大蒜及其制品中蒜氨酸的測(cè)定高效液相色譜法

1大蒜及其制品中蒜氨酸的測(cè)定高效液相色譜法本文件規(guī)定了大蒜及其制品（大蒜粉、大蒜片、大蒜片劑、大蒜軟膏劑）中活性成分蒜氨酸（S-烯丙基-L-半胱氨酸亞砜）含量的高效液相色譜測(cè)定方法。本文件適用于大蒜及其制品（大蒜粉、大蒜片、大蒜片劑、大蒜軟膏劑）中蒜氨酸的含量測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。NY/T2643大蒜及制品中蒜素的測(cè)定高效液相色譜法NY/T3871大蒜中蒜氨酸的測(cè)定高效液相色譜法NY/T4351大蒜及其制品中水溶性有機(jī)硫化合物的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法T/HAS105飼料原料大蒜粉DB65/T4511高蒜氨酸含量大蒜質(zhì)量評(píng)價(jià)規(guī)范3術(shù)語和定義蒜氨酸AlliinS-烯丙基-L-半胱氨酸亞砜（S-allyl-L-cysteinesulfoxide分子式為C6H11NO3S，CAS#：556-27-4，相對(duì)分子質(zhì)量為177.22。4原理大蒜及其制品中蒜氨酸在紫外光區(qū)214nm波長(zhǎng)處有最大吸收，經(jīng)滅酶、水提取、液相色譜分離后，紫外檢測(cè)器測(cè)定，外標(biāo)法定量。5試劑或材料5.1試劑5.1.1甲醇（CH3OH）：分析純（用于樣品前處理）、色譜純（用于HPLC分析）。5.1.2三氟乙酸（CF3COOH色譜純。5.2溶液配制三氟乙酸溶液（0.06%，體積分?jǐn)?shù)）：準(zhǔn)確吸取0.60mL三氟乙酸（4.1.2）于預(yù)先加入一定量水的1000mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.22μm濾膜過濾。5.3標(biāo)準(zhǔn)樣品蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品（Alliin，C6H11NO3S，CAS：556-27-4）：含量≥99.0%。5.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（200mg/L稱取蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.020g（精確至0.00001g）置于100mL容量瓶中，用水溶解，稀釋定容至刻度，搖勻，4℃保存，有效期1個(gè)月。臨用前，精密量取貯備液1mL，置10mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，色譜分析前用0.22μm微孔濾膜過濾。6儀器設(shè)備6.1高效液相色譜儀：配備紫外檢測(cè)器。6.2分析天平：感量0.1mg、0.01mg。26.3勻漿儀。6.4高速粉碎機(jī)。6.5研缽。6.6超聲波清洗儀。6.7離心機(jī)：轉(zhuǎn)速8000r/min。6.8磁力攪拌恒溫水浴鍋：可控溫控速。6.9實(shí)驗(yàn)室可調(diào)溫電爐電子萬用爐。6.10國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)藥檢篩（150μm）。7樣品及試樣前處理7.1大蒜取有代表性的大蒜樣品，平行做三份試驗(yàn)。稱取試樣50g（精確至0.1mg），置于500mL燒杯中，加水200mL，水煮滅酶10min，室溫冷卻，勻漿1min（20000r/min漿液定量轉(zhuǎn)移置500mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，離心（8000r/min）15min，精密移取上清液1mL，置50mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。色譜分析前用0.22μm微孔濾膜過濾。7.2大蒜粉（片）大蒜粉：通過150μm試驗(yàn)篩，混勻。大蒜片：用粉碎機(jī)粉碎，通過150μm試驗(yàn)篩，混勻。稱取蒜粉（片）0.3g（精確至0.1mg）置于50mL容量瓶中，加無水甲醇20mL，超聲10min，加水20mL，超聲10min，室溫冷卻，用水稀釋定容至刻度，混勻，離心（8000r/min）10min，吸取上清液1mL，置于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻。色譜分析前用0.22μm微孔濾膜過濾。7.3大蒜片劑大蒜片劑：取大蒜片劑20片，用研缽研磨成粉末，混勻。稱取大蒜片劑0.3g（精確至0.1mg）置于50mL容量瓶中，加無水甲醇20mL，超聲10min，加水20mL，超聲10min，室溫冷卻，用水稀釋定容至刻度，混勻，離心（8000r/min）10min，吸取上清液1mL，置于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻。