SDS-PAGE-聚丙烯酰胺凝膠電泳詳解

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-Polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS1精選2021版課件一、什么是SDS？十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate,SDS)是一種陰離子去污劑。它在水溶液中以單體（monomer）和分子團(tuán)（micellae）的混合形式存在。2精選2021版課件SDS的作用

破壞蛋白質(zhì)分子之間以及其他物質(zhì)分子之間的非共價(jià)鍵，使蛋白質(zhì)變性而改變?cè)械臉?gòu)象，保證蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合而形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。3精選2021版課件二、SDS的基本原理（一）蛋白質(zhì)分子的解聚

樣品介質(zhì)和聚丙烯酰胺中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小，而電荷因素可以被忽略。4精選2021版課件1、SDS

陰離子去污劑

變性劑

助溶性試劑

斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵

分子去折疊

破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)

5精選2021版課件2、強(qiáng)還原劑

巰基乙醇（β-mercaptoethanal）

二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）

使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。6精選2021版課件7精選2021版課件SDS和還原劑的作用：

（1）分子被解聚或組成它們的多肽鍵

（2）氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)

電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束。

（3）蛋白質(zhì)-SDS膠束所帶的負(fù)電荷大大超

過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除

了不同分子之間原有的電荷差異。8精選2021版課件蛋白質(zhì)-SDS膠束的特點(diǎn)

（1）形狀像一個(gè)長(zhǎng)橢圓棒

（2）短軸對(duì)不同的蛋白質(zhì)亞基-SDS膠束基本上是相同的。

（3）長(zhǎng)軸的長(zhǎng)度則與亞基分子量的大小成正比。9精選2021版課件膠束在SDS系統(tǒng)中的電泳遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷的影響，而主要取決于橢圓棒的長(zhǎng)軸長(zhǎng)度，即蛋白質(zhì)或亞基分子量的大小。

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在15KD—200KD之間時(shí)，電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系10精選2021版課件3、影響SDS電泳的關(guān)鍵因素

（1）溶液中SDS單體濃度（>1mmol/L)

大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的重量比為1：1.4

（2）樣品緩沖液的離子強(qiáng)度（不>0.26)

低離子強(qiáng)度的溶液中，SDS單體才具有較高的平衡濃度。

11精選2021版課件（3）二硫鍵是否完全被還原

當(dāng)二硫鍵被徹底還原后，蛋白質(zhì)分子才能被解聚，SDS才能定量地結(jié)合到亞基上而給出相對(duì)遷移率和分子量對(duì)數(shù)的線性關(guān)系。12精選2021版課件（二）緩沖系統(tǒng)的選擇

一般情況下，在被分析的蛋白質(zhì)穩(wěn)定的pH范圍，凡不與SDS發(fā)生相互作用的緩沖液都可以使用，但緩沖液的選擇對(duì)蛋白質(zhì)的分離和電泳的速度是非常關(guān)鍵的。

13精選2021版課件電泳緩沖液的種類：

1、磷酸緩沖液

2、Tris-醋酸鈉緩沖系統(tǒng)

3、咪唑緩沖液系統(tǒng)：

比磷酸緩沖系統(tǒng)的導(dǎo)電性低，電泳速

度要比后者快一倍。

4、尿素系統(tǒng)：

適用分子量低于15KD的蛋白樣品。

5、Tris-甘氨酸系統(tǒng)：

使用最多的緩沖液

6、Tris-硼酸鹽緩沖液：

測(cè)定糖蛋白的分子量

14精選2021版課件（三）凝膠濃度的選擇

由于SDS電泳分離并不取決于蛋白質(zhì)的電荷密度，只取決于分子解聚后SDS-蛋白質(zhì)膠束的大小，因此凝膠濃度的選擇會(huì)直接影響分辨率。

不同分子量范圍的蛋白質(zhì)應(yīng)選用不同的凝膠濃度.

15精選2021版課件16精選2021版課件17精選2021版課件18精選2021版課件19精選2021版課件（四）分子量測(cè)定

1、相對(duì)遷移率（Rf）

Rf即用每個(gè)帶的遷移距離除以溴酚藍(lán)前沿的遷移距離得到的。

測(cè)量位置應(yīng)在蛋白帶的中央。

蛋白帶遷移距離

Rf=————————

溴酚藍(lán)遷移距離

20精選2021版課件蛋白帶遷移距離固定前的凝膠長(zhǎng)度

Rf=—————————X—————————

干燥后的凝膠長(zhǎng)度溴酚藍(lán)遷移距離

21精選2021版課件2、作圖

以已知蛋白質(zhì)分子量的常用對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，Rf為橫坐標(biāo)繪圖22精選2021版課件23精選2021版課件3、通過(guò)測(cè)定未知蛋白質(zhì)的Rf值，便可在標(biāo)

