《rna干擾機(jī)制》課件

RNA沉默的定義

RNA沉默是指由雙鏈RNA（dsRNA）誘發(fā)的同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。生物學(xué)現(xiàn)象來定義：生物技術(shù)來定義：人為地引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA,從而誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因的mRNA降解,達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的。

RNA沉默是指由雙鏈RNA（dsRNA）誘發(fā)的同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。生物學(xué)現(xiàn)象來定義：生物技術(shù)來定義：人為地引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA,從而誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因的mRNA降解,達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的。

RNA沉默是指由雙鏈RNA（dsRNA）誘發(fā)的同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。生物學(xué)現(xiàn)象來定義：生物技術(shù)來定義：人為地引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA,從而誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因的mRNA降解,達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的。

1精選課件ppt基因沉默現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)1990年，Jorgensen等將產(chǎn)生色素的基因?qū)氚珷颗Ｖ校噲D加深花朵的顏色，結(jié)果很多花沒有變成深紫色，反而成了花斑的甚至白的。表明不僅導(dǎo)入的基因未表達(dá)，而且本身同源的基因失活。從而發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因植物中存在基因表達(dá)的共抑制現(xiàn)象，即轉(zhuǎn)入的外源基因和本身的同源基因都被抑制，出現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象。2精選課件ppt父本轉(zhuǎn)基因后代圖1.GUS基因?qū)氚珷颗：蟮霓D(zhuǎn)基因植株3精選課件ppt1998年Fire等證實(shí)，將制備的RNA高度純化后發(fā)現(xiàn)，單鏈RNA的基因抑制作用很微弱，而用純化后的dsRNA卻能高效、特異地阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證明雙鏈RNA抑制基因的表達(dá)的效率比純化后的反義RNA至少高幾個(gè)數(shù)量，他們稱此現(xiàn)象為dsRNA介導(dǎo)的RNA干擾（RNAi）4精選課件pptRNA沉默的作用機(jī)制dsRNA在Dicer酶的作用下，被切割加工成21~25nt的雙鏈siRNA激活的RISC將siRNA的雙鏈解開，并通過堿基互補(bǔ)配對(duì)識(shí)別互補(bǔ)的mRNA，然后切割靶mRNA。siRNA結(jié)合一個(gè)酶復(fù)合物形成RISC5精選課件ppt植物病毒編碼的沉默抑制因子

RNA沉默抑制子的發(fā)現(xiàn)1997年，馬鈴薯X病毒屬與馬鈴薯Y病毒屬間的協(xié)同效應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯X病毒屬編碼的HC-Pro蛋白在協(xié)生中起致病增強(qiáng)的作用，HC-Pro蛋白可能充當(dāng)RNA沉默的抑制子。1998年，三個(gè)獨(dú)立的小組采用不同的方法證實(shí)了這一推測(cè)。6精選課件pptRNA沉默抑制子的作用機(jī)理抑制病毒siRNA的產(chǎn)生阻礙siRNA整合入RISC干擾RISC降解同源的mRNA

主要的三種作用方式7精選課件ppt沉默抑制子的主要鑒定方法基因沉默的回復(fù)用攜帶待鑒定基因的病毒載體接種報(bào)告基因已經(jīng)發(fā)生沉默的轉(zhuǎn)基因植物，觀察病毒載體引起的癥狀是否加重和報(bào)告基因能否回復(fù)表達(dá)。農(nóng)桿菌浸潤(rùn)GFP系統(tǒng)沉默接種帶有待鑒定基因的病毒載體農(nóng)桿菌浸潤(rùn)農(nóng)桿菌浸潤(rùn)農(nóng)桿菌浸潤(rùn)接種帶有待鑒定基因的病毒載體農(nóng)桿菌浸潤(rùn)接種帶有待鑒定基因的病毒載體農(nóng)桿菌浸潤(rùn)8精選課件pptABCDA.GFP在煙草中大量表達(dá)；B.攜帶嵌入GFP的雙向質(zhì)粒的農(nóng)桿菌誘導(dǎo)的GFP基因沉默；C.PVY感染GFP發(fā)生沉默的煙草；D.帶有PVYHC-Pro基因的PVX病毒載體感染GFP發(fā)生沉默的煙草。紫外燈下觀察GFP為綠色熒光9精選課件ppt農(nóng)桿菌共浸潤(rùn)瞬時(shí)抑制試驗(yàn)構(gòu)建分別含有報(bào)告基因和抑制子基因的兩種農(nóng)桿菌質(zhì)粒后將含有兩種這兩種質(zhì)粒的農(nóng)桿菌混合注射植物葉片上，再跟蹤觀察注射區(qū)域的報(bào)告基因的表達(dá)情況。如果候選基因具有抑制子活性，報(bào)告基因的表達(dá)會(huì)持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間，反之報(bào)告基因很快被沉默。此方法快速、簡(jiǎn)單，已被普遍應(yīng)用，可用來快速、大量地篩選抑制子。HC-ProCMV2bRGDVPns11空載體RGDVPns11抑制局部GFP沉默帶有35S-GFP的農(nóng)桿菌與帶有相應(yīng)質(zhì)粒的農(nóng)桿菌混合后共滲透接種轉(zhuǎn)基因本生煙16c，接種6天后在長(zhǎng)波紫外燈下觀察GFP熒光。10精選課件ppt功能互補(bǔ)法

利用有抑制功能的抑制子來代替候選抑制子的一種方法。如，BSMV的b蛋白去除后病毒致病力下降，檢測(cè)表明由RNA沉默引起。但這個(gè)突變株在轉(zhuǎn)PVA的HC-Pro基因的植株內(nèi)表現(xiàn)很強(qiáng)的致病力。并且用HC-Pro替換b基因的重組病毒也能引起很強(qiáng)的致病力，同時(shí)RNA沉默的標(biāo)志物siRNA也消失了。