免疫組織化學(xué)染色技術(shù)

免疫組織化學(xué)染色技術(shù)第一節(jié)常規(guī)組織學(xué)染色技術(shù)概述宏觀微觀超微構(gòu)造基因程度組織形狀學(xué)研討技術(shù)的種類：一、病理大體組織標(biāo)本的染色方法在標(biāo)本制造中，為了某種特殊目的，突出顯示標(biāo)本的重要部分，借助組織切片的特殊染色方法對(duì)標(biāo)本進(jìn)展染色，將病變器官及不同組織成分用染料染成不同的顏色，以便于區(qū)分大體標(biāo)本的不同成分和病變特點(diǎn)，如：脂肪組織染色法目的：主要用于心、肝、腎脂肪變性，動(dòng)脈粥樣硬化大體標(biāo)本的染色試劑：蘇丹Ⅲ或蘇丹Ⅳ結(jié)果：病變處脂肪組織呈橙黃色早期心肌梗死染色法目的：顯示早期心肌梗死的區(qū)域試劑：0.1%NBT(硝基四唑藍(lán))/0.2mol/LPBS(pH7.6)方法：將2-3mm厚新穎心肌大片放入試劑中，37°C孵育20min。結(jié)果：正常心肌呈藍(lán)色，早期心肌梗死區(qū)、纖維結(jié)締組織、瘢痕組織呈淺藍(lán)色或不顯色。留意：新穎標(biāo)本，尸檢心肌不超越6小時(shí)。二、光學(xué)顯微鏡下的組織學(xué)染色方法常規(guī)HE染色〔hematoxylinandeosinstaining〕組織學(xué)特殊染色1.Mallory三染色、Masson三染色2.神經(jīng)纖維的鍍銀染色3.其他的特殊染色，包括鈣、鐵、鉛、銅、黑色素和脂褐素、細(xì)胞DNA和RNA的染色等上述的各種染色方法只能在細(xì)胞程度上顯示組織構(gòu)造的形狀改動(dòng)。三、超微構(gòu)造的察看光線波長(zhǎng)的限制，光學(xué)顯微鏡的分辨率極限為0.2m有效放大倍數(shù)最高不超越2000倍。電鏡的分辨率最正確可達(dá)0.14nm，放大倍率最高可達(dá)100萬(wàn)倍。第二節(jié)免疫組織化學(xué)染色技術(shù)Immunohistochemicaltechnique該技術(shù)主要是用于研討和察看細(xì)胞中的某些構(gòu)造或分子物質(zhì)和組織細(xì)胞間的成分，因此現(xiàn)又稱為免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。根據(jù)標(biāo)志物的不同，免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)可分為：1.免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)2.免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)3.免疫鐵蛋白技術(shù)4.免疫金-銀細(xì)胞化學(xué)技術(shù)5.免疫電子顯微鏡技術(shù)一、免疫組織化學(xué)染色方法的原理抗原〔antigen〕1.定義：是一類在適宜條件下能激發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)對(duì)，并能與免疫應(yīng)對(duì)產(chǎn)生的效應(yīng)物質(zhì)〔抗體和效應(yīng)細(xì)胞〕在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合反響的物質(zhì)。抗原具有兩種性能：〔1〕免疫原性〔immunogenicity〕指抗原分子具有誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)對(duì)的特性?！?〕反響原性〔reactogenicity〕指抗原分子與抗體或效應(yīng)T細(xì)胞等免疫應(yīng)對(duì)產(chǎn)物發(fā)生特異性反響的特性。2.抗原的分類完全抗原、半抗原免疫學(xué)分類胸腺依賴抗原與非依賴抗原外源性抗原：微生物、花粉等內(nèi)源性抗原：隱蔽的本身抗原、腫瘤相關(guān)抗原等臨床分類同種異型抗原：人類白細(xì)胞抗原、血型抗原異嗜性抗原：人與其他動(dòng)物、植物等之間存在的共同抗原抗體〔antibody〕1.定義：機(jī)體遭到抗原刺激后，經(jīng)過(guò)體液免疫應(yīng)對(duì)，B淋巴細(xì)胞活化、增殖，分化為漿細(xì)胞，由漿細(xì)胞合成并分泌的僅與該抗原發(fā)生特異性反響的球蛋白，稱為抗體。大部分抗體電泳后位于區(qū)帶，1972年國(guó)際免疫學(xué)結(jié)合會(huì)正式將化學(xué)構(gòu)造一樣或類似的一類球蛋白分子一致命名為免疫球蛋白(immunoglobin，Ig)。2.抗體的種類:五類，即IgA、IgD、IgE、IgG、IgM免疫組織化學(xué)染色技術(shù)中，運(yùn)用的抗體主要是IgG，個(gè)別情況下運(yùn)用IgG的亞型，多為IgG1。免疫組織化學(xué)染色的反響原理及顯色原理1.免疫組織化學(xué)染色的反響原理染色反響的最根本原理是抗原抗體的反響。經(jīng)過(guò)對(duì)針對(duì)標(biāo)本中相應(yīng)抗原的抗體上標(biāo)志某種發(fā)色劑或酶類，再經(jīng)過(guò)激發(fā)發(fā)色劑或運(yùn)用某種顯色劑，在顯微鏡下使標(biāo)本中抗原抗體反響的部位產(chǎn)生肉眼可察看到的顏色以確定所要檢測(cè)的抗原能否存在。經(jīng)過(guò)免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，在光學(xué)顯微鏡下即可檢測(cè)到所要研討的蛋白分子類物質(zhì)的存在與否。2.免疫組織化學(xué)染色的顯色原理(1)根本原理熒光標(biāo)志或酶標(biāo)抗體的染色分為直接法和間接法。其中以酶標(biāo)抗體法運(yùn)用最為廣泛。直接法：是將酶直接標(biāo)志在第一抗體上，用酶標(biāo)抗體與切片上待檢測(cè)的組織或細(xì)胞中抗原反響，再用底物顯色，顯示出所檢測(cè)的目的抗原的部位。間接法：是將酶標(biāo)志在第二抗體或與第二抗體具有親和性的某種分子上，檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的特異性抗原物質(zhì)。間接法中所用的一抗是針對(duì)組織或細(xì)胞中某種抗原的特異性抗體，多數(shù)抗體是由家兔制備的多克隆抗體或由小鼠制備的單克隆抗體。第二抗體是第一抗體的抗體，所以只需不同的第一抗體均來(lái)自同一種屬動(dòng)物，與標(biāo)志的第二抗體結(jié)合就能用來(lái)顯示不同特異性抗原的存在。這樣可防止直接法中標(biāo)志每一種第一抗體的費(fèi)事。經(jīng)過(guò)某種技術(shù)添加第二抗體上標(biāo)志酶的含量，可提高免疫組織化學(xué)染色的敏感度。IHC技術(shù)中，絕大多數(shù)以間接法為常用?！?