9工業(yè)微生物育種

9.工業(yè)微生物育種

●工業(yè)化菌種的要求①能夠利用廉價的原料，簡單的培養(yǎng)基，大量高效地合成產(chǎn)物;②有關(guān)合成產(chǎn)物的途徑盡可能地簡單，或者說菌種改造的可操作性要強;③遺傳性能要相對穩(wěn)定;④不易感染它種微生物或噬菌體;⑤產(chǎn)生菌及其產(chǎn)物的毒性必須考慮〔在分類學(xué)上最好與致病菌無關(guān)〕;⑥生產(chǎn)特性要符合工藝要求.●工業(yè)微生物的來源：—索取或向菌種保藏機構(gòu)購置；—自己選育(1)用原有菌株進行遺傳改造進行育種①

誘變育種②

基因重組育種(2)向菌種保藏機構(gòu)索取、購置出發(fā)菌株進行選育；(3)從自然界中別離菌種就是從自然界微生物資源中有目的、快速、準(zhǔn)確地選出所需要的菌種。●別離微生物新種的根本步驟：包括采樣、增殖、純化和性能測定等步驟。典型的篩選方法(見左圖)①采樣從自然界種采集含目的菌的樣品

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環(huán)境條件對土樣本中微生物分布的影響—營養(yǎng)環(huán)境ⅰ.高糖環(huán)境(加工蜜餞、蜂蜜的環(huán)境)土壤：耐滲透壓酵母，檸檬能產(chǎn)生菌，氨基能產(chǎn)生菌ⅱ.富含淀粉環(huán)境污泥、水溝旁土壤：淀粉酶產(chǎn)生菌ⅲ.森林中腐葉爛草下土壤：纖維素酶產(chǎn)生菌ⅳ.含蛋白質(zhì)(蠶絲、豆餅、生皮曬廠)土壤：蛋白酶產(chǎn)生菌ⅴ.油田土：石油分解菌例：醛肟水解酶的篩選--Journalofbiotechnology94(2002),65-72培養(yǎng)基中含0.05%Z-PAOx每隔2-3天移去一半培養(yǎng)物，補充新鮮培養(yǎng)基樣品分析，2-3個月后Z-PAOx降低后，稀釋別離條菌落—水分ⅰ.離地表5-25cm土樣ⅱ.含水過多、過少都不理想—溫度：采樣以秋季為好—通風(fēng):—植被：根局部泌物對微生物分布的影響—酸堿度：細菌、放線菌：中性或偏堿；霉菌、酵母：偏酸★采樣方法ⅰ.去除表層土ⅱ.取5-25cm土樣10-25g，裝入無菌牛皮紙袋或塑料袋中★注意ⅰ.記錄：時間，地點，環(huán)境情況等ⅱ.樣品袋應(yīng)封好口，防止水分失去ⅲ.土樣應(yīng)在別離前破碎ⅳ.盡快別離②增殖培養(yǎng)〔富集培養(yǎng)〕ⅰ.適用：樣品中目的菌數(shù)量不夠多時ⅱ.目的：提高樣品中目的菌的數(shù)量和比例ⅲ.原理：通過控制營養(yǎng)成分或培養(yǎng)條件，使目的菌得以繁殖和/或非目的菌的生長受到抑制ⅳ.方法：★控制營養(yǎng)成分

—纖維素為唯一碳源，可增殖分解纖維素的菌—可溶性淀粉為唯一碳源，可增殖產(chǎn)淀粉酶的菌種—酒精廢水，可以增殖廢水利用菌注：多種微生物所利用的碳/氮源不能作控制因素★控制培養(yǎng)基pH—細菌、放線菌：中性偏堿，—真菌：偏酸注：但非目的菌的生長不能被完全抑制★

控制培養(yǎng)溫度—30℃左右培養(yǎng)，可培殖嗜溫微生物—50～60℃培養(yǎng)，可培殖嗜熱微生物，篩選耐熱菌株★

熱處理—增殖芽孢細菌樣品懸浮液經(jīng)80℃、10分鐘處理，殺死營養(yǎng)體，再添加營養(yǎng)培養(yǎng)后可增殖產(chǎn)芽孢細菌★添加抑制劑—10%酚數(shù)滴：抑制細菌霉菌生長，增殖放線菌—抗生素：抑制細菌放線菌，增殖酵母、霉菌—多粘菌素B：抑制G-細菌—青霉素：抑制G+細菌—制毒菌素：抑制真菌—放線菌酮：抑制真菌

