國家重點基礎研究發(fā)計劃（重大科學研究計劃）課題年度報告

國家重點基礎研究發(fā)展計劃（科學研究計劃）項目編號2012年11月21一、年度計劃執(zhí)行情況2012年度主要針對集成化蛋白質(zhì)組定量分對蛋白質(zhì)的回收率可達到95%；接口對蛋白質(zhì)的回收率可達到94%，可用于進一步蛋白質(zhì)的定量分析；在酶解反應器方面：1）（IMER基質(zhì)的親水性IMER，結(jié)合微波輔助，可在15s完成標準蛋白質(zhì)的酶解，5mins內(nèi)完成對大腸桿菌提取蛋白的酶解，鑒定到333個蛋白質(zhì)；4）建立一種集蛋樣品損失，對蛋白質(zhì)靈敏度比傳統(tǒng)方法提高了5倍；0.1L4galectin-3bindingprotein可以作為移細胞株蛋白提取物分析，發(fā)現(xiàn)了24種蛋白質(zhì)發(fā)生了明顯變化；10萬個細胞中定量到約1700個蛋白質(zhì)；2）構(gòu)建了基于反相色譜-溶劑置換接口-固定化質(zhì)鑒定數(shù)量提高10%左右，分析時間縮短1倍；3）建立了離子交換色譜-在線酶解-反相色譜-質(zhì)譜的集成化蛋白質(zhì)定量分析系統(tǒng)，該系統(tǒng)的定量RSD值為種蛋白質(zhì)在低轉(zhuǎn)移細胞中高表達，9種蛋白質(zhì)在高轉(zhuǎn)移細胞中高表達；對定量的蛋白質(zhì)組學新方法，該方法對標準蛋白最低定量檢測限為0.34amol，相對偏差RSD<1.58%，動態(tài)范圍1-105；2）構(gòu)建了二維陣列液相色譜高豐度蛋非糖肽來實現(xiàn)蛋白質(zhì)組樣品準確定量分析。應用到兩種人類細胞系ChangLiverHepG233個糖蛋白在兩個細胞系間的表達具有顯著差異性，并對其中2種蛋白質(zhì)進行了驗證。SCI7213（槍頭??口端內(nèi)徑為450μm管在重物的重力作用下自由落入盛水燒杯中，2mn后將毛細管從水中取??。毛膜外徑即為槍頭??將石英毛細管插入中空纖維膜兩端，插入長度約1cm度根據(jù)Peek接頭的長度適當調(diào)整，大致為4cm。20μL，通入中空纖維膜接口，收集組分通過BCA法測定濃度，BSA過膜后的回收率可達94%±1.3%(n=3)，可滿足定量分析的需求。親水性基于聚合物微球基質(zhì)的親水性本課題利用乙烯基-2-吡咯烷酮所帶有的雙鍵與聚合物微球表面雙鍵反應進行修飾，然后將1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和羥基琥珀酰亞胺對胰蛋白酶的羧基進行活化后與微球表面的氨基鍵合，制備了一種新型親水性IMER。利用牛血清白蛋白(BSA)對其性能進行評價，通過質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)庫搜索得到序列覆蓋率為66.3±1.3%(n=3)，鑒定肽段數(shù)目為37±2.7%(n=3)；利用濃度分別為100,1and0.01的肌紅蛋白(c(Cyt-c)和BSA的混合物進行評價，鑒定到的、Cyt-c和BS的序列覆蓋率分別為57%、40%和17%，鑒定肽段數(shù)目為8、7和9，而自由溶液酶解，只有濃度最高的得到鑒定，序列覆蓋率為36%，鑒定肽段數(shù)目為5，說明制備的新型IMER的較高的酶解效率。將其應用于酵母提取蛋白，酶解1.5min，通過L-共鑒定到271個蛋白而自由溶液鑒定到192個蛋白group(鑒定到至少兩條唯一性肽段)，兩者之間的overla達到了88.5，說明該I基于磁性氧化石墨烯基質(zhì)的親水性胰蛋白酶，酶固載量可達到0.275mg/mg。磁性的引入不僅簡化操作，而且作為微波吸收材料，可以加快酶解速度。將上述IMER對標準蛋白(BSA,Cyt-c,Myo.0.1mg/mL)進行15s微波輔助酶解，鑒定到的序列覆蓋率分別為67%、64%84%，鑒定肽段數(shù)目為36、14、13，酶解效率同自由溶液酶解12h相當。將其進一步應用于鼠肝蛋白提取物分析，采用5min微波輔助酶解，鑒定到456個蛋白條肽段（1163獨一肽段，F(xiàn)DR<1%）,對應333種蛋白質(zhì)。