〕顯色的根本程序1抗孵育切片或細(xì)胞涂片2抗〔酶標(biāo)抗體〕孵育切片發(fā)色劑顯色〔核復(fù)染〕〔3〕酶標(biāo)抗體法的顯色原理及顯色劑辣根過(guò)氧化物酶〔horseradishperoxidase，HRP〕HRP+H2O2HRP·H2O2HRP·H2O2+DH2HRP+D+2H2OHRP催化的酶促反響第一步是特異的，其他反響是非特異的，因此，可選用各種供氫體作為顯色劑，可使反響的終產(chǎn)物呈現(xiàn)不同的顏色，如：CN為藍(lán)色TMB為深藍(lán)色AEC為紅色DAB為棕色堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)以AS-Mx〔色酚AS-MX磷酸鹽〕為底物，F(xiàn)B/FR(Fastblue/Fastred)為發(fā)色劑，生成藍(lán)色/紅色不容性沉淀物。ALP標(biāo)志的抗體主要用于內(nèi)源性過(guò)氧化物酶含量較高的血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等的ICC染色。由于組織細(xì)胞內(nèi)含有內(nèi)源性ALP，在顯色液中需參與終濃度為2-4mol/L的左旋咪唑(levamisole)，大多數(shù)內(nèi)源性ALP活性可被抑制。葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase，GOD)以葡萄糖為底物的酶，其顯色方法為-D-葡萄糖67mg、NBT6.7mg、PMS(吩嗪硫酸甲酯,phenazinemethyl-sulfate)0.167mg、0.05mol/LPBS(pH8.2)10.0ml，37oC孵育1小時(shí)，生成藍(lán)色不溶性沉淀物，該終產(chǎn)物不溶于有機(jī)溶劑，切片可經(jīng)脫水、透明后封片，長(zhǎng)期保管?！?〕核復(fù)染在顯色后，特別是用DAB顯色后，切片可用蘇木素染料進(jìn)展核復(fù)染，經(jīng)水化后細(xì)胞核顯示藍(lán)色，與胞質(zhì)中的DAB棕色構(gòu)成對(duì)比。但用AEC顯色后不能用蘇木素做核復(fù)染，由于配制蘇木素染料中運(yùn)用酒精作為介質(zhì)，可使AEC的紅色終產(chǎn)物褪色，且AEC顯色后只能用水溶性封固劑封片。第三節(jié)免疫組織化學(xué)染色步驟〔一〕ABC或SP法進(jìn)展石蠟切片染色的主要步驟1.組織資料的采??；2.組織塊的固定；3.組織塊的脫水、透明及石蠟包埋；4.石蠟切片的制備；5.石蠟切片的脫蠟及水化；6.抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；7.PBS洗滌切片；8.抗原修復(fù)或蛋白酶消化切片，修復(fù)或暴露抗原；9.PBS洗滌切片；10.用與二抗來(lái)源一樣的動(dòng)物非免疫正常血清〔或同時(shí)參與BSA〕孵育切片，防止抗體的非特異性吸附；11.用特異性一抗(單克隆、多克隆)孵育切片；12.PBS〔可參與Tween20#，PBST〕洗滌切片；13.用針對(duì)一抗的生物素化的二抗孵育切片；14.用PBS或PBST洗滌切片；15.滴加SP試劑或ABC試劑；16.PBS或PBST洗滌切片；17.DAB或AEC顯色；18.自來(lái)水洗滌切片，終止顯色；19.用蘇木素做核復(fù)染；20.切片脫水、透明，樹(shù)膠封片?！捕掣魅旧襟E的詳細(xì)操作及本卷須知1.組織資料的采取活檢組織組織標(biāo)本手術(shù)切除標(biāo)本尸檢標(biāo)本實(shí)驗(yàn)組織或培育細(xì)胞活檢組織：宮頸、鼻咽、口腔、喉、皮膚和內(nèi)窺鏡鉗取的組織體積小，因活檢鉗直接鉗取，常受壓過(guò)度而變性，因此，活檢鉗的刃口必需銳利，以免組織受壓，活檢時(shí)應(yīng)采取主要的病灶區(qū)?？乖诮M織中的分布不均一，故病灶較大的切除標(biāo)本應(yīng)思索切取主要病灶。病灶與正常組織交界區(qū)及遠(yuǎn)距病灶的正常區(qū)。尸檢組織由于取材時(shí)普通均已超越死亡后2小時(shí)以上，組織有不同程度自溶，其抗原或變性消逝或有嚴(yán)重的彌散景象。法醫(yī)尸檢普通多在24小時(shí)以上，甚至數(shù)月后，檢材受死后變化影響嚴(yán)重，而影響染色結(jié)果。手術(shù)切除的組織較新穎，取材后應(yīng)立刻固定，以保管組織構(gòu)造和抗原。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)本新穎，可按需求取材；很多情況下是在灌流固定后取材，組織構(gòu)造和抗原堅(jiān)持良好，非常適用于免疫組織化學(xué)染色。取材標(biāo)本的大小尸檢組織資料大小以1cm1cm0.2cm為宜。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常用大鼠或小鼠，其臟器體積小，有利于取材。普通標(biāo)本體積不宜過(guò)大，防止固定不透，影響抗原的保管，也浪費(fèi)試劑。2.組織塊的固定、水洗〔1〕固定液：種類較多，常用的有以下2種：4%甲醛/PBS(pH7.2-7.4)配制方法：10ml40%甲醛(formalin)+90mlPBS運(yùn)用新穎甲醛，久存甲醛可分解，構(gòu)成白色沉淀(多聚甲醛)，還可構(gòu)成甲酸，影響染色結(jié)果。(可以用粉筆溶)4%多聚甲醛/PBS(pH7.2-7.4)配制方法：40g多聚甲醛(paraformaldehyde)+500ml0.1mol/LPB(pH7.2-7.4)，攪拌、加熱至60oC，同時(shí)滴入1NNaOH至溶液完全透明。冷卻后用1NHCl調(diào)PH值至7.2-7.4，再用0.1mol/LPB將溶液加至1000ml。?固定時(shí)間：普通根據(jù)組織塊大小及性質(zhì)，固定2-24小時(shí)。?固定原理：甲醛經(jīng)過(guò)使蛋白分子發(fā)生交聯(lián)而產(chǎn)生固定作用。甲醛與蛋白質(zhì)中的許多氨基酸反響，并能保管脂類和類脂體。?不利作用：甲醛使組織中蛋白分子發(fā)生交聯(lián)，使所檢測(cè)的抗原決議簇被封鎖，影響抗原抗體的結(jié)合?！?〕水洗沖洗時(shí)間與標(biāo)本的種類、組織塊的大小和固定時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。尸檢組織和大動(dòng)物組織普通沖洗24小時(shí)，小動(dòng)物組織沖洗2-10小時(shí)。新穎標(biāo)本固定時(shí)間短，沖洗時(shí)間也相應(yīng)縮短，固定時(shí)間長(zhǎng)的標(biāo)本，沖洗時(shí)間也需延伸。沖洗時(shí)組織放在廣口瓶中，瓶口用紗布罩好并扎緊，防止組織塊漏出。用一根適當(dāng)?shù)哪z管，一端接自來(lái)水，一端插入瓶底，使水緩慢流出，或?qū)⒔M織塊放入洗滌筐中，放在水盆內(nèi)沖洗。對(duì)于過(guò)小組織或穿刺組織和小動(dòng)物組織多次換水浸泡即可。3.組織塊的脫水、透明、浸蠟和包埋〔1〕脫水脫水劑：酒精、丙酮、異丙醇、正丁醇，最常用酒精。酒精可以與水以任何比例混合，脫水才干強(qiáng)，并可硬化組織。酒精對(duì)組織的穿透速度很快，對(duì)組織有較明顯的收縮作用。為防止組織過(guò)度收縮，應(yīng)從低濃度開(kāi)場(chǎng)，然后再依次添加其濃度。