水稻種子攜帶細(xì)菌性條斑病菌和細(xì)菌性谷枯病菌同步分子檢測(cè)規(guī)程

1水稻種子攜帶細(xì)菌性條斑病菌和細(xì)菌性谷枯病菌同步分子檢測(cè)規(guī)程本文件規(guī)定了同步檢測(cè)水稻種子攜帶細(xì)菌性條斑病菌和細(xì)菌性谷枯病菌多重PCR技術(shù)的要求，描述了操作方法。本文件適用于境植物檢疫以及水稻種子中細(xì)菌性條斑病菌和細(xì)菌性谷枯病菌的分子檢測(cè)工作。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB15569農(nóng)業(yè)植物調(diào)運(yùn)檢疫規(guī)程ISTA國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程3術(shù)語和定義GB/T28099和GB/T29396界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1水稻細(xì)菌性條斑病bacterialleafstreakofrice由稻黃單胞菌稻生致病變種（Xanthomonasoryzaeoryzaepv.oryzicola(Fangetal.)Swingetal.）引起的細(xì)菌性病害。[來源：GB/T28099-2011，3]3.2水稻細(xì)菌性谷枯病bacterialgrainrotofrice由穎殼假單胞菌（Burkholderiaglumae（Kurita＆Tabei）Urakamietal.）引起的細(xì)菌性病害。[來源：GB/T29396-2012，3]3.3陽(yáng)性對(duì)照positivecontrol以水稻細(xì)菌性條斑病病菌和水稻細(xì)菌性谷枯病菌的DNA作為檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照。3.4陰性對(duì)照negativecontrol以ddH2O作為檢測(cè)的陰性對(duì)照。3.5多重PCR技術(shù)multiplexPCR多種病原微生物的同時(shí)檢測(cè)或鑒定，是在同一PCR反應(yīng)管中同時(shí)加上多種病原微生物的特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可用于同時(shí)檢測(cè)多種病原菌。4原理針對(duì)水稻細(xì)菌性條斑病病原菌的LPSO-antigenbiosynthesisprotein基因的保守區(qū)域以及水稻細(xì)菌性谷枯病病原菌的gyrB基因的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)待檢樣品進(jìn)行PCR技術(shù)，依據(jù)是否擴(kuò)增獲得預(yù)期DNA片段，從而準(zhǔn)確快速地從稻種檢測(cè)出病原菌。5主要試劑2三羥基氨基甲烷（Tris）、三羥基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）、乙二胺四乙酸（EDTA）、乙醇、硼酸、蛋白胨，牛肉浸膏，瓊脂。除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑。實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682中一級(jí)水的規(guī)格。培養(yǎng)基和試劑配方見附錄A。6儀器用具超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、生物顯微鏡、PCR儀、離心機(jī)、紫外凝膠成像儀、電泳儀、冰箱、水浴鍋、電子天平、移液槍、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、三角瓶、剪刀、離心管。7取樣方法按照ISTA或GB15569的要求抽樣。8樣品處理及分離培養(yǎng)待檢水稻種子取20粒加入5mL滅菌的磷酸緩沖液，于滅菌的研缽中壓碎制成提取液，在25℃下放置5h后漩渦混勻5min，再加入滅菌的磷酸緩沖液稀釋成100倍的懸浮液，取100μL懸浮液在NA培養(yǎng)基平板上劃線分離，28℃培養(yǎng)50h，以無菌水處理相應(yīng)時(shí)間為對(duì)照。9多重PCR檢測(cè)將平板上的菌落用無菌水洗脫下，制成細(xì)菌懸浮液，用建立的多重PCR體系進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)3次。多重PCR檢測(cè)程序參見附錄B。10結(jié)果判定觀察電泳結(jié)果，陽(yáng)性對(duì)照在412bp和690bp處有條帶出現(xiàn)，且陰性對(duì)照無條帶出現(xiàn)的前提下，待測(cè)樣品在412bp和690bp處有條帶出現(xiàn)，判斷樣品攜帶水稻細(xì)菌性條斑病菌和水稻細(xì)菌性谷枯病菌，否則判斷為陰性反應(yīng)，即樣品不帶水稻細(xì)菌性條斑病菌和水稻細(xì)菌性谷枯病菌。11樣品及用具處理檢測(cè)過程中使用的有關(guān)材料和用具，在使用完畢后須進(jìn)行消毒處理和除害處理，經(jīng)檢驗(yàn)鑒定后的種子樣品，應(yīng)在-80℃~-20℃保存三個(gè)月，保存期滿后，再進(jìn)行滅活處理。3（規(guī)范性）培養(yǎng)基和試劑配方A.1NA培養(yǎng)基蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，瓊脂18g，加蒸餾水至1000ml，pH6.8～7.0，121℃高壓滅菌15min。A.2NB培養(yǎng)液蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，加蒸餾水至1000ml，pH6.8～7.0，121℃高壓滅菌15min。A.3TE-緩沖液10mmol/LTris-HCl（pH8.0）；1mmol/LEDTA（PH8.0)。A.4電泳緩沖液5×TBETris54g，硼酸27.5g，0.5mol/LEDTA(pH8.0)20ml，加蒸餾水至1000ml，使用時(shí)稀釋10倍,為0.5×TBE。A.5瓊脂糖凝膠稱取0.5g瓊脂糖,置于250ml三角燒瓶中,加入50ml0.5×TBE稀釋緩沖液,蓋上封口膜,放入微波爐加熱,不時(shí)搖動(dòng),至瓊脂糖全部溶化,溶液呈透明后冷卻至60℃,往膠液內(nèi)加入適量DNA染液，搖勻,即為1％瓊脂糖膠液。4（規(guī)范性）多重PCR檢測(cè)方法B.1引物的設(shè)計(jì)與序列B.1.1水稻細(xì)菌性條斑病特異性引物針對(duì)水稻細(xì)菌性條斑病病原菌的LPSO-antigenbiosynthesisprotein基因的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物?！嫌我铮?’-TCTCCCAGCATGTTGATCG-3’。——下游引物：5’-GCGTTCAATCTCCTCCATGT-3’?！獢U(kuò)增產(chǎn)物為690bp。B.1.2水稻細(xì)菌性谷枯病特異性引物從GenBank收集并選取水稻細(xì)菌性谷枯病菌的部分核酸序列，運(yùn)用生物軟件DNAStar分析比較，選取病菌的特異性序列設(shè)計(jì)并合成特異性引物?！嫌我铮?’-ACACGGAACACCTGGGTA-3’?！掠我铮?’-TCGCTCTCCCGAAGAGAT-3’。——擴(kuò)增產(chǎn)物為412bp。B.2PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系（50μL）：2×PCRTaqMasterMix25μL，2對(duì)上下游引物（10mmol/L）各0.5μL，滅菌水21μL，1μL的細(xì)菌懸浮液。B.3PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，52.5℃退火30s，68℃延伸2min，循環(huán)35次；68℃延伸10min。B.4加樣與電泳B.4.1加樣將制備好的瓊脂糖凝膠先放入電泳槽中，用移液槍吸取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物緩慢加入1％瓊脂糖凝膠加樣孔中。B.4.2電泳加樣后,蓋上電泳槽蓋子，連接電源，設(shè)定電壓為100V,歷時(shí)1h，運(yùn)行儀器。當(dāng)溴