細(xì)胞因子檢測(cè)

細(xì)胞因子的檢測(cè)方法左大明zdaming@細(xì)胞因子

一類由細(xì)胞分泌，具有多種功能的高活性小分子蛋白，參與免疫調(diào)節(jié)和多種生理病理過程等。

白細(xì)胞介素(interleukin,IL)干擾素(interferon,IFN)腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor,TNF)集落刺激因子(colonystimulatingfactor,CSF)生長(zhǎng)因子(growthfactor,GF)趨化因子(chemokine)優(yōu)點(diǎn)：敏感、可靠；缺點(diǎn)：需長(zhǎng)期飼養(yǎng)細(xì)胞、檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、步驟繁雜。1不同的CK具有不同的生物學(xué)活性，選擇CK獨(dú)特的生物學(xué)活性，即可檢測(cè)。細(xì)胞增殖/抑制實(shí)驗(yàn)細(xì)胞病變抑制實(shí)驗(yàn)細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)。。。生物學(xué)檢測(cè)法細(xì)胞因子的檢測(cè)方法2利用抗體對(duì)抗原表位的識(shí)別，測(cè)定的是可溶性細(xì)胞因子的抗原性。ELISARIAFIAELISPOT。。。免疫學(xué)檢測(cè)法優(yōu)點(diǎn)：方便、迅速缺點(diǎn)：價(jià)格昂貴，結(jié)果僅代表CK的量而非活性，敏感性較低。3利用基因探針，檢測(cè)特定細(xì)胞因子基因表達(dá)，即mRNA水平。斑點(diǎn)雜交Northern印跡細(xì)胞和組織原位雜交RT-PCR。。。分子生物學(xué)檢測(cè)法局限性：僅能檢測(cè)基因表達(dá)情況，不能直接提供有關(guān)細(xì)胞因子的濃度和活性，只用于機(jī)制探討。待檢樣品(細(xì)胞上清)指示細(xì)胞〔CTLL-2〕IL-2依賴細(xì)胞系按不同稀釋度參加37oC，16-20小時(shí)參加3HTdR〔1-5Ci〕37oC，4-6小時(shí)收集細(xì)胞測(cè)定細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)細(xì)胞病變抑制實(shí)驗(yàn)待檢樣品〔細(xì)胞上清〕IFN-指示細(xì)胞〔wish〕按不同稀釋度參加37oC，4小時(shí)37oC，24-48小時(shí)棄取上清，參加VSV(水泡性口炎病毒)觀察細(xì)胞病變〔鏡檢或比色〕UsingCFSEtotrackCMLprogenitorproliferationSDMSDM+GlivecCalculationofProliferativeIndex(P.I.)CFSE--->43210TheProliferativeIndexisthesumofthecellsinallgenerationsdividedbythecalculatednumberoforiginalparentcells.Itisusefulforcomparingquantityofcelldivisionbetweenculturesofthesamecellsundergoingdifferenttreatments.CellProliferationELISAKit,BrdU(colorimetric)Chromium-51(51Cr)releaseassays