在常溫下或4oC下進(jìn)展，以減少抗原的損失。70%80%90%95%100%100%〔2〕透明為使石蠟?zāi)芙虢M織塊，組織經(jīng)脫水后，必需經(jīng)過(guò)一種既能與酒精相溶，又能溶解與石蠟的溶劑。經(jīng)過(guò)溶劑的媒介作用而到達(dá)石蠟浸入組織塊的目的。透明劑：二甲苯、苯、甲苯、氯仿等，最常用二甲苯。普通經(jīng)過(guò)2～3次純二甲苯溶液透明，每次10～15分鐘，同時(shí)應(yīng)根據(jù)組織的種類和組織塊大小以及二甲苯的新穎程度加以調(diào)整，不應(yīng)機(jī)械照搬?！?〕浸蠟組織塊經(jīng)透明后在熔化的石蠟內(nèi)浸漬的過(guò)程稱浸蠟。為使石蠟充分滲入組織只，常需經(jīng)過(guò)2-3次石蠟浸漬。用于免疫組織化學(xué)染色的組織塊浸蠟應(yīng)運(yùn)用低溫蠟，在60oC以下浸透。〔4〕包埋浸蠟后的組織塊放入包埋盒中，將熔化的石蠟到入包埋盒，冷卻后取出，修塊。4.石蠟切片的制造〔1〕載玻片涂片的制造防脫片劑：3-氨基丙基三乙氧基硅烷〔3-aminopropyltriethoxysilane,APES〕、多聚賴氨酸〔Poly-L-lysine〕、甲醛-甘油明膠。APES涂片的制造原理：APES是一種新型玻片粘附劑，與普通的粘附劑不同，它是經(jīng)過(guò)對(duì)玻璃外表起化學(xué)修飾作用，改動(dòng)其外表的化學(xué)物理特性，使組織切片結(jié)實(shí)地貼于玻璃片上，不易零落，保管時(shí)間較久。詳細(xì)操作方法：將載玻片用酸處置后，用95%酒精浸泡，再用綢布擦干，去除外表的污漬；將干凈的載玻片放入丙酮內(nèi)5min；將載玻片用鑷子夾住浸入APES試劑〔1mlAPES+50ml丙酮〕1-2次；純丙酮內(nèi)洗2次后，37oC過(guò)夜，枯燥；用鋁箔包好，室溫下存放，可存放半年。多聚賴氨酸〔Poly-L-lysine，PLL〕試劑配制：PLL0.5g+蒸餾水100ml也可根據(jù)提供的方法配制?？捎?oC或-20oC保管備用，可反復(fù)凍存，效果無(wú)明顯影響。涂片前將其稀釋10-50倍，均勻涂在處置后干凈的載玻片上，37oC下枯燥過(guò)夜。甲醛-甘油明膠試劑：40%甲醛2.5ml，明膠0.5g，蒸餾水加至100ml。配制方法：用一部分蒸餾水〔約80ml〕加熱溶解明膠，待完全溶化后參與甲醛，最后補(bǔ)充蒸餾水至100ml，混勻即可。粘附切片的效果較上述兩種方法差，特別是切片經(jīng)抗原熱修復(fù)或酶消化后，有時(shí)易脫片?！?〕制做切片切片機(jī)：旋轉(zhuǎn)式或滑動(dòng)式切片機(jī)。切片厚度：5-7m。展片：切片放入玻璃平皿中的溫水中展開(kāi)切片〔水浴鍋上加熱平皿〕。撈片：用涂有防脫片劑的載玻片撈取切片。切片枯燥：37oC過(guò)夜，枯燥。5．石蠟切片的脫臘及水化脫蠟：將切片放入染色筐中，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各15分鐘脫臘，水化：100%酒精Ⅰ、Ⅱ中各10分鐘、95%ALC5分鐘、90%ALC5分鐘、80%ALC5分鐘、70%ALC5分鐘，蒸餾水浸洗。6．去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性由于常規(guī)免疫組織化學(xué)染色的最后顯色是用辣根過(guò)氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)和DAB(3,3-diaminobenzidinetetrahydrochloride)，而組織中常含有內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，為防止出現(xiàn)假陽(yáng)性反響和減少背景染色，需求先去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。染色框詳細(xì)方法：將切片置入甲醇(PBS)-H2O2液中20~30分鐘試劑：純甲醇99ml30%，H2O21ml充分混勻，使最后濃度為0.3%，或0.01mlPBS(pH7.2~7.4)99ml30%H2O21ml7．PBS洗滌切片經(jīng)甲醇-H2O2或PBS-H2O2處置后的切片先用蒸餾水洗一次5min，再用PBS洗5min×3次。0.01mol/LPBS(pH7.2~7.4)的配制：NaH2PO42H2O0.45gNa2HPO412H2O3.23gNaCl8.0g蒸餾水加至1000ml為防止抗體與組織發(fā)生靜電吸附而產(chǎn)生非特異性染色，可在PBS中參與Tween20#，制成含0.1%Tween20#的PBS。Tween20#為一種除污劑，可去除和封鎖組織中的靜電荷。8．抗原修復(fù)〔antigenretrieval,AR〕某些抗原的免疫組化染色不需求此步驟即可染色，如橫紋肌中的myoglobin(Mb)、actin、myosin、腦組織中的S-100蛋白、GFAP、血型抗原A、B、H、生長(zhǎng)激素(growthhormone)、胰島素、波形蛋白(vimentin)、降鈣素(calcitonin)等。但有一部分抗原物質(zhì)或檢測(cè)的因子等由于組織經(jīng)甲醛固定后，因蛋白質(zhì)的交聯(lián)，將抗原封鎖或發(fā)生變性，因此需求熱修復(fù)或蛋白酶消化。目前機(jī)理清楚，但是以高溫、高壓對(duì)常規(guī)固定的石蠟切片進(jìn)展抗原修復(fù)處置閱歷闡明，可以提高抗原抗體陽(yáng)性檢測(cè)率，同時(shí)也會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性，現(xiàn)已廣泛用于技術(shù)中。尤其對(duì)原來(lái)僅表達(dá)在冰凍切片上的抗原，利用后大部分抗體能用于常規(guī)甲醛固定的石蠟切片上?！?〕抗原熱修復(fù)方法①微波中96℃10~20min②直接加熱法100℃10min③高壓鍋/消毒鍋120℃10min其他：水浴鍋100℃10min×2及真空加熱10min等。熱修復(fù)的介質(zhì)①0.01mol/LpH6.0檸檬酸緩沖液②0.05mol/LTris-HCl緩沖液(pH1~12)③0.01mol/LpH7.0PBS④2%硫酸鋁⑤2%硝酸鉛⑥生理鹽水⑦蒸餾水溶液的摩爾濃度對(duì)修復(fù)效果無(wú)任何影響，而pH值那么影響較大，緩沖液以檸檬酸緩沖液和Tris-HCl緩沖液較常用。溫度與修復(fù)時(shí)間的關(guān)系：許多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果闡明：溫度高修復(fù)時(shí)間短，如Ki-67和P-gp的檢測(cè)，利用同一切片，到達(dá)一樣染色結(jié)果需求：①100℃20min；②90℃30min；③80℃50min；④70℃20h操作流程①微波處置：將切片插入25片塑料架上，在250ml塑盒內(nèi)參與200ml緩沖液，將微波高檔加溫緩沖液至90℃+，取出后自然冷卻至室溫后蒸餾水洗，PBS洗。