高效液相色譜法－儀器2

3.分離系統(tǒng)

分離系統(tǒng)包括色譜柱、恒溫器和連接管等部件。色譜柱一般用內(nèi)部拋光的不銹鋼制成。其內(nèi)徑為2~6mm，柱長(zhǎng)為10~50cm，柱形多為直形，內(nèi)部充滿微粒固定相。柱溫一般為室溫或接近室溫。色譜柱是色譜儀的起分離作用的關(guān)鍵部件，其核心是優(yōu)質(zhì)的色譜填料。進(jìn)行特定的色譜分離工作的首要要準(zhǔn)備性能良好的色譜柱，即選擇在確定的分離條件下分離效率高和分析時(shí)間短的色譜柱。

12色譜柱柱結(jié)構(gòu)柱材料與柱規(guī)格

柱維護(hù)與保養(yǎng)柱性能檢測(cè)保護(hù)柱3柱結(jié)構(gòu)4柱材料柱材料最常用316#和314#不銹鋼,但有時(shí)也采用工程塑料、氟塑料和內(nèi)襯玻璃不銹鋼管等特殊材料。篩板一般采用耐化學(xué)腐蝕的燒結(jié)不銹鋼制成，孔徑應(yīng)小于填料粒度。連接進(jìn)樣閥和色譜柱以及色譜柱與檢測(cè)器的導(dǎo)管通常采用內(nèi)徑為0.13mm的窄心管5柱規(guī)格6死體積輸送分離檢測(cè)

進(jìn)樣泵進(jìn)樣閥柱淋洗液

顯色劑

反應(yīng)管排放加壓Fe3+Cu2+Ni2+Zn2+Co2+Mn2+Fe2+Cd2+UV/VIS檢測(cè)器記錄78柱溫控制在高效液相色譜分析中，溫度的影響往往容易被忽略，現(xiàn)隨分析樣品復(fù)雜性和多樣性的不斷出現(xiàn)；人們對(duì)分析結(jié)果準(zhǔn)確度和精密度的要求不斷提高，柱溫的控制日益受到人們的重視。在以下幾種情況需精確控制柱溫：在一些法定標(biāo)準(zhǔn)分析方法中，要求保留時(shí)間具有再現(xiàn)性。必須通過改變柱溫來提高分離效率。對(duì)高分子化合物或粘度大的樣品，分析時(shí)柱溫必須高于室溫，對(duì)一些具有生物活性的生物分子，要求分析時(shí)柱溫應(yīng)低于室溫對(duì)某些組成復(fù)雜的樣品，在單一色譜柱不能實(shí)現(xiàn)完全分離，要使用二維色譜技術(shù)，利用柱切換，使兩根色譜柱在不同柱溫下操作以實(shí)現(xiàn)多組分的完全分離。一個(gè)理想的HPLC柱溫控制系統(tǒng)，如HP1100高效液相色譜儀可以實(shí)現(xiàn)從低于室溫10℃至80℃柱溫的精確控制。對(duì)凝膠滲透色譜儀其柱溫可從室溫至150℃實(shí)現(xiàn)精確控溫。9柱維護(hù)與保養(yǎng)避免壓力和溫度的急劇變化及機(jī)械震動(dòng)使用適宜的流動(dòng)相（尤其是pH)避免將復(fù)雜樣品直接進(jìn)樣經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱保存時(shí)將柱內(nèi)充滿合適液體，擰緊柱接頭，絕對(duì)禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)過夜10柱性能檢測(cè)柱效：理論塔板高度

11峰對(duì)稱性：峰不對(duì)稱因子：應(yīng)小于或等于1.2

B(10%h)Af=A(10%h)12保護(hù)柱保護(hù)柱：在分析柱入口端加5~50mm與分析柱固定相相同的短柱，吸留過濾流動(dòng)相及樣品中的有害組分，可經(jīng)常更換，起到保護(hù)延長(zhǎng)分析柱的作用，加保護(hù)柱雖然柱效有所損失，但在經(jīng)濟(jì)和實(shí)用方面是有益的。1314保護(hù)柱使用要點(diǎn)選用與分析柱同樣種類但粒度大的填料不同廠家的產(chǎn)品存在差異，盡量使分析柱和保護(hù)柱的填料來自于同一廠家

保護(hù)柱與分析柱之間的距離盡量短保護(hù)柱只是保護(hù)分析柱，不能取代樣品處理定期更換保護(hù)柱保護(hù)柱不能重復(fù)使用，分析柱，尤其是反相柱需要定期清洗15何時(shí)更換保護(hù)柱壓力增高柱效降低、分辨率降低，對(duì)稱性變差基線漂移、出現(xiàn)鬼峰、雙峰等164.檢測(cè)器

檢測(cè)器是色譜儀的眼睛，裝在色譜柱的出口用于連續(xù)檢測(cè)流出液的樣品組分。檢測(cè)器實(shí)際上是一種換能裝置,即將流動(dòng)相中組分含量的變化,轉(zhuǎn)變成可測(cè)量的電信號(hào)(通常是電壓),然后輸入記錄器。從原理分析，任何一種分析鑒定方法都可能色譜檢測(cè)器。對(duì)檢測(cè)器的要求是：靈敏度高，重復(fù)性好、線性范圍寬、死體積小以及對(duì)溫度和流量的變化不敏感等。17檢測(cè)器紫外檢測(cè)器示差折射檢測(cè)器熒光檢測(cè)器電化學(xué)檢測(cè)器