③純種別離目的：將目的菌從混雜的微生物中別離出來，獲得純培養(yǎng)★一般方法—稀釋平板法(傾注平板或涂布平板)—劃線法稀釋別離涂布平板稀釋別離傾注平板劃線別離法—組織培養(yǎng)法適用于別離高等真菌及植物病原菌。高等真菌：如香菇→切1小塊菌蓋→10%漂白粉消毒處理→無菌水沖洗→置瓊脂平板上→培養(yǎng)→長出菌絲體或：→懸掛在有瓊脂培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)→培養(yǎng)→長出菌絲體注意：對蔓延性霉菌ⅰ.加1%去氧膽酸鈉ⅱ.察氏培養(yǎng)基：0.01%蔗糖，0.1%山梨糖ⅰ.紙片培養(yǎng)顯色法濾紙飽浸含有指示劑的液體培養(yǎng)基用接種環(huán)接種保濕恒溫培養(yǎng)據(jù)菌落周圍變色圈和菌落直徑比值判別目的物產(chǎn)量ⅱ.透明圈法根據(jù)瓊脂培養(yǎng)上透明圈/菌落直徑大小判別目的產(chǎn)物的產(chǎn)量淀粉平板透明圈：淀粉酶碳酸鈣平板透明圈：產(chǎn)酸酪素〔蛋白〕透明圈：蛋白酶★平皿反響快速檢出法—定性或半定量ⅲ.變色圈法淀粉平板噴稀碘液：透明圈，液化型淀粉酶支鏈淀粉平板噴稀碘液：藍色圈：異淀粉酶無色圈：液化型淀粉酶葡聚糖平板加剛果紅：葡聚糖酶木聚糖平板加剛果紅：木聚糖酶變色圈反響ⅳ.生長圈法工具菌：營養(yǎng)缺酸型，不能合成的物質(zhì)〔生長因素〕為目的菌積累的產(chǎn)物菌落形態(tài)明顯不同于目的菌方法：106~107工具菌與樣品稀釋液一起涂布至瓊脂培養(yǎng)基外表，具有生長圈的菌落即為目的菌適用：氨基酸，核苷酸，維生素產(chǎn)生菌的選育ⅴ.抑制圈適用：抗生素產(chǎn)生菌的選育工具菌：對目的抗生素敏感的微生物例：目的菌為產(chǎn)生抗G+細菌的抗生素的菌株工具菌可使用金黃色葡萄球菌方法目的菌別離：稀釋別離法，培養(yǎng)長出菌落代謝物積累：用打孔器〔6CM〕將菌落連同周圍瓊脂培養(yǎng)基一起取下，放一無菌空培養(yǎng)皿內(nèi)，保濕培養(yǎng)4-5天，使新產(chǎn)生抗生素積累于小瓊脂塊中測定：取107工具菌涂布于球脂培養(yǎng)基，將小瓊脂塊放于上面培養(yǎng)過夜，抑菌圈的出現(xiàn)，說明瓊脂塊中有抗生素，大小說明抗生素單位的上下瓊脂塊培養(yǎng)法篩選抗生素產(chǎn)生菌程序包含某種指示劑的固體培養(yǎng)基的濾紙片變色圈。指示劑直接摻入或噴灑到固體培養(yǎng)基上，菌落周圍形成變色圈。如淀粉的平皿上噴上稀碘液。固體培養(yǎng)基中滲入溶解性差、可被特定菌利用的營養(yǎng)成分,造成不透明的培養(yǎng)基背景。菌落利用此物質(zhì)形成透明圈。利用一些有特別營養(yǎng)要求的微生物作為工具菌,如待篩選菌具將有該營養(yǎng)物的前體轉(zhuǎn)化成營養(yǎng)物能力,工具菌就能圍繞該菌生長.待篩選的菌株能分泌產(chǎn)生某些能抑制工具菌生長的物質(zhì)④厭氧性微生物的別離法ⅰ.去除培養(yǎng)基中的溶解氧，降低Eh煮沸法：將培養(yǎng)基置沸水中煮沸15分鐘，驅(qū)除其中的溶解氧，勿再搖動，Eh可降至0.1V以下培養(yǎng)基預(yù)復(fù)原：將培養(yǎng)基中參加復(fù)原性物質(zhì)：半胱氨酸，巰基化生物，Na2S，抗壞血酸等降低Ehⅱ.創(chuàng)造無氧環(huán)境物理除氧空氣置換法：枯燥器或厭氧培養(yǎng)罐抽真空76mmHg→充入N2〔反復(fù)3次〕→充入CO210%+H210%+N280%化學(xué)除氧H2+O2→H2O(鈀作催化劑〕GASPAK罐除氧：硼氫化鈉、檸檬酸，碳酸氫鈉化學(xué)反響產(chǎn)生H2和CO2，H2與O2反響生成水厭氧指示劑ⅲ.厭氧別離〔培養(yǎng)〕技術(shù)高層瓊脂柱技術(shù)厭氧罐技術(shù)厭氧手套箱技術(shù)GasPak⑤篩選—初篩：通風(fēng)發(fā)酵菌種，通過搖瓶發(fā)酵進行，每株一瓶目的：淘汰80%-90%的別離菌株中的低產(chǎn)菌培養(yǎng)條件：主要通過查閱資料及需要而預(yù)先決定，如培養(yǎng)基組成，通風(fēng)量〔裝液量，搖瓶機轉(zhuǎn)數(shù)〕，pH、溫度、培養(yǎng)時間等。分析測定：最好定量，如較困難時可采取半定量方法—復(fù)篩：每株3-5瓶，可提前培養(yǎng)種子，使接種量比較一致，3-5%接種量，培養(yǎng)條件可同初篩分析測定：定量，注意副產(chǎn)物