②水浴鍋法：一種傳統(tǒng)的抗原修復(fù)方法，首先調(diào)理水溫達(dá)95℃左右，將切片置入內(nèi)含200ml緩沖液的塑料盒或燒杯內(nèi)，放入水浴鍋，溫度平衡后開(kāi)場(chǎng)計(jì)算時(shí)間20min，取出容器后自然冷卻到室溫。③壓力鍋法：不銹鋼高壓鍋內(nèi)參與一定量的緩沖液，加熱鍋使液體煮沸，將切片參與切片架并置入鍋內(nèi)，蓋上鍋蓋，不加閥，開(kāi)場(chǎng)冒氣計(jì)時(shí)50min，封鎖氣閥，使之加壓10min。再將壓力鍋置于流水槽中沖洗10min，冷卻后取出切片，PBS洗。最正確修復(fù)方法的選擇選擇最正確的修復(fù)方法設(shè)計(jì)表檸檬酸BufferpH12pH6pH10-11Tris-HClBufferpH12pH7-8pH10-11微波100℃10min×2slide1slide2slide3壓力鍋120℃10minslide4slide5slide6微波或水浴90℃30minslide7slide8slide9slide10作對(duì)照，不作任何處置抗原熱修復(fù)應(yīng)留意的問(wèn)題有些抗體在石蠟或冰凍切片上呈陰性反響，但石蠟切片用抗原修復(fù)后卻能很好顯示，對(duì)某些應(yīng)表達(dá)在胞漿或膜上的抗原，經(jīng)修復(fù)后，絕大部分表達(dá)在核內(nèi)。而有些表達(dá)在核內(nèi)的抗原經(jīng)修復(fù)后會(huì)出如今胞漿內(nèi)，因此，在運(yùn)用該方法時(shí)一定要小心，對(duì)結(jié)果的斷定也要做出客觀的分析，同時(shí)在操作過(guò)程中還留意以下問(wèn)題：

①熱處置后應(yīng)自然冷卻切片。②不能煮干修復(fù)液。③不要任何抗原的檢測(cè)都運(yùn)用該方法。④一批抗原的檢測(cè)其溫度和時(shí)間應(yīng)堅(jiān)持一致。⑤普通經(jīng)高溫修復(fù)后胞漿無(wú)明顯的破壞，但對(duì)細(xì)胞核的影響較大，會(huì)出現(xiàn)核破裂，蘇木素淡染景象。⑥假設(shè)在常用的緩沖〔修復(fù)〕液中無(wú)法實(shí)現(xiàn)抗原修復(fù)，得不出好的染色結(jié)果，或經(jīng)修復(fù)后，抗原定位發(fā)生改動(dòng)，可改用一些不常用的緩沖液或加一些鰲合劑，如EDTA或EGTA等能夠獲得較好的效果?！?〕蛋白酶消化法原理：蛋白酶消化可以去除覆蓋在抗原決議簇外表的雜蛋白，更為重要的是因甲醛固定而引起的交聯(lián)被酶消化翻開(kāi)而引起暴露抗原決議簇的作用，使第一抗體能與抗原部分結(jié)合，提高陽(yáng)性檢測(cè)率。本卷須知：用于IHC切片消化的酶有多種，所選擇酶的種類、運(yùn)用的濃度、pH值、消化時(shí)間及溫度等均要視組織固定的不同、所檢測(cè)抗原的性質(zhì)、組織類型的不同而異，經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。常用的消化酶類：胰蛋白酶和蛋白酶K：檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗原切片的消化，如Keratin、CEA、GFAP等。胃蛋白酶：細(xì)胞間質(zhì)抗原檢測(cè)切片的消化，如纖連蛋白(fibronectin)，各型膠原等。消化時(shí)間及溫度：普通消化時(shí)間與組織固定的長(zhǎng)短呈正比。蛋白酶的消化時(shí)間5~10~20min，視切片固定時(shí)間的長(zhǎng)短而定?！?〕酶消化液的配制除了商業(yè)銷售的廢品，可按闡明書(shū)運(yùn)用外，還可自行配制。①0.1%胰蛋白酶胰蛋白酶0.1g0.1%氯化鈣(pH7.8)100ml配制方法：先配制0.1%的CaCl2，用0.1mol/L的NaOH將其pH調(diào)至7.8，然后參與胰蛋白酶0.1g，溶解之。用前將胰蛋白酶液過(guò)濾，并在水浴中預(yù)熱至37℃，室溫下消化時(shí)間5~30min，多用于細(xì)胞內(nèi)抗原的暴露。。②0.4%胃蛋白酶胃蛋白酶400mg0.1NHCl100ml多用于間質(zhì)組織免疫組化染色切片的消化，37℃下消化時(shí)間約30min。③0.06%蛋白酶K蛋白酶K0.06g0.05mol/LTris-HCl(PH7.5)100ml用法同上。在免疫組化染色中，有時(shí)經(jīng)過(guò)度固定的標(biāo)本，影響一抗與抗原的結(jié)合，用蛋白酶溶液消化，起到暴露抗原部分的作用。消化時(shí)間應(yīng)根據(jù)不同組織而異?？傊?，在堅(jiān)持組織形狀不破壞的前提下，宜盡量消化時(shí)間延伸。以上三種酶消化液，以第一種最為常用。9.經(jīng)熱修復(fù)抗原或蛋白酶消化的切片經(jīng)洗滌后進(jìn)展下一步。10.用與制備二抗一樣的動(dòng)物非免疫血清孵育切片防止一抗的非特異性吸附。組織中非抗原抗體反響出現(xiàn)的陽(yáng)性染色稱為非特異性背景染色。最常見(jiàn)的緣由是蛋白(第一抗體)吸附于高電荷的膠原和結(jié)締組織成分上。最有效的方法是在用第一抗體孵育切片前，用與制備第二抗體一樣動(dòng)物的非免疫血清封鎖組織上帶電荷基團(tuán)，而除去與第一抗體的非特異性結(jié)合(在室溫下進(jìn)展)。非免疫血清的稀釋度1:5~1:20，還可參與BSA(bovineserumalbumin)使稀釋后的非免疫血清中含0.1~6%的BSA，可獲得更佳的染色效果，阻止非特異性背景染色。該方法是減少非特異性背景染色的有效方法。11．用特異性一抗孵育切片研討組織細(xì)胞中的某種抗原能否存在，運(yùn)用免疫組化染色，就要選用針對(duì)這種抗原的特異性抗體。如今國(guó)際上有許多公司消費(fèi)免疫組化試劑，包括一抗、二抗、顯色劑，并制成了成套的試劑盒，但普通試劑盒中不包括一抗，研討者可根據(jù)一抗的種屬性，選擇含有與一抗相匹配的二抗的試劑盒。①一抗的種屬來(lái)源一抗可來(lái)源于各種種屬的動(dòng)物，常見(jiàn)是來(lái)自家兔、山羊或小鼠，偶見(jiàn)來(lái)自馬。普通來(lái)自家兔和山羊的一抗都是多克隆的IgG抗體，而來(lái)自小鼠的多是單克隆的IgG抗體。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或標(biāo)本種屬的不同，選擇針對(duì)大鼠、小鼠或人的抗體。②抗體劑型及滴度檢驗(yàn)我國(guó)如今運(yùn)用的多數(shù)抗體等試劑是由國(guó)外進(jìn)口，包括一抗和含二抗的試劑盒。國(guó)外消費(fèi)的一抗普通濃度都是100-200g/ml，但國(guó)內(nèi)各經(jīng)銷商將進(jìn)口的原裝抗體又進(jìn)展了分裝，如分成0.1-0.2ml/瓶等，也經(jīng)銷1ml/瓶抗體，價(jià)錢(qián)各不一樣。國(guó)內(nèi)各經(jīng)銷商又根據(jù)需求將進(jìn)口抗體進(jìn)展稀釋，銷售的種類又分為即用型和濃縮型(進(jìn)口原裝的抗體)兩種。在免疫組化染色中，運(yùn)用即用型一抗和試劑盒普通不需稀釋，直接在切片上滴加即可。