飼料和飼料添加劑畜禽靶動物耐受性評價試驗

附件2：飼料和飼料添加劑畜禽靶動物

耐受性評價試驗指南（試行）1適用范圍本指南規(guī)定了飼料原料和飼料添加劑畜禽靶動物耐受性評價試驗的基本原則、試驗方案、試驗方法和試驗報告等要求。本指南適用于為新飼料和飼料添加劑、進(jìn)口飼料和飼料添加劑申報以及已經(jīng)批準(zhǔn)使用的飼料和飼料添加劑再評價而進(jìn)行的畜禽靶動物耐受性評價試驗。畜禽飼料產(chǎn)品的靶動物體內(nèi)耐受性評價試驗可參照本指南的要求進(jìn)行。2基本原則靶動物耐受性評價試驗的目的是為飼料和飼料添加劑（以下簡稱為“受試物”）對靶動物的短期毒性提供有限評價；當(dāng)受試物使用劑量超出推薦用量時，也可用來確立受試物的安全范圍。應(yīng)根據(jù)中國的養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)實際開展靶動物耐受性評價試驗，以保證評價結(jié)果的科學(xué)性、客觀性。靶動物耐受性評價試驗應(yīng)對受試物所適用的每一種靶動物分別進(jìn)行評價，本指南4.3以及其他另有規(guī)定的特殊情況除外。靶動物耐受性評價試驗應(yīng)由具備一定專業(yè)知識和試驗技能的專業(yè)人員在適宜的試驗場所、使用適宜的設(shè)備設(shè)施、按照規(guī)范的操作程序進(jìn)行，并且由試驗機(jī)構(gòu)指定的負(fù)責(zé)人負(fù)責(zé)。用于產(chǎn)品申報的，評價機(jī)構(gòu)和人員的要求另行規(guī)定。試驗動物應(yīng)健康并且具有相似的遺傳背景；飼養(yǎng)環(huán)境不應(yīng)對試驗結(jié)果造成影響；受試物和試驗日糧不得受到污染。在符合靶動物耐受性評價試驗相關(guān)要求的前提下，靶動物耐受性評價試驗可與靶動物有效性評價試驗合并進(jìn)行。靶動物耐受性評價試驗應(yīng)充分考慮實驗動物毒理學(xué)研究的結(jié)果。3試驗方案試驗開始前，應(yīng)根據(jù)受試物和靶動物的特點，對試驗進(jìn)行系統(tǒng)設(shè)計，形成試驗方案。試驗方案應(yīng)包括試驗?zāi)康?、試驗方法、儀器設(shè)備、詳細(xì)的動物品種和類別、動物數(shù)量、飼養(yǎng)和飼喂條件等，并由試驗負(fù)責(zé)人簽字確認(rèn)。具體要求如下：試驗動物：品種、年齡、性別、生理階段和一般健康狀況；試驗條件：動物來源和種群規(guī)模、飼養(yǎng)條件、飼喂方式；預(yù)飼期的條件要求；試驗分組：試驗組和對照組數(shù)量、每組重復(fù)數(shù)和每個重復(fù)的動物數(shù)（必須滿足統(tǒng)計學(xué)要求）、統(tǒng)計方法；試驗日糧：描述日糧的加工方法、日糧組成及相關(guān)的營養(yǎng)成分含量（實測值）和能量水平；注意根據(jù)受試物特點和使用方法配制日糧，使用的原料應(yīng)符合我國法規(guī)和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求，各試驗處理組試驗因子以外的其他因素（如：料型、粒度、加工工藝等）應(yīng)一致；3.5受試物的測定：受試物及其有效成分的通用名稱、生產(chǎn)廠家、規(guī)格、生產(chǎn)批號、有效成分含量的測試方法及測試結(jié)果、測試機(jī)構(gòu)，受試物有效成分在試驗日糧中的含量；3.6觀測項目和時間：檢測和觀察項目名稱、實施和持續(xù)的確切時間；3.7疾病治療和預(yù)防措施：不應(yīng)干擾受試物的作用模式并逐一記錄；3.8突發(fā)狀況處理：動物個體和各試驗組發(fā)生的所有非預(yù)期的突發(fā)狀況，都應(yīng)記錄其發(fā)生的時間和范圍。4.