計(jì)數(shù)受趨化細(xì)胞趨化因子細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)示意圖微孔濾膜用示蹤物質(zhì)標(biāo)記抗體或抗原，使其與相應(yīng)的抗原或抗體反響，使微量的、不可見的反響成為可見的或可測(cè)定的。免疫標(biāo)記技術(shù)高通量細(xì)胞因子檢測(cè)CBA(CytometricBeadArray)是一種微珠多用途檢測(cè)分析技術(shù)，它由一系列的微珠組合來捕獲并結(jié)合流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液、EDTA血漿、血清樣本中被檢測(cè)物質(zhì)的量。其采用夾心法分析策略，與傳統(tǒng)的ELISA分析技術(shù)相比，此方法可以同時(shí)檢測(cè)多項(xiàng)指標(biāo)。用的標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以得出被測(cè)樣本的濃度。此分析方法不受樣本量的限制，而且可以得到一個(gè)樣本的多個(gè)數(shù)據(jù)。CytokinenetworkCBA原理示意圖LabInvest2003,83:1131–1146cytokinebeadarrays(CBA)ELISPOT(酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn))ELISPOT技術(shù)利用結(jié)合在固相載體上的抗細(xì)胞因子的特異性抗體，在分泌細(xì)胞周圍直接撲獲待檢細(xì)胞因子。實(shí)驗(yàn)中每個(gè)斑點(diǎn)〔spot〕是激活的淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子區(qū)域，代表一個(gè)活性淋巴細(xì)胞。它可在單細(xì)胞水平檢測(cè)淋巴細(xì)胞對(duì)特異性抗原的反響能力。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，是目前為止最靈敏的檢測(cè)技術(shù)?？蓹z測(cè)到百萬分之一陽性細(xì)胞率;單細(xì)胞水平、活細(xì)胞功能檢測(cè);操作簡(jiǎn)便，可進(jìn)行高通量篩選。1.特異性單抗包被在培養(yǎng)板孔底部；2.封閉能結(jié)合單抗的其他部位；3.參加細(xì)胞及刺激物培養(yǎng)，陽性細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子被單抗捕獲；4.移出細(xì)胞，洗滌；5.參加生物素標(biāo)記的二抗；6.參加酶標(biāo)鏈霉親和素；7.參加顯色底物，在酶的催化分解下，產(chǎn)生不可溶的色素，就近沉淀在局部的膜上形成斑點(diǎn)；8.斑點(diǎn)計(jì)數(shù)〔可人工計(jì)數(shù)，也可用自動(dòng)讀板儀計(jì)數(shù)〕，數(shù)據(jù)處理，結(jié)果分析。ELISPOT應(yīng)用移植研究--allograftrejection疫苗開發(fā)--亦可評(píng)估疫苗效力，或是疫苗注射路徑影響Th0/Th1/Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)換分析自體免疫研究--免疫調(diào)節(jié)及免疫治療研究癌癥研究--腫瘤反響T細(xì)胞作用過敏機(jī)制探討--IL-4誘導(dǎo)免疫球蛋白亞型轉(zhuǎn)換，其它參與過敏機(jī)制之細(xì)胞因子的研究傳染疾病研究--Lymedisease,Chlamydiainfections,Helicobacterpyloriinfections,HIVinfections,multiplesclerosis,等MediumPHAPeptide1Peptide21Peptide47GzBHIV-peptiderecallpatientBIFN-gHIV-peptidespecificrecallresponseshowsdissociatedproductionofIFN-gandGzBKleenT.etal,AIDS2003,18:383-392ELISPOT和ELISA的區(qū)別ELISPOT法源自ELISA，又突破傳統(tǒng)ELISA法，是定量ELISA技術(shù)的延伸和新的開展，它們最大的不同:1.ELISA通過顯色反響，在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可溶性蛋白總量(整體水平);ELISPOT也是通過顯色反響，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點(diǎn)，可直接在顯微鏡下人工計(jì)數(shù)斑點(diǎn)或通過ELISPOT分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，1個(gè)斑點(diǎn)代表1個(gè)細(xì)胞，從而計(jì)算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率〔單細(xì)胞水平〕；

2.ELISPOT比ELISA更敏感。ELISPOT技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域：自身免疫診斷和預(yù)后分析、器官移植后排斥反響的預(yù)測(cè)、過敏性疾病脫敏治療的監(jiān)測(cè)、疫苗和藥品的研發(fā)與檢測(cè)等。胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測(cè)LPS活化單核細(xì)胞內(nèi)TNF-α的測(cè)定

R1：淋巴細(xì)胞；R2：?jiǎn)魏思?xì)胞TNF-

的誘生和檢測(cè)主要由單核/巨噬細(xì)胞及其他多種細(xì)胞產(chǎn)生，能使殺傷腫瘤細(xì)胞;THP-1(人單核細(xì)胞系)在LPS(脂多糖)刺激下可分泌TNF-;L929(小鼠成纖維細(xì)胞)可被THP-1分泌的TNF-殺傷，且細(xì)胞的死亡率與TNF-活性成正比;四甲基偶氮唑鹽(MTT)在活細(xì)胞線粒體的琥珀酸