色譜分析前用0.22μm微孔濾膜過濾。7.4大蒜軟膏劑稱大蒜軟膏劑1.0g（精確至0.1mg）置于50mL干燥的燒杯中，加預(yù)熱的甲醇15mL，置磁力攪拌水浴鍋（55℃)滅酶15min，加預(yù)熱的水（55℃)20mL，提取5min，置50mL容量瓶中，加預(yù)熱水淋洗容器，洗液合并置容量瓶中，室溫冷卻，加水稀釋至刻度，搖勻，濾紙過濾。取續(xù)濾液2.0mL置10mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。色譜分析前用0.22μm微孔濾膜過濾。8測(cè)定方法8.1色譜條件耐水液相色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，粒徑3μm。流動(dòng)相：三氟乙酸溶液（4.2）。流速：0.5mL/min。柱溫：25℃。檢測(cè)波長(zhǎng)：214nm。8.2系統(tǒng)適用性試驗(yàn)8.2.1對(duì)分離度溶液進(jìn)行色譜分析，蒜氨酸的分離度R≥1.5。8.2.2對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行色譜分析，重復(fù)進(jìn)樣次數(shù)至少6次，檢測(cè)所得結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤2.0%。8.3系標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作準(zhǔn)確吸取一定量的蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（4.4用水配制成濃度約為2.27mg/L、4.54mg/L、9.09mg/L、22.73mg/L、45.46mg/L、90.92mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，供高效液相色譜儀測(cè)定。8.4測(cè)定3取待測(cè)液（6.1-6.4）和相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（7.3）按照7.1色譜參考條件測(cè)定，做單點(diǎn)校準(zhǔn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)，以保留時(shí)間定性，以色譜峰面積外標(biāo)法定量。待測(cè)液和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中蒜氨酸的響應(yīng)值應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍內(nèi)。在上述色譜條件下，蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及空白溶液、待測(cè)液的色譜圖見附錄A。9試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理大蒜及其制品中蒜氨酸含量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω,按公式（1）計(jì)算：式中：ω——大蒜及其制品中蒜氨酸含量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的數(shù)值，單位為%；D——試樣的稀釋倍數(shù)；Ax——試樣溶液中蒜氨酸峰面積值；CS——標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，單位為毫克每毫升（mg/mL）；AS——標(biāo)準(zhǔn)溶液中蒜氨酸峰面積值；W——試樣的取樣量，單位為克（g測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算數(shù)平均值表示，計(jì)算結(jié)果保留3位有效數(shù)字。10精密度在重復(fù)性條件下獲得的3次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤5.0%。11蒜氨酸HPLC參考色譜圖大蒜及其制品中蒜氨酸的HPLC參考色譜圖見附錄A。（規(guī)范性）大蒜及其制品中蒜氨酸的HPLC參考色譜圖 圖A.1蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)HPLC色譜圖 圖A.2大蒜樣品空白溶劑HPLC色譜圖圖A.3大蒜中蒜氨酸HPLC色譜圖 圖A.4大蒜粉（片）、大蒜片劑、大蒜軟膏劑空白溶劑HPLC色譜圖圖A.5大蒜粉（片）中蒜氨酸HPLC色譜圖 圖A.6大蒜片劑中蒜氨酸HPLC色譜圖圖A.7大蒜軟膏劑中蒜氨酸HPLC色譜圖7參考文獻(xiàn)[1]T/HAS105-2020飼料原