試驗方法受試物對于申請產(chǎn)品審定或登記的受試物，應(yīng)與擬生產(chǎn)（或擬進(jìn)口）的產(chǎn)品完全一致。產(chǎn)品應(yīng)由申報單位自行研制并在中試車間或生產(chǎn)線生產(chǎn)，同時提供產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和使用說明。試驗機(jī)構(gòu)應(yīng)將受試物樣品送國家或農(nóng)業(yè)部認(rèn)可的質(zhì)檢機(jī)構(gòu)對其有效成分的含量進(jìn)行實際測定。劑量與分組試驗分組：靶動物耐受性評價試驗至少要包括三個組，即對照組、有效劑量組、多倍劑量組。試驗劑量對照組通常不應(yīng)含有受試物，但是，對于某些動物機(jī)體的必需營養(yǎng)素（如氨基酸、維生素、微量元素等），可以添加，但添加量應(yīng)維持在最低必需水平。一般情況下，有效劑量組應(yīng)該選用最高限量。如果沒有最高限量，應(yīng)選用最高推薦劑量。如果沒有最高推薦量，應(yīng)根據(jù)受試物的自身特性，選擇最低推薦劑量的2-5倍作為有效劑量。多倍劑量組一般選用上述有效劑量的10倍。如果受試物的耐受劑量低于有效劑量的10倍，耐受性評價試驗應(yīng)能通過尸檢、組織病理學(xué)以及其他適宜的試驗方法提出反映受試物毒性的特異性指標(biāo)，并計算出受試物的安全系數(shù)。試驗重復(fù)數(shù)：各試驗組和對照組的試驗重復(fù)數(shù)（或動物數(shù)）必須滿足數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析的要求。一般情況下，每組重復(fù)數(shù)不能少于6個，其中豬、羊、牛等家畜1個動物即可為1個重復(fù)，而小動物（如家禽、兔等）則要求每個重復(fù)的動物數(shù)不能少于10只。性別比例應(yīng)相同。試驗期豬：哺乳仔豬的試驗應(yīng)在出生14天之后至斷奶前進(jìn)行，生長育肥豬試驗開始體重應(yīng)不大于35kg。如果哺乳仔豬和斷奶仔豬均需要進(jìn)行耐受性評價試驗，采用一個組合試驗即可，試驗期為斷奶前14天到斷奶后28天。如果已進(jìn)行了斷奶仔豬的耐受性評價試驗，則不必再進(jìn)行生長育肥豬的耐受性評價試驗。家禽：肉仔雞、蛋用雛雞和育肥用火雞的試驗一般選用1日齡雛禽。肉仔雞獲得的靶動物耐受性評價試驗數(shù)據(jù)可以外推至蛋用和種用雛雞，肉用火雞的數(shù)據(jù)也可外推至蛋用和種用火雞。產(chǎn)蛋家禽的試驗一般選擇在前1/3產(chǎn)蛋期進(jìn)行。牛：生產(chǎn)小牛肉的肉用犢牛的試驗應(yīng)選用體重不超過70kg的犢牛。如果犢牛和育肥牛均需要進(jìn)行靶動物耐受性評價試驗，開展一個組合試驗即可，每個階段各28天。家兔：如果哺乳期和斷奶期的家兔都需進(jìn)行耐受性評價試驗，試驗應(yīng)自仔兔出生后1周開始，試驗時間不少于49天，并且母兔應(yīng)與仔兔一同飼養(yǎng)直至斷奶。其他靶動物耐受性評價試驗需要的最短試驗期取決于適用動物的種類和生長階段，具體要求見附錄A。對于附錄A中未列出的動物，生長期動物的試驗期至少為28天，成年動物至少為42天。如果受試物僅適用于動物的特定生長階段并且短于附錄A中規(guī)定的試驗期，試驗時間應(yīng)根據(jù)具體情況進(jìn)行調(diào)整，但不得少于28天，而且應(yīng)考察相關(guān)的特異性指標(biāo)（如：若在妊娠母豬上使用，應(yīng)考察產(chǎn)活仔數(shù)；若在泌乳母豬上使用，則應(yīng)考察斷奶仔豬的體重和斷奶成活率等）。4.4觀察與檢測臨床觀察試驗期內(nèi)應(yīng)每天觀察試驗動物臨床表現(xiàn)、采食和飲水情況、生長情況以及相關(guān)動物產(chǎn)品的產(chǎn)量和特性。