復(fù)篩可進行屢次，逐步淘汰，留下3-5株甚至最好的1株初篩和復(fù)篩的比較⑥培養(yǎng)工藝條件試驗與生產(chǎn)試驗—搖瓶發(fā)酵條件培養(yǎng)基組成，初始pH，通風(fēng)量〔裝液量〕，接種量，培養(yǎng)溫度…—小型臺式發(fā)酵罐發(fā)酵工藝條件溶解氧控制，pH值控制，原料添加模式，消泡劑…9.1.1紫外線誘變

造成DNA鏈的斷裂，或使DNA分子內(nèi)或分子之間發(fā)生交聯(lián)反響

機理交聯(lián)是由二聚體引起的，二聚體可以在同一條鏈相鄰的堿基之間產(chǎn)生，也可以是在二條鏈的堿基之間形成。

物理誘變紫外線化學(xué)誘變5-溴尿嘧啶引起DNA復(fù)制錯誤

9.1誘變育種嘧啶比嘌呤對紫外線敏感得多胸腺嘧啶二聚體嘧啶的紫外線光化產(chǎn)物●胸腺嘧啶二聚體的修復(fù)①光復(fù)活作用微生物等生物的細胞內(nèi)存在光復(fù)活酶

光復(fù)活酶識別胸腺嘧啶二聚體，并與之結(jié)合形成復(fù)合物翻開二聚體,將DNA復(fù)原?？梢姽夤饽?300-500nm)激活光復(fù)活酶此時的光復(fù)活酶沒有活性PRE為光復(fù)活酶

②暗修復(fù)作用一種不需要光激活的修復(fù)體系?？尚迯?fù)由紫外線、γ射線和烷化劑等對DNA造成的損傷。切開二聚體的5’-末端,形成3’-

OH和5-P的單鏈缺口從5’-P到3’-OH方向切除二聚體,并擴大缺口以另一條互補鏈為模板,從原有鏈上暴露的3’-OH端起合成缺失片段將新合成鏈的3’-OH與原鏈的5’-P相連接方便、誘變效果很好的常用誘變劑參數(shù)：紫外燈功率、工作距離、照射時間●紫外誘變的特點〔自學(xué)〕9.1.25-溴尿嘧啶誘變-堿基類似物

