核酸分析儀校準(zhǔn)規(guī)范

JJF1817—20201核酸分析儀校準(zhǔn)規(guī)范1范圍本規(guī)范適用于基于凝膠電泳原理對核酸片段的長度和濃度進(jìn)行分析的核酸分析儀的校準(zhǔn),適用的核酸片段的長度范圍為(100~1000)bp,對于超出此片段長度范圍的核校準(zhǔn)。2引用文件本規(guī)范引用了下列文件:JJF1265—2010生物計(jì)量術(shù)語及定義凡是注日期的引用文件,僅注日期的版本適用于本規(guī)范;凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本規(guī)范。3術(shù)語和計(jì)量單位3.1片段長度fragmentlength表示核酸片段的大小,以核苷酸數(shù)目(nt)或堿基對數(shù)目(bp)為單位。3.2堿基對(bp)basepair核酸中兩條鏈間的配對堿基。如腺嘌呤-胸腺嘧啶(A-T)對、腺嘌呤-尿嘧啶(A-U)、鳥嘌呤-胞嘧啶(G-C)對、鳥嘌呤-尿嘧啶(G-U)對等。堿基對數(shù)目是表征DNA或雙鏈RNA的長度。[JJF1265—2010,4.41]4概述核酸分析儀(以下簡稱分析儀)是基于凝膠電泳技術(shù)原理,將不同大小的雙鏈核酸片段進(jìn)行分離,在熒光染料存在的條件下,熒光染料嵌入雙鏈核酸中發(fā)出熒光,對熒光信號進(jìn)行檢測分析的儀器,可根據(jù)各核酸片段的電泳時(shí)間和熒光信號值進(jìn)行定性、定量分析。分析儀通常由進(jìn)樣器、毛細(xì)管/微芯片、熒光檢測光學(xué)部件、微電路控制部件、計(jì)算機(jī)及應(yīng)用軟件組成,可用于單個(gè)和多重PCR片段、限制性內(nèi)切酶消化的DNA等片段長度和濃度的分析。5計(jì)量特性5.1示值誤差片段長度示值誤差和片段濃度示值誤差。5.2重復(fù)性JJF1817—20202片段長度重復(fù)性和片段濃度重復(fù)性。5.3片段濃度線性6校準(zhǔn)條件6.1環(huán)境條件實(shí)驗(yàn)室環(huán)境應(yīng)當(dāng)滿足分析儀安裝的要求,不得存在強(qiáng)烈的機(jī)械振動和電磁干擾,校準(zhǔn)時(shí)實(shí)驗(yàn)室溫度應(yīng)當(dāng)控制在(15~30)℃,相對濕度不大于80%,并確保校準(zhǔn)過程中環(huán)境溫度變化小于3℃。6.2校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和校準(zhǔn)設(shè)備6.2.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)采用國內(nèi)外有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),如DNA片段標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),片段濃度≥40ng/μL,相對擴(kuò)展不確定度≤5%(k=2),片段長度范圍(100~1000)bp。6.2.2校準(zhǔn)用試劑和溶液按照附錄A配制校準(zhǔn)用試劑和標(biāo)準(zhǔn)溶液。根據(jù)被校準(zhǔn)儀器型號選擇配套的試劑盒。校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保存在-20℃,配套試劑盒保存在4℃。6.2.3移液器量程范圍(1~10)μL、(10~100)μL,經(jīng)檢定合格。7校準(zhǔn)項(xiàng)目和校準(zhǔn)方法校準(zhǔn)前將低溫保存的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及配套試劑提前拿出冰箱,平衡30min后按照附錄A配制及使用標(biāo)準(zhǔn)溶液。打開儀器,預(yù)熱10min。7.1示值誤差7.1.1校準(zhǔn)板的準(zhǔn)備參照試劑盒說明書,用移液器將示值誤差校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到校準(zhǔn)板中。若校準(zhǔn)板為3×4孔的芯片模式,按照表1所示準(zhǔn)備校準(zhǔn)板;若校準(zhǔn)板為12聯(lián)排管模式,按照表2所示準(zhǔn)備校準(zhǔn)板;其他模式的校準(zhǔn)板可參照表1和表2準(zhǔn)備,空白用一級水代替標(biāo)準(zhǔn)溶液。表1校準(zhǔn)板為3×4孔的芯片模式時(shí)的加樣排布孔號樣品1~3標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液4~6標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液7~9標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液10~12標(biāo)準(zhǔn)溶液空白空白JJF1817—20203表2校準(zhǔn)板為12聯(lián)排管模式時(shí)的加樣排布孔號123456789101112樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液空白片段長度標(biāo)準(zhǔn)品注:片斷長度標(biāo)準(zhǔn)品為配套試劑盒內(nèi)的長度標(biāo)準(zhǔn)品。7.1.2片段長度示值誤差參照儀器說明書,將準(zhǔn)備好的校準(zhǔn)板置于分析儀內(nèi)進(jìn)行測量。記錄10次片段長度測定值,按式(1)計(jì)算片段長度示值誤差。ΔCbp=Cbp-Cbps(1)式中:ΔCbp—片段長度示值誤差,bp;Cbp—片段長度測量的算術(shù)平均值(保留整數(shù)),bp;Cbps—片段長度標(biāo)準(zhǔn)值,bp。7.1.3片段濃度示值誤差參照儀器說明書,將準(zhǔn)備好的校準(zhǔn)板置于分析儀內(nèi)進(jìn)行測量。