也應(yīng)詳細(xì)觀察和記錄不良反應(yīng)。對試驗中出現(xiàn)的不明原因的死亡應(yīng)進(jìn)行尸檢，如果可能，最好進(jìn)行組織學(xué)分析。血液學(xué)檢測試驗開始和試驗結(jié)束（必要時增加試驗中期）時每組隨機(jī)抽檢一定數(shù)量的動物，性別比例適當(dāng)，分別采集血樣進(jìn)行血液常規(guī)、生化指標(biāo)及其他與受試物相關(guān)的各種生理參數(shù)的檢測。血液常規(guī)指標(biāo)主要包括白細(xì)胞計數(shù)（WBC）紅細(xì)胞計數(shù)（RBC）血紅蛋白（HGB）紅細(xì)胞壓積（HCT）血小板計數(shù)（PLT）等指標(biāo)；生化指標(biāo)主要指谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）天門冬氨酸基轉(zhuǎn)移酶（AST）堿性磷酸酶（ALP）總蛋白（TPRO）白蛋白（ALB）尿素氮（UN）肌酐（CRE）血糖（GLU）總膽紅素（TBILI）等指標(biāo)。組織病理學(xué)檢查尸體解剖學(xué)檢查：試驗結(jié)束時，各組屠宰一定數(shù)量的試驗動物（性別比例適當(dāng)），進(jìn)行系統(tǒng)尸體解剖學(xué)檢查，為進(jìn)一步的組織學(xué)檢查提供依據(jù)。臟器系數(shù)測定：試驗結(jié)束時，各組隨機(jī)屠宰一定數(shù)量動物（性別比例適當(dāng)），剖檢取心肝脾肺腎等臟器稱重，并計算各器官與體重的比值。組織病理學(xué)檢查：試驗結(jié)束時，對多倍劑量組及尸檢異常動物的主要器官進(jìn)行系統(tǒng)的組織病理學(xué)檢查，詳細(xì)檢查的器官和組織包括：心肝脾肺腎胸腺胰腺胃十二指腸回腸直腸淋巴結(jié)骨髓等組織。4.4.4其他特異性觀測指標(biāo)根據(jù)受試物的作用特點和用途，增加相應(yīng)的特異性觀測指標(biāo)和敏感性功能指標(biāo)。數(shù)據(jù)記錄在試驗實施過程中，試驗方案所涉及的內(nèi)容均應(yīng)逐一記錄。數(shù)據(jù)記錄應(yīng)真實、準(zhǔn)確、完整、規(guī)范、清晰，并妥善保管。數(shù)據(jù)的有效位數(shù)以所用儀器的精度為準(zhǔn)，采用國家法定計量單位和國家推薦使用的單位。統(tǒng)計分析以重復(fù)為單位，根據(jù)不同的試驗設(shè)計采用相應(yīng)的統(tǒng)計分析方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。4.6.2統(tǒng)計顯著性差異水平至少應(yīng)達(dá)到P<0.05。5試驗報告試驗報告應(yīng)提供試驗獲取的所有數(shù)據(jù)，包括所有試驗動物和試驗重復(fù)。未納入統(tǒng)計分析的數(shù)據(jù)或由于數(shù)據(jù)缺乏、數(shù)據(jù)丟失而無法評價的情況也應(yīng)報告，并說明在各組別中的分布情況。5.2每個靶動物耐受性評價試驗必須單獨(dú)形成最終報告。每個試驗最終報告中應(yīng)包含試驗概述（見附錄B）和報告正文。試驗報告正文至少應(yīng)包括：A、試驗名稱；B、 摘要；C、 試驗?zāi)康?；D、 受試物；E、 試驗時間和地點；F、 試驗材料和方法；G、 結(jié)果與討論；H、 結(jié)論；I、 原始數(shù)據(jù)及相關(guān)的圖表和照片；未納入統(tǒng)計分析的數(shù)據(jù)或由于數(shù)據(jù)缺乏、數(shù)據(jù)丟失而無法評價的情況應(yīng)具體說明；J、 參考文獻(xiàn)；K、 試驗機(jī)構(gòu)和操作人員，包括試驗機(jī)構(gòu)的名稱，試驗操作人員、試驗負(fù)責(zé)人和報告簽發(fā)人的簽名，報告簽發(fā)時間，加蓋簽發(fā)機(jī)構(gòu)的單位公章或?qū)ｉT的分析測試章；委托檢測的數(shù)據(jù)應(yīng)提供檢測機(jī)構(gòu)出具的檢測報告。應(yīng)對試驗報告每頁進(jìn)行編碼，格式為“第頁，共頁”，并加蓋騎縫章，確保報告的完整性。6資料存檔最終報告、原始記錄、圖表和照片、試驗方案、受試物樣品及其檢測報告等原始資料應(yīng)存檔備查，保存時間一般不得少于5年，作為產(chǎn)品申報的，保存時間至少為10年。