機理：與堿基的結(jié)構(gòu)類似，在DNA復(fù)制時，它們可以被錯誤地摻入DNA，引起誘變效應(yīng)。

酮式的5-BU結(jié)構(gòu)與胸腺嘧啶相似，與A配對

5-BU很容易進行酮式與烯醇式結(jié)構(gòu)的互變異構(gòu)

A：T

G：C

烯醇式5-BU不與A而與G配對9.1.3誘變育種的根本過程如下：●出發(fā)菌株的來源與選擇①一是考慮出發(fā)菌株是否具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力,即菌株是否具有產(chǎn)生特定代謝產(chǎn)物的催化酶系的基因。②其次是出發(fā)菌株最好已具備一些有利的性狀,如生長速度快、營養(yǎng)要求低和產(chǎn)孢子早而多的菌株。③誘變的菌株在遺傳性狀上是穩(wěn)定的,即遺傳上同質(zhì)。因此,誘變育種要選擇單倍體或單核細胞作為出發(fā)菌,也就是要選擇純種。菌株來源自然界直接別離到的野生型菌株經(jīng)歷過生產(chǎn)條件考驗的菌株已經(jīng)歷屢次育種處理的菌株●菌懸液的制備①用于制備單細胞菌懸液的斜面培養(yǎng)物要年輕、健壯，而且一般要求新鮮的斜面培養(yǎng)物處于對數(shù)生長期，并采取一定的措施促使細胞處于同步生長。②懸液的均一性可保證誘變劑與每個細胞時機均等并充分地接觸，防止出現(xiàn)不純的菌落，給后續(xù)的篩選工作造成困難。用玻璃珠振蕩打散細胞團，再用脫脂棉花或濾紙過濾，得到分散的菌體。

產(chǎn)孢子或芽孢的微生物最好采用其孢子或芽孢。③菌懸液的細胞濃度控制為：真菌孢子或酵母細胞106107個/ml，放線菌或細菌108個/ml。菌懸液一般用生理鹽水〔0.85%NaCl〕稀釋?！裾T變處理②在誘變處理前，一般應(yīng)預(yù)先做誘變劑用量對菌體死亡數(shù)量的致死曲線，選擇適宜的處理劑量。①誘變劑的選擇。誘變劑主要是DNA上某些位點發(fā)生作用，如紫外線產(chǎn)生嘧啶二聚體；亞硝酸脫氨基變酮基；亞硝基胍用于營養(yǎng)缺陷型突變體的誘化；移碼誘變劑誘化質(zhì)粒的脫落等。③就一般微生物而言，突變率隨劑量的增大而增高，但到達一定劑量后，再加大劑量反而會使突變率下降。致死率在70%-80%.一般地,誘變劑對產(chǎn)量性狀的誘變作用為:劑量大(小),殺菌率高(低),負變株多(少),正變株少(多),但少(大)量正變株中可(難)篩選到產(chǎn)量大幅度提高的菌株。④誘變育種中還常常采取誘變劑復(fù)合處理,使它們產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)●菌種的篩選分為隨機篩選和平板菌落預(yù)篩選兩種方法。前者是隨機挑選平板菌落進行搖瓶篩選；后者是根據(jù)某種代謝產(chǎn)物的特異性，所設(shè)計出的檢出目標(biāo)突變株的一種精巧的平板篩選方法。復(fù)篩:應(yīng)該做到精確，測得的數(shù)據(jù)要能夠反映將來的生產(chǎn)水平(多級水平篩選)。篩選根本策略篩選根本方法初篩:要力求快速、簡便。