記錄10次片段濃度測定值,按式(2)計(jì)算片段濃度示值誤差。ΔCcon=Ccon-Ccons(2)式中:ΔCcon—片段濃度示值誤差,ng/μL;Ccon—片段濃度測量的算術(shù)平均值,ng/μL;Ccons—片段濃度標(biāo)準(zhǔn)值,ng/μL。7.2重復(fù)性參照7.1.1的加樣方式,重復(fù)測量10次標(biāo)準(zhǔn)溶液的片段長度和片段濃度,按式(3)分別計(jì)算相對實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差,作為片段長度重復(fù)性和片段濃度重復(fù)性。RSD=(nX-iX)2××100%(3)式中:RSD—相對實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差,%;Xi—第i次DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的片段濃度或片段長度測得值,ng/μL或bp;X—n次片段濃度或片段長度測得值的算術(shù)平均值,ng/μL或bp;n—測量次數(shù)。7.3濃度線性7.3.1校準(zhǔn)板的準(zhǔn)備參照試劑盒說明書,用移液器將配制好的0.1ng/μL、1ng/μL、4ng/μL、10ng/μL、40ng/μL的DNA片段濃度線性標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到校準(zhǔn)板中,每個(gè)濃度加樣2次,按表1或表JJF1817—202042所示排布準(zhǔn)備校準(zhǔn)板,其他模式的校準(zhǔn)板可參照表1和表2準(zhǔn)備,空白用一級水代替標(biāo)準(zhǔn)溶液。7.3.2片段濃度線性參照儀器說明書,將準(zhǔn)備好的校準(zhǔn)板置于分析儀內(nèi)進(jìn)行測量。每個(gè)濃度的線性標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行2次重復(fù)測量,取其濃度的算術(shù)平均值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度標(biāo)準(zhǔn)值為橫坐標(biāo)和測得的濃度平均值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,按式(4)計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)γ。(Ci-C)(Csi-Cs)γ(4)(Ci-C)2·(Csi-Cs)2式中:γ—線性相關(guān)系數(shù);Ci—第i種線性標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度測量值,ng/mL;C—線性標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度測量值的算術(shù)平均值,ng/mL;Csi—第i種線性標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度標(biāo)準(zhǔn)值,ng/mL; Cs—線性標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度標(biāo)準(zhǔn)值的算術(shù)平均值,ng/mL;n—線性標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度個(gè)數(shù)。8校準(zhǔn)結(jié)果表達(dá)按本規(guī)范進(jìn)行校準(zhǔn),原始記錄格式參考附錄B,不確定度評定參照附錄D,校準(zhǔn)結(jié)果在校準(zhǔn)證書上反映,校準(zhǔn)證書應(yīng)符合JJF1071—2010中5.12的要求,參照附錄C給出校準(zhǔn)項(xiàng)目名稱、測量值以及擴(kuò)展不確定度。9復(fù)校時(shí)間間隔根據(jù)實(shí)際使用情況,送校單位可根據(jù)實(shí)際使用情況自主決定復(fù)校時(shí)間間隔,建議不超過1年。JJF1817—20205附錄A校準(zhǔn)用試劑和溶液配制及使用方法A.1純水:符合GB/T6682規(guī)定的一級水。A.4乙二胺四乙酸(EDTA):分析純。A.5TE緩沖液的配制:用分度值為0.00001g的天平稱量1.576g的Tris-HCl,0.292g的EDTA,加入至1L的三角瓶內(nèi),向三角瓶內(nèi)加入700mL一級水,待全部溶解后,調(diào)節(jié)pH至8.0,然后用1L的量筒定容。A.6校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。A.6.1示值誤差和重復(fù)性校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)溶液:用TE緩沖液將DNA片段標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋為2ng/μL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。A.6.2線性校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)溶液:用TE緩沖液將DNA片段標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別稀釋為0.1ng/μL、1ng/μL、4ng/μL、10ng/μL、40ng/μL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。A.7標(biāo)準(zhǔn)溶液的使用溶液上樣量按照被校儀器說明書執(zhí)行。以12聯(lián)排管或8聯(lián)排管模式進(jìn)樣的分析儀,上樣量一般為15μL。以12孔芯片模式進(jìn)樣的分析儀,每孔上樣量一般為1μL。