附錄A：試驗期表1.豬類另IJ試驗階段*（體重或日齡）最短試驗期起始結(jié)束日齡結(jié)束體重（kg）哺乳仔豬14日齡21~426~1114天斷奶仔豬21?42日齡1203528天哺乳和斷奶仔豬14日齡1203542天生長育肥豬W35kg120?250（或根據(jù)當(dāng)?shù)亓?xí)慣）80?150（或根據(jù)當(dāng)?shù)亓?xí)慣）42天**繁殖母豬初次受精受精至斷奶，至少一個繁殖周期泌乳母豬分娩前兩周至斷奶注：*試驗階段：指試驗用動物所處的生長階段，最短試驗期應(yīng)處于所對應(yīng)的試驗階段**如果已有斷奶仔豬的耐受性評價試驗數(shù)據(jù)，則不必再進(jìn)行生長育肥豬的耐受性評價試驗表2.家禽類另IJ試驗階段（體重或日齡）最短試驗期起始結(jié)束日齡結(jié)束體重（kg）肉仔雞出殼35天1.6~2.435天蛋用雛雞出殼16(20)周齡35天*產(chǎn)蛋雞16~21周齡13（18）月齡56天**育肥用火雞出殼母：14（20）周齡公：16（24）周齡母：7~10公：12~2042天種用火雞開始產(chǎn)蛋（30周齡）60周齡56天后備種用火雞出殼30周齡母：15公：3042天***注：*僅當(dāng)肉仔雞的耐受性評價試驗數(shù)據(jù)無法提供時進(jìn)行

**最好在開產(chǎn)后的前1/3產(chǎn)蛋期進(jìn)行***僅當(dāng)育肥用火雞的耐受性評價試驗數(shù)據(jù)無法提供時進(jìn)行表3.牛（包括水牛）類另IJ試驗階段（體重或日齡）最短試驗期起始結(jié)束日齡結(jié)束體重（kg）犢牛出生或60-80kg4月齡14542天生產(chǎn)小牛肉的肉用犢牛<70kg6月齡180(250)28天育肥牛瘤胃發(fā)育完全（至少完全斷奶）10?36月齡350?70042天泌乳奶牛56天繁殖母牛初次受精受精至斷奶，至少一個繁殖周期表4.綿羊類另IJ試驗階段（體重或日齡）最短試驗期起始結(jié)束日齡結(jié)束體重（kg）育成羔羊出生3月齡15~2028天育肥羔羊出生6月齡或以上4028天泌乳奶綿羊42天繁殖綿羊初次受精受精至斷奶，至少一個繁殖周期表5.山羊類另IJ試驗階段（體重或日齡）最短試驗期起始結(jié)束日齡結(jié)束體重（kg）育成羔羊出生3月齡15~2028天育肥羔羊出生6月齡或以上4028天泌乳奶山羊42天

繁殖山羊初次受精受精至斷奶，至少一個繁殖周期表6.家兔類另IJ試驗階段（體重或日齡）最短試驗期開始結(jié)束日齡哺乳和斷奶兔出生后一周49天育肥兔斷奶后8~11周28天繁殖母兔從受精開始受精至斷奶，至少一個繁殖周期泌乳母兔第一次受精分娩前兩周至斷奶

附錄B：試驗概述表試驗編號：第1頁，共_頁受試物受試物通用名稱：有效成分：有效成分標(biāo)示值：有效成分實測值：產(chǎn)品類別：外觀性狀：生產(chǎn)單位：生產(chǎn)日期及批號：樣品數(shù)量及包裝規(guī)格：保質(zhì)期：收（抽）樣日期：送（抽）樣人：抽樣地點：（適用時）抽樣基數(shù)：（適用時）試驗動物試驗動物品種：性別：生理階段：起始日齡：起始體重：健康狀況：動物來源和種群規(guī)模：飼喂方式：飼養(yǎng)條件：時間與場所試驗起始時間：試驗持續(xù)時間：試驗場所：設(shè)計與分組