加入PNGaseF白G）對該系統(tǒng)進行考察，結(jié)果顯示，該系統(tǒng)對IgG分析的檢測限為30fmol，靈敏度比傳統(tǒng)方法（150fmol）提高了5倍。最后，將該系統(tǒng)用于復雜樣品人血清的分析，在100nL血清中，鑒定到了80個糖基化蛋白和178個糖基化位點。磷酸化肽段富集-pH將其應用用于人血清中內(nèi)源性磷酸肽的富集和衍生，并通過MALDI-TOFMS進行相對定量。從0.1μL血清中成功檢測到4個磷酸肽，并進行二甲基標記后比較差異。該方法結(jié)合MALDI-TOFMS，可以進行高通量的篩選，在疾病的臨床快糖肽富集-本課題通過將富集糖肽特異性高達90%測靈敏度（在使用0.01mg標準蛋白混合物以及400gBSA作為起始物質(zhì)，仍然26%galectin-3bindingprotein可以作為潛在的臨床腫瘤標記物。相符，且RSD值低于常規(guī)的溶液酶解的18.4%其中16種蛋白在高轉(zhuǎn)移細胞株中穩(wěn)定高表達，8種蛋白在低轉(zhuǎn)移細胞株中高表（2鼠肝蛋白質(zhì)在線酶解后鑒定肽段數(shù)目與常規(guī)溶液酶解相比從2271提高到5097。考察了在線酶解結(jié)合在重復分析并且保正兩次定量結(jié)果相對標準偏差<50%時，仍然有約10%的肽段的相對定量結(jié)果超過2倍（在未整合在線酶解的系統(tǒng)中為1%。為了消除在線酶解技術(shù)在細胞在相對標準偏差<50%時只有小于1%的肽段相對量超過了2倍。同時，由于在線10萬個細胞中定量到了約1700反相色譜-溶劑置換接口-固定化酶反應器-反相色譜-重現(xiàn)性，三種蛋白質(zhì)序列覆蓋率的相對標準偏差分別為0%，2.3%和6.8%線方法相比，無論是鑒定的肽段數(shù)（4404vs.3942）還是蛋白質(zhì)數(shù)目（1420vs.1250）均得到了顯著提高，且分析時間縮短了近一倍（19.5hvs.41.5h。該平和常規(guī)的定量方法相比時間可以至少縮短24h。利用該平臺對等量輕標記和重標為接近，而RSD值為19.63%，對于以質(zhì)譜而言，該結(jié)果優(yōu)于自由溶液的結(jié)果析前者，發(fā)現(xiàn)其中Cytochromec,somatic這種蛋白參與抑癌基因P53的信號傳導和，相對偏差RSD<1.58%，動態(tài)范圍1-15。通過優(yōu)化二維色譜的色譜柱組合、色譜本研究構(gòu)建了弱陰離子交換/反相液相色譜平臺系統(tǒng)，工作流程如下：單上，進行樣品的濃縮和除鹽。在第二維的分離中，采用設計制作的8RPLC對多維液相色譜總ChangLiver和HepG2細胞表面糖蛋白的82.4%性。在這33個糖蛋白中選定了2個，EMMPRIN和BCAM，用western二、重要階段性成果或突破（300-500字，另附圖片后加入PNGaseF大地節(jié)省操作的時間，使得整個樣品預處理過程能在2h內(nèi)完成（傳統(tǒng)方法的1/30檢測限為30fmol，靈敏度比傳統(tǒng)方法（150fmol）提高了5倍。將該系統(tǒng)用于復雜樣品人血清的分析，在100nL血清中，鑒定到了80個糖基化蛋白和178個糖基化位點。該工作發(fā)表在AnalyticalChemistry（2012,84,5146?5153）雜志上。圖1反相色譜-溶劑置換接口-固定化酶反應器-反相色譜-本課題構(gòu)建了一個基于反相色譜-溶劑置換接口-固定化酶反應器-反相色譜-質(zhì)譜的集成化蛋白質(zhì)組分析平臺(如圖2所示)，蛋白質(zhì)樣品首先通過微柱反相色譜分級，洗脫組分依次通過溶劑置換接口去除有機溶劑并調(diào)節(jié)溶液pH值，再進入固定化酶反應器酶解，酶解產(chǎn)物通過反相色譜預柱捕集，最后通過微納RPLC-MS分析。以三種標準蛋白質(zhì)混合物為樣品，考察了該平臺的性能，三種蛋白質(zhì)（cyt-c、-乳球蛋白和BSA）的序列覆蓋率分別為10%，55%和81%，與16h縮短到4h無論是鑒定的肽段數(shù)（4404vs.3942）還是蛋白質(zhì)數(shù)目（1420vs.1250）均得到了顯著提高，且分析時間縮短了近一倍（19.5hvs.