①根據(jù)菌體形態(tài)變異預(yù)篩選平板菌落預(yù)篩選可分為以下幾種方式：②根據(jù)平板菌落生化反響直接挑取突變株—采用指示劑篩選高產(chǎn)菌株如Glu產(chǎn)生菌的平板預(yù)篩法,常在培養(yǎng)基中參加溴百里酚蘭指示劑,培養(yǎng)后在藍色平板菌落周圍出現(xiàn)黃色,根據(jù)直徑大小,初步篩選出優(yōu)良的突變株?！割惍a(chǎn)生菌的平板預(yù)篩法如淀粉酶產(chǎn)生菌的預(yù)篩法:以淀粉為底物制成平板,誘變后的菌體涂布平板,菌落形成后,用碘液浸涂,根據(jù)菌落周圍的無變色區(qū)大小,決定取舍。③根據(jù)濃度梯度法挑取突變株抗生素產(chǎn)生菌合成抗生素的能力與其對自身抗生素的抗性有關(guān)。一般地，這種抗性越高，其生產(chǎn)能力也越高。搖瓶培養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)法是將待測菌株的單菌落分別接種到三角瓶培養(yǎng)液中,振蕩培養(yǎng),然后,再對培養(yǎng)液進行分析測定。對于多級水平的搖瓶培養(yǎng)，應(yīng)盡可能的保證培養(yǎng)條件的一致性，即三角瓶的大小、培養(yǎng)液的量、紗布的層數(shù)、搖床轉(zhuǎn)速、溫度以及pH等等。另外，還應(yīng)該注意培養(yǎng)條件應(yīng)盡可能的與發(fā)酵條件接近。因為，高產(chǎn)菌株選育的最終目標(biāo)是生產(chǎn)上的應(yīng)用。●常見突變株的篩選①營養(yǎng)缺陷型突變株根本培養(yǎng)基(mimimalmedium,MM):營養(yǎng)貧乏,氮源由無機物組成,不含AA、Vitamin和核酸堿基等有機物,野生型能生長,營養(yǎng)缺陷型不能生長。補充培養(yǎng)基(supplementarymedium,SM):根本培養(yǎng)基上參加某一營養(yǎng)缺陷型菌株不能合成的營養(yǎng)因子,只能滿足該營養(yǎng)缺陷菌株和野生型菌株的生長。完全培養(yǎng)基(completemedium,CM):營養(yǎng)豐富，碳源和氮源都是一些有機物，能滿足各種營養(yǎng)缺陷菌株和野生型菌株的生長。誘變和營養(yǎng)缺陷菌株的富集誘變劑采用亞硝基胍、亞硝酸和紫外線等。富集手段常采用抗生素法(細菌和酵母菌)、菌絲過濾法(真菌和放線菌等絲狀菌)和高溫殺菌法(產(chǎn)芽孢菌的芽孢和營養(yǎng)體對熱敏感的差異性)等。營養(yǎng)缺陷菌株的檢出常采用的檢出方法有:點植對照檢測法、限量補充法、影印法、夾層法等。夾層培養(yǎng)法點植對照法影印法營養(yǎng)缺陷菌株的鑒定通常采用生長譜法和組合補充培養(yǎng)基法來鑒定。生長譜測定:在同一培養(yǎng)皿上測定一種營養(yǎng)缺陷型菌株對許多生長因子的需求情況。②抗噬菌體菌株的選育效價:每毫升試樣中所含有的噬菌體的數(shù)量。原噬菌體:浸入到細菌的溫和噬菌體，其DNA整合到宿主染色體上,不能成為原有的顆粒形態(tài),這種隱秘狀態(tài)的噬菌體稱為原噬菌體。復(fù)愈:溶源性細菌以偶然的時機失去原噬菌體而成為非溶源性細菌的過程。免疫性:溶源性細菌對同一類噬菌體具免疫性，表現(xiàn)為釋放的成熟噬菌體，即使附著在溶源性細菌的CW上，或者已經(jīng)浸染，但不能在細胞內(nèi)繁殖的現(xiàn)象。噬菌體的別離與效價測定—快速測定法將噬菌體和對數(shù)期敏感細胞懸浮液與含0.5－0.8％瓊脂培養(yǎng)基混合,加到無菌載玻片上平展凝固培養(yǎng)后,觀察噬菌斑并計數(shù)?！p層瓊脂法菌液+噬菌體試樣+瓊脂培養(yǎng)基(1%瓊脂)噬菌斑數(shù)=試樣中噬菌體數(shù)培養(yǎng)10天計數(shù)噬菌斑瓊脂平板(2%瓊脂)抗噬菌體的選育—高濃度噬菌體原液的制備①專一性噬菌體的獲得與純化②高效價噬菌體原液的制備③噬菌體原液效價的測定效價(單位/mL)＝平均每皿噬菌斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×取樣量折算例如:噬菌體原液稀釋倍數(shù)為107,取樣量測定量為0.1ml(那么折算數(shù)為10),三個平板的溶菌斑數(shù)目分別為275、252、263,那么噬菌體原液的效價為:1/3(275+252+263)×107×10＝2.63×1010(pfu/ml)?！T變與抗性噬菌體菌株的別離—液體搖瓶振蕩培養(yǎng)—進一步考察抗性菌株對周圍環(huán)境中存在的各種噬菌體的抗性?？剐跃甑奶匦匝芯竣倏剐跃甑姆€(wěn)定性研究②抗性菌株的產(chǎn)量性能研究③抗反響阻遏和抗反響抑制突變菌株的選育抗阻遏和抗反響突變型都是由于代謝失調(diào)所造成的，在細胞中已經(jīng)有大量最終代謝產(chǎn)物時仍然繼續(xù)不斷地合成這一產(chǎn)物。通常采用結(jié)構(gòu)類似物篩選抗性突變株指一些和細菌體內(nèi)氨基酸、嘌呤、維生素等代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相類似的物質(zhì)。主要用于末端產(chǎn)物的積累將遺傳性狀不同的兩種菌(包括種間、種內(nèi)及屬間)融合為一個新細胞的技術(shù)。它包括親本的選擇、原生質(zhì)體的制備與再生、原生質(zhì)體的融合、融合子別離以及遺傳特性分析與測定五大步驟。9.2體內(nèi)基因重組育種接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和原生質(zhì)體融合等遺傳學(xué)方法和技術(shù)使微生物細胞內(nèi)發(fā)生基因重組?！裨|(zhì)體融合原生質(zhì)體融合的一般原理和過程：①親本的選擇選擇遺傳性狀穩(wěn)定且具有優(yōu)勢互補的兩個親株為了能明確檢測到融合子,參與融合的親株一般都需要帶有可以識別的遺傳標(biāo)記,如營養(yǎng)缺陷型或抗藥性等。②原生質(zhì)體制備

