性隨其代數(shù)增加而下降。故MDCK細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室傳20代以上時(shí)，一般需測試一下其對流感病毒的敏感性。其具體測試法：選一株對MDCK細(xì)胞較敏感的流感病毒株。在同一條件下，用早代與要測試的MDCK細(xì)胞對其進(jìn)行TCLD50測定。如果測試的TCLD50比早代的低2個(gè)或以上Log,表明其對病毒的敏感性已下降，不應(yīng)再加以使用。2/13/2024165、MDCK細(xì)胞病毒接種和收獲（1）在低倍光學(xué)顯微鏡下檢查MDCK細(xì)胞生長狀態(tài)。（2）成片的細(xì)胞棄生長液，用Hank’s液洗兩遍，將殘余的牛血清洗凈，因牛血清中含有流感病毒非特異抑制素，會影響流感病毒的復(fù)制。（3）每瓶加入接種標(biāo)本0.5-1.0ml，輕搖細(xì)胞瓶，置35℃吸附1-2h。（4）倒掉感染液，再用Hank’s液洗1–2遍，每瓶加入3ml維持液，置33-35℃培養(yǎng)。2/13/202417（5）次日起每天檢查有無細(xì)胞病變（CPE）。CPE特征為細(xì)胞腫脹圓化，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞核固縮或碎裂，嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞部分或全部脫落（見附圖）。（6）收獲及紅細(xì)胞凝集活性（HA）檢查：當(dāng)CPE出現(xiàn)+++～++++號時(shí)進(jìn)行收獲，由于CPE無法證實(shí)就是流感病毒所造成。最后還得看維持液中是否有紅細(xì)胞凝集活性（HA），出現(xiàn)細(xì)胞凝集的為陽性標(biāo)本，收獲所有的維持液進(jìn)行病毒鑒定，也可暫凍存之。由于維持液中無牛血清，同時(shí)含一定量的胰酶和NaHCO3，故不應(yīng)在4℃保存，否則易造成HA活性丟失和PH變高。維持液中加適量胰酶的目的是為了提高流感病毒在細(xì)胞中復(fù)制能力。

（7）傳代及盲傳：如收獲的維持液HA滴度不高或量不夠用于鑒定，需在MDCK細(xì)胞或雞胚中傳代，把HA滴度提高或增多。

2/13/202418（二）細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)注意的一些問題

1、消化時(shí)間過長（30min-1h）或胰酶保存時(shí)間太久，應(yīng)改變胰酶的濃度或二次消化。

2、細(xì)胞的保存問題。取到早代細(xì)胞種子時(shí)一定要及時(shí)地保存起來以防丟失或污染。

3、用