JJF1817—20206附錄B校準(zhǔn)原始記錄參考格式送檢單位:校準(zhǔn)日期:年月日儀器名稱:制造廠:型號:出廠編號:證書編號:環(huán)境溫度:℃相對濕度:%氣壓:kPaB.1片段長度示值誤差和片段長度重復(fù)性校準(zhǔn)記錄標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)名稱標(biāo)準(zhǔn)值Cbpbp片段長度測量值bp測量值的平均值 Cbp/bp相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSDB.2濃度示值誤差和濃度重復(fù)性校準(zhǔn)記錄標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)名稱標(biāo)準(zhǔn)值Cconng/μL濃度測量值ng/μL測量值的平均值 Ccon/(ng/μL)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSDB.3線性序號S1S2S3S4S5標(biāo)準(zhǔn)值/(ng/μL)測量值/(ng/μL)相關(guān)系數(shù)γ校準(zhǔn)員:核驗(yàn)員:7附錄C校準(zhǔn)證書內(nèi)頁參考格式表C.1校準(zhǔn)項(xiàng)目和校準(zhǔn)結(jié)果序號校準(zhǔn)項(xiàng)目校準(zhǔn)結(jié)果1片段長度示值誤差測量值:2濃度示值誤差測量值:不確定度:(k=2)3片段長度重復(fù)性測量值:4濃度重復(fù)性測量值:5線性測量值:校準(zhǔn)員:核驗(yàn)員:JJF1817—20208附錄D濃度示值誤差的不確定度評定示例D.1測量方法采用分析儀直接測定DNA片段含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),并與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)稱值進(jìn)行比較。D.2測量模型濃度校準(zhǔn)結(jié)果的示值誤差按照式(D.1)計(jì)算:ΔCcon=Ccon-Ccons(D.1)式中:ΔCcon—濃度示值誤差,ng/μL;Ccon—儀器測量平均值,ng/μL;Ccons—標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)稱值,ng/μL。在校準(zhǔn)過程中環(huán)境溫度波動控制在小于3℃,因此忽略環(huán)境溫度的影響。D.3合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算公式根據(jù)測量模型,且輸入量Ccon和Ccons之間不相關(guān),所以測量結(jié)果的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度按式(D.2)計(jì)算:uc=(D.2)D.4不確定度來源不確定度來源包括:a)測量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(Ccon);b)片段含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(Ccons);測量重復(fù)性和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度不相關(guān),所以合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度根據(jù)式D.2進(jìn)行計(jì)算。下面以一次分析儀校準(zhǔn)為例,具體分析其測量不確定度。在校準(zhǔn)中對200bp含量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測定,結(jié)果分別為2.51ng/μL、2.76ng/μL、2.65ng/μL、2.65ng/μL、2.57ng/μL、2.51ng/μL、2.74ng/μL、2.69ng/μL、2.54ng/μL、2.78ng/μL;該片段長度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋液的含量標(biāo)準(zhǔn)值為2.85ng/μL±0.08ng/μL(k=2)。D.5標(biāo)準(zhǔn)不確定度一覽表標(biāo)準(zhǔn)不確定度一覽表見表D.1。D.6標(biāo)準(zhǔn)不確定度評定D.6.1測量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(Ccon)在校準(zhǔn)中DNA含量測定結(jié)果的值分別為2.51ng/μL、2.76ng/μL、2.65ng/μL、2.65ng/μL、2.57ng/μL、2.51ng/μL、2.74ng/μL、2.69ng/μL、2.54ng/μL、2.78ng/μL,單次測量的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差s(xi)為:JJF1817—2020 s(xi)=i-1x)2=0.103(ng/μL)則測量結(jié)果平均值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:u(Ccon)=s(xi)/=0.103/=0.033(ng/μL)D.6.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(Ccons)u(Ccons)包含了未稀釋的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度u(Cy-con)和稀釋過程引入的不確定度,未稀釋的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書提供的擴(kuò)展不確定度U(MS)和包含因子k(Ccon)根據(jù)式(D.3)計(jì)算:u(Cy-con)=