濃縮型必需在稀釋后才干運(yùn)用，由于濃縮型抗體濃度高，可引起嚴(yán)重的非特異性染色，因此，必需在正式染色前先用切片對(duì)不同滴度的抗體染色效果進(jìn)展評(píng)價(jià)，選擇濃度強(qiáng)度最好，非特異性反響〔背景染色〕最低的抗體稀釋度來(lái)進(jìn)展正式染色。一抗稀釋滴度的評(píng)價(jià)〔探求實(shí)驗(yàn)條件時(shí)可以稀釋度跨度大一些試〕切片編號(hào)slide1slide2slide3slide4slide5抗體稀釋度1:501:1001:2001:4001:800特異性染色+++++++++++++++背景染色+++++––③一抗體的稀釋普通稀釋一抗的液體與洗滌切片的液體一樣，即0.01mol/LPBSpH7.2-7.4，為進(jìn)一步保證減少背景染色，用于稀釋一抗的PBS中也應(yīng)參與制備二抗的同種動(dòng)物的非免疫正常血清，有條件的還可參與BSA，兩者的濃度在1-2-5%即可。④一抗的孵育時(shí)間及條件參與適當(dāng)稀釋的一抗的切片，可在常溫下或37℃下保溫盒內(nèi)孵育。經(jīng)過(guò)正常二抗同種動(dòng)物非免疫血清孵育后的切片不能用PBS洗滌，在去除多余的非免疫血清后，直接向切片上滴加稀釋好的第一抗體。孵育時(shí)間：30-60分鐘或更長(zhǎng)。假設(shè)待檢的抗原量很少，而添加一抗的濃度又能引起較明顯的背景染色，可添加一抗的稀釋倍數(shù)，將切片放在保濕盒中置于4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜孵育，可到達(dá)稱心的效果。12．PBS洗滌切片將用一抗孵育后的切片用PBST洗滌3次，每次5min，用冷PBS洗滌，可減少非特異性反響。13．用針對(duì)一抗的生物素化二抗孵育切片根據(jù)一抗的種屬來(lái)源，選擇相應(yīng)的二抗。如：一抗是家兔抗某種抗原抗體，二抗普通選用山羊抗家兔IgG抗體。二抗分濃縮型和即用型兩種。即用型二抗不需稀釋，直接運(yùn)用。濃縮型者普通用PBS直接以1:200-400倍稀釋運(yùn)用，室溫下保濕盒內(nèi)孵育30-60min。試劑盒：濃縮型或即用型SP試劑盒、ABC試劑盒試劑盒中包含：內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑二抗的同種動(dòng)物非免疫血清生物素標(biāo)志的抗IgG抗體〔二抗〕SP試劑[ABC試劑〔單獨(dú)購(gòu)買(mǎi)〕]14．PBS洗滌切片5min×3次15．滴加SP試劑或ABC試劑〔1〕生物素-抗生物素染色〔SABC或SP法〕的顯色原理ABC法的染色原理很早以前研討者就留意到給動(dòng)物飼以大量的雞蛋白，會(huì)引起明顯的“維生素H缺乏癥〞，也稱為“蛋白質(zhì)損傷〞。經(jīng)研討發(fā)現(xiàn)，在雞蛋白中含有一種堿性蛋白，分子量為68kD，屬于糖蛋白，當(dāng)時(shí)命名為卵白素〔avidin〕。機(jī)體中還有一種物質(zhì)叫維生素H，又稱為生物素〔biotin〕，是一種小分子的維生素，廣泛分布于動(dòng)植物組織中，以輔酶的方式參與各種羥化酶反響，分子量為244D。卵白素具有4個(gè)同VitaminH〔生物素〕親和力極高的結(jié)合點(diǎn)。給動(dòng)物飼以大量的雞蛋白所致的維生素H缺乏，就是由于卵白素和大量維生素H結(jié)合所致。研討者根據(jù)這兩種物質(zhì)的特點(diǎn)，提出了卵白素-生物素免疫染色系統(tǒng)。由于習(xí)慣上將維生素H稱為生物素，為便于了解，我國(guó)免疫細(xì)胞化學(xué)作者將卵白素稱為抗生物素或親和素，因此卵白素-生物素免疫染色系統(tǒng)又稱為抗生物素-生物素免疫染色法。生物素的另一特點(diǎn)是它可以和抗體IgG的Fc段結(jié)合，不影響IgG的活性。同時(shí)，生物素經(jīng)活化后還可同過(guò)氧化物酶或ALP等結(jié)合，而不影響酶的活性。根據(jù)上述這些抗生物素-生物素的反響原理和特性，1981年許世明設(shè)計(jì)出了免疫組織化學(xué)染色的ABC法〔avidin-biotinperoxidasecomplexmethod，ABC〕，并已制成了商品化的試劑盒。ABC法免疫組化的試劑盒中除包括制備二抗的同一種屬動(dòng)物的非免疫血清、生物素標(biāo)志的二抗外，還包括：A試劑(抗生物素)和B試劑(生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物)。在運(yùn)用前半小時(shí)，將兩種試劑按闡明書(shū)要求相互混合，構(gòu)成復(fù)合物，普通是在5ml的PBS中加一滴A試劑(約50l)，混勻后再加一滴B試劑(約50l)，混勻，半小時(shí)后加至經(jīng)過(guò)生物素標(biāo)志的二抗孵育的切片上，室溫下保濕盒內(nèi)孵育30-60分鐘。SP法的染色原理根本原理與ABC法類似，但與ABC法稍有不同，是采用生物素標(biāo)志的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白銜接的過(guò)氧化物酶及基質(zhì)素混合液來(lái)測(cè)定細(xì)胞和組織中的抗原。BiotinylatedsecondantibodyP-OP-OP-OP-OAntigenBiotinAvidinHRPPrimaryantibodyIllustrationofABCmethodAvidin-biotin-peroxidasecomplexAgAgBiotinStreptavidinEnzyme:HRPorAPPrimaryantibodyBiotinylatedsecondaryantibodyIllustrationofSPmethodSPcomplexSABC法的染色原理及特點(diǎn)(1)根本原理鏈酶親和素是一種從鏈霉菌培育物中提取的蛋白質(zhì)，分子量60kD，不含糖鏈，等電點(diǎn)PI6.0。與親和素一樣也有四個(gè)生物素結(jié)合點(diǎn)，親和力極高。與親和素相比是一種更近于完美的生物素結(jié)合蛋白。鏈酶親和素同一定濃度的生物素化酶混合后，就能構(gòu)成鏈酶親和素-生物素-酶復(fù)合物。這種復(fù)合物中至少存在一個(gè)尚未被生物素占據(jù)的親和素結(jié)合位點(diǎn)，可以和各種生物素標(biāo)志的抗體結(jié)合。這種復(fù)合物即是SABC(streptavidin-biotincomplex)。(2)SABC的特點(diǎn)高敏感性；低背景；簡(jiǎn)便快速；結(jié)果穩(wěn)定EnVison?系統(tǒng)染色原理與ABC法、SP法及SABC法的染色原理均不同，是將二抗與多聚螯合物酶〔HRP或AP〕經(jīng)過(guò)化學(xué)方法銜接在一同，構(gòu)成多聚螯合物，在多聚螯合物上含有大量的酶分子和二抗，因此，比ABC法、SP法和SABC法具有更顯著的放大作用，可高出幾十倍。由于多聚物在人或動(dòng)物體內(nèi)不存在，因此，無(wú)非特異性染色，背景著色極輕。染色步驟簡(jiǎn)便，在一抗反響后，切片經(jīng)PBS洗滌后即可參與EnVison?系統(tǒng)試劑，再經(jīng)PBS洗滌后，可進(jìn)展顯色。