水稻種子攜帶細菌性條斑病菌和細菌性谷枯病菌同步分子檢測規(guī)程

1水稻種子攜帶細菌性條斑病菌和細菌性谷枯病菌同步分子檢測規(guī)程本文件規(guī)定了同步檢測水稻種子攜帶細菌性條斑病菌和細菌性谷枯病菌多重PCR技術(shù)的要求，描述了操作方法。本文件適用于境植物檢疫以及水稻種子中細菌性條斑病菌和細菌性谷枯病菌的分子檢測工作。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB15569農(nóng)業(yè)植物調(diào)運檢疫規(guī)程ISTA國際種子檢驗規(guī)程3術(shù)語和定義GB/T28099和GB/T29396界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1水稻細菌性條斑病bacterialleafstreakofrice由稻黃單胞菌稻生致病變種（Xanthomonasoryzaeoryzaepv.oryzicola(Fangetal.)Swingetal.）引起的細菌性病害。[來源：GB/T28099-2011，3]3.2水稻細菌性谷枯病bacterialgrainrotofrice由穎殼假單胞菌（Burkholderiaglumae（Kurita＆Tabei）Urakamietal.）引起的細菌性病害。[來源：GB/T29396-2012，3]3.3陽性對照positivecontrol以水稻細菌性條斑病病菌和水稻細菌性谷枯病菌的DNA作為檢測的陽性對照。3.4陰性對照negativecontrol以ddH2O作為檢測的陰性對照。3.5多重PCR技術(shù)multiplexPCR多種病原微生物的同時檢測或鑒定，是在同一PCR反應(yīng)管中同時加上多種病原微生物的特異性引物，進行PCR擴增，可用于同時檢測多種病原菌。4原理針對水稻細菌性條斑病病原菌的LPSO-antigenbiosynthesisprotein基因的保守區(qū)域以及水稻細菌性谷枯病病原菌的gyrB基因的保守區(qū)域，設(shè)計特異性引物，對待檢樣品進行PCR技術(shù)，依據(jù)是否擴增獲得預期DNA片段，從而準確快速地從稻種檢測出病原菌。5主要試劑2三羥基氨基甲烷（Tris）、三羥基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）、乙二胺四乙酸（EDTA）、乙醇、硼酸、蛋白胨，牛肉浸膏，瓊脂。除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑。實驗用水應(yīng)符合GB/T6682中一級水的規(guī)格。培養(yǎng)基和試劑配方見附錄A。6儀器用具超凈工作臺、高壓滅菌鍋、生物顯微鏡、PCR儀、離心機、紫外凝膠成像儀、電泳儀、冰箱、水浴鍋、電子天平、移液槍、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、三角瓶、剪刀、離心管。7取樣方法按照ISTA或GB15569的要求抽樣。8樣品處理及分離培養(yǎng)待檢水稻種子取20粒加入5mL滅菌的磷酸緩沖液，于滅菌的研缽中壓碎制成提取液，在25℃下放置5h后漩渦混勻5min，再加入滅菌的磷酸緩沖液稀釋成100倍的懸浮液，取100μL懸浮液在NA培養(yǎng)基平板上劃線分離，28℃培養(yǎng)50h，以無菌水處理相應(yīng)時間為對照。9多重PCR檢測將平板上的菌落用無菌水洗脫下，制成細菌懸浮液，用建立的多重PCR體系進行檢測，重復3次。多重PCR檢測程序參見附錄B。10結(jié)果判定觀察電泳結(jié)果，陽性對照在412bp和690bp處有條帶出現(xiàn)，且陰性對照無條帶出現(xiàn)的前提下，待測樣品在412bp和690bp處有條帶出現(xiàn)，判斷樣品攜帶水稻細菌性條斑病菌和水稻細菌性谷枯病菌，否則判斷為陰性反應(yīng)，即樣品不帶水稻細菌性條斑病菌和水稻細菌性谷枯病菌。11樣品及用具處理檢測過程中使用的有關(guān)材料和用具，在使用完畢后須進行消毒處理和除害處理，經(jīng)檢驗鑒定后的種子樣品，應(yīng)在-80℃~-20℃保存三個月，保存期滿后，再進行滅活處理。3（規(guī)范性）培養(yǎng)基和試劑配方A.1NA培養(yǎng)基蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，瓊脂18g，加蒸餾水至1000ml，pH6.8～7.0，121℃高壓滅菌15min。A.2NB培養(yǎng)液蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，加蒸餾水至1000ml，pH6.8～7.0，121℃高壓滅菌15min。A.3TE-緩沖液10mmol/LTris-HCl（pH8.0）；1mmol/LEDTA（PH8.0)。A.4電泳緩沖液5×TBETris54g，硼酸27.5g，0.5mol/LEDTA(pH8.0)20ml，加蒸餾水至1000ml，使用時稀釋10倍,為0.5×TBE。A.5瓊脂糖凝膠稱取0.5g瓊脂糖,置于250ml三角燒瓶中,加入50ml0.5×TBE稀釋緩沖液,蓋上封口膜,放入微波爐加熱,不時搖動,至瓊脂糖全部溶化,溶液呈透明后冷卻至60℃,往膠液內(nèi)加入適量DNA染液，搖勻,即為1％瓊脂糖膠液。4（規(guī)范性）多重PCR檢測方法B.1引物的設(shè)計與序列B.1.1水稻細菌性條斑病特異性引物針對水稻細菌性條斑病病原菌的LPSO-antigenbiosynthesisprotein基因的保守區(qū)域，設(shè)計特異性引物?！嫌我铮?’-TCTCCCAGCATGTTGATCG-3’。——下游引物：5’-GCGTTCAATCTCCTCCATGT-3’。——擴增產(chǎn)物為690bp。B.1.2水稻細菌性谷枯病特異性引物從GenBank收集并選取水稻細菌性谷枯病菌的部分核酸序列，運用生物軟件DNAStar分析比較，選取病菌的特異性序列設(shè)計并合成特異性引物?！嫌我铮?’-ACACGGAACACCTGGGTA-3’?！掠我铮?’-TCGCTCTCCCGAAGAGAT-3’?！獢U增產(chǎn)物為412bp。B.2PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系（50μL）：2×PCRTaqMasterMix25μL，2對上下游引物（10mmol/L）各0.5μL，滅菌水21μL，1μL的細菌懸浮液。B.3PCR反應(yīng)條件94℃預變性5min；94℃變性30s，52.5℃退火30s，68℃延伸2min，循環(huán)35次；68℃延伸10min。B.4加樣與電泳B.4.1加樣將制備好的瓊脂糖凝膠先放入電泳槽中，用移液槍吸取5μL擴增產(chǎn)物緩慢加入1％瓊脂糖凝膠加樣孔中。B.4.2電泳加樣后,蓋上電泳槽蓋子，連接電源，設(shè)定電壓為100V,歷時1h，運行儀器。當溴