1819紫外檢測(cè)器紫外吸收檢測(cè)器其檢測(cè)原理和UV-Vis方法一樣。只是，此時(shí)所采用的吸收池為微量吸收池，通常其光程為2-10mm,體積約為1~10

L。具有靈敏度高，線性范圍寬，對(duì)流速和溫度不敏感等特點(diǎn)，它是液相色譜最常用的檢測(cè)器。HPLC分析中，約有80%的物質(zhì)可以用紫外吸收檢測(cè)器檢測(cè)。。在實(shí)際工作，紫外檢測(cè)的主要參數(shù)是選擇檢測(cè)波長(zhǎng)，它應(yīng)考慮溶質(zhì)和流動(dòng)相的吸收特性，在選擇測(cè)量波長(zhǎng)時(shí)注意：溶劑必須能讓所選擇的光透過，即所選波長(zhǎng)不能小于溶劑的最低使用波長(zhǎng)固定波長(zhǎng)型可變波長(zhǎng)型二極管陣列

20固定波長(zhǎng)型結(jié)構(gòu)緊湊造價(jià)底操作維修方便靈敏度高適用于梯度洗脫21可變波長(zhǎng)型紫外可見分光選擇性大22二極管陣列

同時(shí)檢測(cè)全波長(zhǎng)的信號(hào)定量的同時(shí)也可光譜定性23波長(zhǎng)可的松氟美松皮質(zhì)酮快速掃描—光電二極管陣列（PDA）檢測(cè)所獲得的三維色譜-光譜圖24252627示差折射檢測(cè)器示差折射檢測(cè)器是通過連續(xù)監(jiān)測(cè)參比池和測(cè)量池中溶液的折射率之差來測(cè)定溶質(zhì)濃度。由于折射率是物質(zhì)的通用性質(zhì)，示差折射檢測(cè)器是一種通用型的整體性質(zhì)檢測(cè)器

28

原理：利用兩束相同角度的光照射溶劑相和樣品+溶劑相，利用二者對(duì)光的折射率不同，其中一束（通常是通過樣品+溶劑相）光因?yàn)榘l(fā)生偏轉(zhuǎn)造成兩束光的強(qiáng)度差發(fā)生變化，將此差示信號(hào)放大并記錄，該信號(hào)代表樣品的濃度。為通用型檢測(cè)器，靈敏度為10-7g/mL。但對(duì)溫度變化敏感(0.00X℃），且不適于梯度淋洗。光源調(diào)零光學(xué)零參比樣品平面鏡透鏡光電轉(zhuǎn)換記錄儀放大器遮光板29熒光檢測(cè)器熒光檢測(cè)器是一種很靈敏的,有選擇性的檢測(cè)器,其靈敏度比UV高10~1000倍,一般可測(cè)ppb級(jí)的化合物。它用于檢測(cè)物質(zhì)本身具有熒光或?yàn)榱颂岣哽`敏度將無熒光的物質(zhì)衍生成熒光體。可用熒光檢測(cè)的物質(zhì)：如某些代謝物、食品、藥物、氨基酸、多肽、胺類、維生素、石油高沸點(diǎn)餾分、生物堿和甾族化合物等。

3031電化學(xué)檢測(cè)器對(duì)于具有電活性的物質(zhì),在液相色譜中可采用電化學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)。它包括電導(dǎo)庫侖、安培、極譜、電位和光電導(dǎo)等形式,其中,用得最多和最成功的是安培檢測(cè)器

32安培檢測(cè)器由恒電位儀和一薄層反應(yīng)池（體積為1~5

L）組成。如圖。該檢測(cè)器是利用待測(cè)物流入反應(yīng)池時(shí)在工作電極表面發(fā)生氧化或還原反應(yīng)，兩電極間就有電流通過，此電流大小與待測(cè)物濃度成正比。采用安培檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相必須含有電解質(zhì)，且呈化學(xué)隋性。它最適于與反相色譜匹配。但此檢測(cè)器只能檢測(cè)具有電活性的物質(zhì)。33液相色譜常用檢測(cè)器的一般性質(zhì)

檢測(cè)器

選擇性

梯度洗脫

線性范圍

檢測(cè)限(g/ml)

敏感性

對(duì)流速

對(duì)溫度

紫外

紫外吸收

可以

105

2×10－10

不敏感

低

示差

通用型不行1042×10－7

不敏感

10－4

熒光

發(fā)熒光物質(zhì)

可以

103

10－11

不敏感

低

電化學(xué)

電活性

不行106

10－12

敏感

1.5%

34色譜數(shù)據(jù)處理和色譜工作站

早期的色譜儀采用記錄儀，通常是一種電子電位差計(jì)來記錄色譜圖。由色譜圖量取兩