AgAgPrimaryantibodySecondaryantibodyEnzyme,APorHRPIllustrationofEnVisionmethod16．PBS洗滌切片，5min×3。17．DAB顯色或AEC顯色，或堿性磷酸酶標(biāo)志的NBT顯色。〔1〕DAB顯色液配置DAB20-50mg0.01mol/LPBS(pH7.2-7.4)100ml或0.05mol/LTris-HCl(pH7.6)30%H2O220-40μl配置方法：先以少量PBS或Tris-HCl緩沖液溶解DAB，然后再參與余量緩沖液，在顯色前參與30%H2O2。將洗滌后的切片浸入顯色液中5-10-20min，應(yīng)閉光下反響，并隨時(shí)在顯微鏡下察看結(jié)果，隨時(shí)終止反響，也可運(yùn)用商品化的即用型DAB。陽(yáng)性反響部分為棕色，經(jīng)核復(fù)染后，脫水、透明、樹(shù)膠封片，但由于有致癌作用，配置時(shí)應(yīng)留意防護(hù)?！?〕AEC(3-amino-9-ethylcarbazole)顯色液AEC20mg二甲基甲酰胺(DMF)2.5ml0.05mol/L醋酸緩沖液(pH5.5)50ml30%H2O25μl配置方法：先將AEC溶于DMF中，再參與醋酸緩沖液充分混勻過(guò)濾。臨顯色前參與H2O2,切片顯色時(shí)間5-20min，也可運(yùn)用商品化的AEC顯色。該顯色液作用后，陽(yáng)性部分為紅色，如以蘇木素或亮綠復(fù)染核后，效果更佳，但終產(chǎn)物溶于酒精和水，故需用甘油封固?！?〕堿性磷酸酶〔AKP〕標(biāo)志的NBT顯色液預(yù)先配置以下試劑：A液：5%NBT〔Nitro-blue-tetrazolium〕稱取0.5gNBT溶于10ml70%的DMF，充分混合，保管于4℃，也可分裝成小份，-20℃保管，用前復(fù)至室溫。B液：5%BCIP〔5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate〕稱取BCIP0.5g，溶于10mlDMF內(nèi)，混勻，4℃成分裝，保管于-20℃，用前復(fù)至室溫。顯色液：取A液40μl，參與到裝有10ml的0.1mol/LTris-HCl緩沖液〔pH9.5，含0.1mol/LNaCl，5mmol/LMgCl2〕管內(nèi)充分混勻，再參與B液40mol，悄然混勻即可，最好臨用前就配置，但在顯色液中需參與Levamisole〔左旋咪唑〕在顯微鏡下隨時(shí)察看顯色反響，陽(yáng)性結(jié)果為藍(lán)色或紫色沉淀。上述所提及的各種顯色液目前均有以試劑盒方式出賣(mài)，只需按闡明操作即可，但價(jià)錢(qián)較貴。18.自來(lái)水洗滌切片、核復(fù)染、脫水、透明、樹(shù)膠封片經(jīng)顯色后，將切片放入自來(lái)水中，流水輕沖洗10分鐘，再經(jīng)蒸餾水洗后，放入蘇木素中做核復(fù)染〔顯色切片〕20s-1min，經(jīng)酒精-HCl分化后，在放入自來(lái)水中繼續(xù)分化細(xì)胞核至稱心為止。經(jīng)70%、80%、90%、95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ酒精脫水各5min，二甲苯透明后，用樹(shù)膠封片。第三節(jié)免疫組化染色的對(duì)照設(shè)置在進(jìn)展免疫組化染色時(shí)，必需證明組織內(nèi)顯示的反響產(chǎn)物，確實(shí)是抗原與相應(yīng)的特異性抗體反響所產(chǎn)生的。由于免疫組織化學(xué)染色中影響抗原、抗體和免疫反響的要素很多，因此對(duì)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的評(píng)價(jià)必需設(shè)置對(duì)照組才干做出正確的判別。常用的對(duì)照組有以下幾種：一、陽(yáng)性對(duì)照用已證明含用待測(cè)抗原的組織，與待檢標(biāo)本做同樣處置后，進(jìn)展免疫組化染色，結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性，稱為陽(yáng)性對(duì)照。每次實(shí)驗(yàn)都應(yīng)做陽(yáng)性對(duì)照，經(jīng)過(guò)陽(yáng)性對(duì)照可證明靶抗原有一定活性，染色過(guò)程中各個(gè)步驟以及所用的試劑都符合規(guī)范，染色方法可靠。特別是當(dāng)待檢的標(biāo)本為陰性結(jié)果時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照呈陽(yáng)性反響，可排除待檢標(biāo)本假陽(yáng)性的能夠。所以假設(shè)預(yù)期染色結(jié)果是陰性時(shí)，就必需設(shè)陽(yáng)性對(duì)照。二、陰性對(duì)照用確知不存在待檢抗原的組織切片染色，結(jié)果為陰性。陰性對(duì)照可證明組織內(nèi)假設(shè)不含靶抗原，就不應(yīng)染色，可排除在染色過(guò)程中由于非特異性染色或交叉反響等要素呵斥的“假陽(yáng)性〞結(jié)果。三、空白對(duì)照是最常用的對(duì)照，用不加一抗的緩沖液，如PBS替代一抗，染色結(jié)果應(yīng)為陰性，闡明染色方法可靠，可排除組織的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、自發(fā)熒光等物質(zhì)引起的非特異性顯色。四、替代對(duì)照用與第一抗體來(lái)源的同一動(dòng)物免疫前血清，如第一抗體用的是兔抗人GFAP的IgG抗體，對(duì)照中用非免疫性的正常兔IgG血清來(lái)替代一抗，以一樣的稀釋倍數(shù)進(jìn)展對(duì)照染色。這可證明待檢切片中陽(yáng)性結(jié)果不是抗體以外混雜的血清成分所致，而是所用特異性抗體與組織細(xì)胞內(nèi)待檢抗原的特異性反響的結(jié)果。但運(yùn)用的商品抗體往往不能用同一種動(dòng)物的免疫前血清做替代對(duì)照，也可用未經(jīng)免疫的同種動(dòng)物血清，即非免疫血清替代一抗。五、吸收實(shí)驗(yàn)對(duì)照用過(guò)量知相應(yīng)的純化抗原與第一抗體反響，抗體結(jié)合點(diǎn)全部被抗原結(jié)合，這種被抗原吸收的抗體不能再與組織內(nèi)的抗原反響，故再做免疫組化染色時(shí)，結(jié)果應(yīng)為陰性。六、本身對(duì)照用同一組織切片上與待檢抗原無(wú)關(guān)的其它構(gòu)造做對(duì)照。陰性反響與陰性構(gòu)造同在一個(gè)視野中，相互印證，這本身就是對(duì)陽(yáng)性反響的特異性對(duì)照。但進(jìn)展科研任務(wù)中，單純用這種對(duì)照是不科學(xué)的。必需添加如空白對(duì)照、替代對(duì)照等，才干使染色結(jié)果得到成認(rèn)?，F(xiàn)代國(guó)際上發(fā)表文章，在免疫組化染色的同時(shí)，還須有Westernblotting做相應(yīng)蛋白質(zhì)檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果加以證明。