細胞壁的去除是原生質(zhì)體制備的關(guān)鍵。去壁的方法有三種:機械法、非酶別離法和酶法。—革蘭氏陰性菌不能直接溶壁,只有當(dāng)乙二胺四乙酸〔EDTA〕存在時,某些革蘭氏陰性菌的細胞壁才能夠被溶菌酶溶解。金黃色葡萄球菌

溶菌酶不能溶解表皮葡萄球菌能產(chǎn)生一種內(nèi)肽酶—葡萄球菌素溶解—革蘭氏陽性菌如微球菌、枯草桿菌、巨大芽孢桿菌、黃色八疊球菌的細胞壁主要由肽聚糖組成。采用溶菌酶破壁?！啪€菌的細胞壁結(jié)構(gòu)類似于革蘭氏陽性菌也可采用溶菌酶?！婢毎谥饕衫w維素、幾丁質(zhì)和葡聚糖等組成青霉菌多用纖維素酶和

-1,3-糖苷酶等溶壁曲霉用

-1,3-糖苷酶和

-1,4-糖苷酶等酵母菌細胞壁中的葡聚糖和幾丁質(zhì)蝸牛酶▲在菌體生長階段添加蔗糖也能提高細胞壁對溶菌酶的敏感性?！诰w生長對數(shù)期參加適量青霉素,就能使細胞對溶菌酶更敏感。原生質(zhì)體制備的其他因素：▲一般是將原生質(zhì)體放在高滲的環(huán)境中以維持它的穩(wěn)定性?！g:對數(shù)生長中期細胞的細胞壁中肽聚糖含量很低,對溶菌酶敏感?！囵B(yǎng)基中添加甘氨酸,可以使菌體(放線菌)較容易被酶解聚乙二醇〔PEG〕能有效地促進原生質(zhì)體融合一般PEG的使用濃度范圍在25-40%。采用電融合儀:在高頻電場下,用直流電穿孔來進行融合。使原生質(zhì)體重新長出細胞壁,恢復(fù)完整的細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。③原生質(zhì)體融合