準(zhǔn)曲線上讀出他的分子量

24精選2021版課件三、去污劑的選擇

無(wú)離子去污劑：LubroW；Brij35，Tween

Triton

陽(yáng)離子去污劑：cetyltrimethylammonium

bromide（CTAB）

cetylpyyridinium（CPC）

陰離子去污劑：SDSdeoxycholate

25精選2021版課件四、方法

1、分類

（1）根據(jù)對(duì)樣品的處理方式的不同

還原SDS電泳

非還原SDS電泳

帶有烷基化作用的還原SDS電泳

26精選2021版課件（2）根據(jù)緩沖系統(tǒng)和凝膠孔徑的不同

連續(xù)電泳

不連續(xù)電泳

（3）根據(jù)電泳的形式

圓盤電泳

垂直電泳

平板電泳

水平電泳

27精選2021版課件28精選2021版課件29精選2021版課件30精選2021版課件2、操作

（1）制備分離膠

（2）制備積層膠(堆積膠）31精選2021版課件32精選2021版課件33精選2021版課件34精選2021版課件35精選2021版課件36精選2021版課件分離膠聚合之后37精選2021版課件38精選2021版課件39精選2021版課件40精選2021版課件41精選2021版課件42精選2021版課件43精選2021版課件（3）加樣品

樣品的處理

在蛋白溶液中加入過(guò)量的SDS后，可引起以下的反應(yīng)：

蛋白質(zhì)本身的電荷被屏蔽

氫鍵斷裂

疏水相互作用被取消

多肽被去折疊(二級(jí)結(jié)構(gòu)破壞),并形成橢球形44精選2021版課件①還原SDS處理

當(dāng)加入還原試劑DTT或β-二巰基乙醇后，蛋白質(zhì)被完全去折疊，只根據(jù)分子量分離。45精選2021版課件②帶有烷基化作用的還原SDS處理

烷基化作用可以很好地并經(jīng)久牢固地保護(hù)SH基團(tuán)，而得到窄的電泳帶。

46精選2021版課件③非還原的SDS處理

許多樣品，如生理體液、血清或尿素，一般只需用1%SDS在100℃煮沸3分鐘，并不需要加還原劑，此時(shí)二硫鍵不能被斷裂，蛋白并沒(méi)有完全被去折疊。

47精選2021版課件（4）電泳（5）固定

48精選2021版課件（6）染色

考馬斯亮藍(lán)（coomassiebrilliantblue）

①R-250

三苯基甲烷，紅藍(lán)色，每個(gè)分子含有兩個(gè)SO3H基團(tuán)，偏酸性，和氨基黑一樣也是結(jié)合在蛋白質(zhì)的堿性基團(tuán)上。

49精選2021版課件50精選2021版課件②G-250

二甲花青亮藍(lán)，藍(lán)綠色。51精選2021版課件52精選2021版課件銀染色

銀染的機(jī)制是將蛋白帶上的硝酸銀（銀離子）還原成金屬銀，以使銀顆粒沉積在蛋白帶上。

53精選2021版課件54精選2021版課件（7）照相，凝膠干燥（8）定量測(cè)定

55精選2021版課件3、電泳過(guò)程中的不正?，F(xiàn)象

（1）“微笑”現(xiàn)象

指示劑前沿呈現(xiàn)兩邊向上的曲線形，說(shuō)明凝膠的不均勻冷卻，中間部分冷卻不好。56精選2021版課件（2）“皺眉”現(xiàn)象

由于垂直電泳槽的裝置不合適引起的，特別是當(dāng)凝膠和玻璃板組成的“三明治”底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全。

57精選2021版課件58精選2021版課件（3）“拖尾”現(xiàn)象

樣品溶解不佳引起。59精選2021版課件（4）“紋理”現(xiàn)象

由于樣品中的不溶顆粒引起的。60精選2021版課件（5）偏斜現(xiàn)象

電極放置不平行引起或加樣位置偏斜而引起61精選2021版課件（6）帶太寬

加樣量太多或加樣孔泄漏引起62精選2021版課件63精選2021版課件64精選2021版課件MolecularmassversusmolecularweightMolecularmass(symbolm)isexpressedinDaltons(Da).OneDaltonisdefinedas1/12themassofcarbon12.MostmacromoleculesarelargeenoughtousethekiloDalton(kDa)todescribemolecularmass.Molecularweightisnotthesameasmolecularmass.Itisalsoknownasrelativemolecularmass(symbolMr,whererisasubscript).Molecularweightisdefinedastheratioofthemassofamacromoleculeto1/12themassofacarbon12atom.Itisadimensionlessquantity.WhentheliteraturegivesamassinDaorkDaitreferstomolecularmass.Itisincorrecttoe