冰凍切片的免疫組織化學(xué)染色冰凍切片的免疫組織化學(xué)染色也是常用的技術(shù)，但普通情況下不用，由于冰凍切片操作較復(fù)雜，不易操作，要求標(biāo)本必需是深低溫快速冷凍，標(biāo)本不如石蠟塊易保管等，但優(yōu)點(diǎn)是組織的各種抗原保管好。因此普通情況下，只需在運(yùn)用石蠟切片進(jìn)展免疫組化染色，包括經(jīng)過(guò)抗原熱修復(fù)或蛋白酶消化后，仍不能得到陽(yáng)性染色結(jié)果時(shí)，才思索運(yùn)用冰凍切片染色。第四節(jié)雙重免疫組織化學(xué)染色運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色方法在同一張組織切片或細(xì)胞涂片上同時(shí)或先后顯示兩種抗原成分，即為雙重免疫標(biāo)志。光鏡下經(jīng)過(guò)標(biāo)志物或其反響生成物的顏色來(lái)標(biāo)志不同的抗原成分，以協(xié)助研討者了解含有這些不同抗原的各類細(xì)胞、組織之間的相互關(guān)系。能夠遇到的問(wèn)題是：后一種免疫染色所用的抗體系統(tǒng)能夠與前一種染色所用的抗體系統(tǒng)發(fā)生交叉反響，從而呵斥疊加污染，失去雙重染色的準(zhǔn)確性和意義。為防止這種交叉反響，研討者建立了一些方法，按其作用原理和方式，可分為洗脫法和非洗脫法。一、洗脫法1.根本原理：可選用同種動(dòng)物產(chǎn)生的特異性抗體〔如兔抗X和兔抗YIgG抗體〕為一抗，另一種動(dòng)物相應(yīng)的抗體〔如生物素標(biāo)志的羊抗兔IgG抗體〕為二抗，用ABC、SP或SABC方法，或運(yùn)用EnVison方法進(jìn)展染色，用不同的酶和底物系統(tǒng)呈色。在完成第一種免疫組化染色后，將抗原抗體復(fù)合物洗脫，再做第二種染色。2.洗脫液：〔1〕甘氨酸-鹽酸溶液(pH2.2)：0.1mol/L鹽酸+0.757%〔0.1mol/L〕甘氨酸溶液95ml〔0.1mol/L的氯化鈉溶液配制〕。用該溶液洗切片2h，普通可以消除第一種染色的抗體系統(tǒng)與下一種染色的交叉反響，但保管顯色反響所得的顏色?！?〕高錳酸鉀-硫酸洗脫液：1ml2.5%KMnO4，1ml5%H2S04，加140ml蒸餾水混勻。3.洗脫法的普通步驟按常規(guī)做第一種免疫組化染色，可選用HRP為標(biāo)志物，顯色底物為4-氯萘酚，陽(yáng)性部位反響產(chǎn)物為藍(lán)色。開(kāi)場(chǎng)第二種染色前，先將切片經(jīng)蒸餾水洗，再用酸性溶液洗脫。如用pH2.2的甘氨酸-鹽酸溶液須浸洗2h左右，如用高錳酸鉀-硫酸洗脫液那么要5min左右，再將切片移入0.5%的焦亞硫酸鈉〔Na2S2O5〕水溶液中復(fù)原30s，經(jīng)水洗10-20min，蒸餾水洗5min，按常規(guī)進(jìn)展下一種免疫組化染色。第二種染色選用DAB為顯色底物，生成物呈棕褐色，與第一種染色中生成的藍(lán)色可構(gòu)成比較鮮明的對(duì)比。二、非洗脫法〔一〕直接法假設(shè)采用不同種酶標(biāo)志在不同的第一抗體上，那么只能用順序染色法。即先做第一種染色，用第一種底物與已定位的酶反響呈色，再進(jìn)展第二種染色?！捕硺?biāo)志雙抗原法兩種一抗分別來(lái)自不同種動(dòng)物，二抗分別來(lái)自另外兩種不同動(dòng)物，且標(biāo)志兩種酶分別作為標(biāo)志物做雙重染色時(shí)，普通第一種染色選用HRP，而在第二種染色中可按需求選擇不同的酶。如選用ALP，還可用不同的底物呈現(xiàn)不同的顏色，如鞏固藍(lán)呈現(xiàn)的藍(lán)色可與DAB的棕色構(gòu)成良好的對(duì)比，鞏固紅雖然與DAB的棕色對(duì)比相對(duì)較差，但也可選用?！踩郴钚詼缁罘ㄊ且环N新建立的方法，主要是根據(jù)經(jīng)過(guò)在溶液中加熱滅活第一次染色中的抗原、抗體和酶活性后再進(jìn)展第二種染色的原理而設(shè)計(jì)的。用于滅活的溶液介質(zhì)普通是檸檬酸緩沖液〔pH6.0〕，滅活的溫度普通是96℃左右。本法的優(yōu)點(diǎn)是用于染色的一抗、二抗可分別來(lái)自于同一種動(dòng)物，方便了抗體的選擇，只是選用不同的顯色酶和底物。但缺陷是所要顯示的第二種抗原必需耐熱。免疫熒光染色及多重染色技術(shù)

Singleandmultipleimmunofluorescentlabeling◆原理：是根據(jù)抗原抗體反響的原理，先將知的抗體或抗原標(biāo)志上熒光素制成熒光標(biāo)志物，再用這種熒光抗體〔或抗原〕作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原〔或抗體〕?！舴椒ǎ褐苯臃?、間接法。檢測(cè)方法一、直接法用知特異性抗體與熒光素結(jié)合，制成特異性熒光抗體，直接與細(xì)胞或組織中相應(yīng)抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)抗原存在部位呈現(xiàn)的特異性熒光。此法特異和簡(jiǎn)便，但一種熒光抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。二、間接法是直接法的重要改良，先用特異性第一抗體抗體與細(xì)胞標(biāo)本反響，隨后用緩沖鹽水洗去未與抗原結(jié)合的抗體，再用標(biāo)志熒光的第二抗體與結(jié)合在抗原上的抗體結(jié)合，構(gòu)成抗原-抗體-熒光抗體的復(fù)合物。由于結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的熒光抗體顯著多于直接法，從而提高了敏感性，與直接法相比熒光亮度可加強(qiáng)3～4倍。此法除靈敏性高外，它只需求制備一種種屬間接熒光抗體，適用于多種抗原的標(biāo)志顯示，是目前最廣泛運(yùn)用的技術(shù)。間接法染色原理標(biāo)志不同熒光發(fā)色劑的商品化二抗：1.AlexaFluor?555，顯示紅色熒光；吸收光譜峰值：555nm，激發(fā)光譜峰值：565nm。2.AlexaFluor?488，顯示綠色熒光；吸收光譜峰值：495nm，激發(fā)光譜峰值：519nm。3.AlexaFluor?350，顯示藍(lán)色熒光。吸收光譜峰值：346nm，激發(fā)光譜峰值：442nm。4.Hoechst33258，標(biāo)志細(xì)胞核，或細(xì)胞凋亡檢測(cè)，藍(lán)色。吸收光譜峰值：346nm，激發(fā)光譜峰值：460nm雙重或三重免疫熒光標(biāo)志法