④原生質(zhì)體再生不同微生物的原生質(zhì)體的最適再生條件不同,最重要的一個共同點是都需要高滲透壓。⑤融合重組子的篩選把融合液涂布在營養(yǎng)豐富的高滲再生平板上,使親株和重組子都再生成菌落,然后用影印法將它們復(fù)制到選擇培養(yǎng)基上檢出重組子。間接法直接法將融合液涂布在不補充親株生長需要的生長因子的高滲再生培養(yǎng)基平板上，直接篩選出原養(yǎng)型重組子融合重組的頻率=兩親株原生質(zhì)體再生菌落的總數(shù)融合重組子●雜交育種進行體內(nèi)基因重組育種的其它方法包括接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等許多重要的具生產(chǎn)價值的微生物的雜交、有性世代等尚未揭示阻礙了雜交育種手段的實際應(yīng)用●基因工程育種這是一種自覺的、能象工程一樣事先設(shè)計和控制的育種技術(shù)，可以完成超遠緣雜交，是最新最有前途的育種方法?；蚬こ痰膽?yīng)用仍有很大的局限性：

②蛋白質(zhì)類以外的發(fā)酵產(chǎn)物〔如糖類、有機酸、核苷酸及次級代謝產(chǎn)物〕產(chǎn)生往往受到多個基因的控制，尤其是還有許多發(fā)酵產(chǎn)物的代謝途徑還沒有被確證③基因工程〔包括代謝工程〕還難以完全取代傳統(tǒng)的菌種選育方法①基因工程產(chǎn)品主要還是一些較短的多肽和小分子蛋白質(zhì)

DNAShuffling技術(shù)—體外同源重組技術(shù)來源不同但功能相同的一組同源基因用DNA核酸酶I進行消化產(chǎn)生隨機小片段并組成文庫互為引物和模板，進行PCR擴增，引起模板轉(zhuǎn)換，重組因而發(fā)生克隆并選擇正突變體選擇正突變體作新一輪的體外重組根本步驟(1)用DNaseI消化功能相同的一組基因片段(A)，從而產(chǎn)生隨機小片段(B)。(2)經(jīng)提純后，用無引物(經(jīng)變性后可互為引物)的類似PCR反響重新裝配這些小片段成完整長度的重組基因片段(C)，在裝配過程中被證明有低水平點突變產(chǎn)生。3)克隆并選擇正突變體(D)，并將正突變體的重組基因片段作新一輪的體外重組。④代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對宿主寄生能力下降。10.菌種的衰退、復(fù)壯及保藏●菌種的衰退與復(fù)壯的概念衰退的原因：①基因突變，②別離現(xiàn)象。①菌落和細胞形態(tài)的改變；②生長速度緩慢，產(chǎn)孢子越來越少；

常見的衰退現(xiàn)象：③抵抗力、抗不良環(huán)境能力減弱等；(1).衰退〔degeneration〕：(2)菌種的復(fù)壯：狹義的復(fù)壯：指在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過純種別離和生產(chǎn)性能測定等方法，從衰退的群體中找出未衰退的個體，以到達恢復(fù)該菌原有典型性狀的措施。廣義的復(fù)壯：指在菌種的生產(chǎn)性能未衰退前就有意識的經(jīng)常、進行純種的別離和生產(chǎn)性能測定工作，以期菌種的生產(chǎn)性能逐步提高。實際上是利用自發(fā)突變〔正變〕不斷地從生產(chǎn)中選種。③淘汰已衰退的個體〔采用比較劇烈的理化條件進行處理，以殺死生命力較差的已衰退個體〕。菌種的復(fù)壯措施：①純種別離：平板劃線法、涂布法、傾注法、單細胞挑取法等。②通過寄主體內(nèi)生長進行復(fù)壯如Bacillusthuringiensis的復(fù)