Doubleandtripleimmunofluorescentlabeling目的：1.雙重染色：同時(shí)顯示細(xì)胞中的兩種抗原或一種抗原+標(biāo)志細(xì)胞種類；2.三重染色：同時(shí)顯示細(xì)胞中的三種抗原或兩種抗原+標(biāo)志細(xì)胞種類。方法：直接法、間接法直接法：將兩種或三種來(lái)自不同種屬，并標(biāo)志了可發(fā)出不同顏色熒光的抗體〔如抗A、抗B、抗C〕以適當(dāng)比例混合，加在標(biāo)本上孵育后，按直接法洗去未結(jié)合的熒光抗體，抗A抗體用發(fā)黃綠色熒光素標(biāo)志，抗B抗體用發(fā)紅色熒光素標(biāo)志，抗C抗體用發(fā)藍(lán)色熒光素標(biāo)志明確顯示兩種或三種抗原的定位。間接法：將兩種或三種來(lái)自不同種屬的抗體〔如抗A、抗B、抗C的IgG抗體〕同時(shí)或分別孵育切片后，再選用標(biāo)志了可發(fā)出不同顏色熒光另外不同種屬的抗IgG抗體孵育切片，進(jìn)展雙重或三重免疫熒光染色，是目前常用的檢測(cè)技術(shù)。免疫熒光染色本卷須知免疫熒光染色的根本程序近似于酶免疫組織化學(xué)染色，但應(yīng)留意以下問(wèn)題：1.免疫熒光不需求用雙氧水處置，封鎖和一抗孵育與其一樣。2.二抗孵育之后充分洗片后即可貼片、封片和察看。3.免疫熒光在封片時(shí)常運(yùn)用公用封片劑或甘油〔0.01MPBS1：1〕。建議購(gòu)買(mǎi)抗淬滅的封片液，使切片可以保管更久。4.熒光抗體的孵育以及后續(xù)處置需求避光。5.免疫熒光染色假陽(yáng)性能夠多，需分別設(shè)定陽(yáng)性和陰性對(duì)照。6.熒光染色后普通在1h內(nèi)完成察看，或于4℃保管4h，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，能夠會(huì)使熒光提早衰退。第五節(jié)

細(xì)胞凋亡的檢測(cè)技術(shù)一、凋亡細(xì)胞的形狀學(xué)改動(dòng)細(xì)胞外表：偽足、微絨毛等消逝細(xì)胞體形狀：細(xì)胞伸展、變形，體積變小細(xì)胞核：染色質(zhì)濃縮、早期染色質(zhì)聚集于核膜邊，呈新月形或環(huán)形，晚期碎裂細(xì)胞器：密集但形狀及構(gòu)造完好，早期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)短暫擴(kuò)張細(xì)胞膜：完好，晚期包裹細(xì)胞器或核碎片，構(gòu)成凋亡小體在組織中表現(xiàn)：經(jīng)常以單個(gè)細(xì)胞散在發(fā)生周?chē)M織反響：凋亡細(xì)胞或小體被臨近巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞吞噬、降解，不發(fā)生炎癥反響發(fā)生條件：屬于基因控制的程序性細(xì)胞死亡，多發(fā)生于器官萎縮、細(xì)胞介導(dǎo)的免疫殺傷機(jī)制、小劑量毒素作用以及多種病理生理形狀二、細(xì)胞凋亡的形狀學(xué)檢測(cè)方法〔一〕凋亡細(xì)胞的光鏡和熒光顯微鏡檢測(cè)1．制片〔1〕常規(guī)組織學(xué)切片，進(jìn)展脫蠟和水化?！?〕培育細(xì)胞可用細(xì)胞離心儀制片。由于凋亡細(xì)胞在制片中容易破碎，所以應(yīng)采用低速離心制片〔250g，離心5min〕，并事先將載玻片用1%BSA處置，使細(xì)胞易于貼附。離心后涂片，稍經(jīng)空氣中枯燥后，迅速用1%多聚甲醛4℃下固定15-30min，然后轉(zhuǎn)入80%乙醇后固定1-2h，保管于-20℃待用。2．染色方法可用多種方法進(jìn)展染色?！?〕可采用常規(guī)的組織學(xué)染色方法，如Giemsa染色、HE染色或Mayer蘇木素染色?！?〕采用熒光染料染色Hoechst33258。DAPI〔4’,6-diamidino-2-phenylindole;4,6-二脒基-2-苯基吲哚〕。DAPI是含有特定AT序列DNA的一種嵌入劑，能像Hoechstdye一樣粘附在DNA雙螺旋的小溝區(qū)。雖然DAPI不能經(jīng)過(guò)活細(xì)胞膜，但卻能穿透擾亂的細(xì)胞膜而對(duì)核染色。PI〔propidiumiodide,碘化丙啶〕。3．結(jié)果察看典型的凋亡細(xì)胞形狀學(xué)改動(dòng)：細(xì)胞體積減少及變形；核濃染及喪失亞形狀構(gòu)造，可見(jiàn)核染色質(zhì)呈新月形，或核碎裂成大小不等的核碎片；在組織切片上可見(jiàn)巨噬細(xì)胞或臨近的上皮細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞或凋亡小體?！捕车蛲黾?xì)胞的電鏡察看采用電鏡的常規(guī)方法固定、包埋和制片?？捎猛干潆婄R或掃描電鏡進(jìn)展察看。透射電鏡下，凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮、核膜消逝，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，而細(xì)胞器如線粒體等形狀仍堅(jiān)持良好，可見(jiàn)被膜構(gòu)造包繞的細(xì)胞器，即凋亡小體。掃描電鏡下，細(xì)胞外表構(gòu)造如偽足、微絨毛等消逝，細(xì)胞膜呈現(xiàn)波浪狀起伏。〔三〕凋亡細(xì)胞的原位末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶標(biāo)志法〔insituterminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddUTP-digoxigenin(biotin)nickend-labeling,TUNEL〕細(xì)胞凋亡的多步驟機(jī)制造用的最終環(huán)節(jié)是細(xì)胞內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活而導(dǎo)致核染色質(zhì)DNA雙鏈的斷裂。大量DNA片段暴顯露的3?羥基在末斷轉(zhuǎn)移酶〔terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT〕或DNA多聚酶的作用下，與生物素或地高辛標(biāo)志的核苷酸結(jié)合，最終借助與卵白素或抗地高辛抗體結(jié)合的熒光素或HRP，使凋亡細(xì)胞被特異性地標(biāo)志和顯示出來(lái)。1．試劑盒及標(biāo)志法種類凋亡細(xì)胞檢測(cè)試劑盒：Phoenix公司〔SanDiego，USA〕BoehringerMannheim公司〔Indianapolis，USA〕Intergen公司〔Purchase，USA〕Oncor公司〔Gaithersburg，USA〕只需按試劑盒中所提供的闡明書(shū)進(jìn)展操作，均可獲得稱心的結(jié)果?？筛鶕?jù)需求選用熒光標(biāo)志還是HRP-DAB標(biāo)志。2.標(biāo)志方法熒光顯色的標(biāo)志法：生物素結(jié)合的dUTP〔biotin-dUTP〕標(biāo)志法；地高辛結(jié)合的dUTP〔digoxigenin-dUTP〕標(biāo)志法；溴-dUTP〔bromo-dUTP〕標(biāo)志法，普通用結(jié)合了avidin的異硫氰酸熒光素〔fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC〕與生物素化的二抗或標(biāo)志了FITC的抗地高辛抗體或抗BrdUrd抗體作為發(fā)色源，凋亡的細(xì)胞核呈綠色熒