轉(zhuǎn)基因小鼠的制備

轉(zhuǎn)基因小鼠的制備顯微注射法這一方法的實(shí)驗(yàn)程序如下：⑴準(zhǔn)備假孕母鼠（養(yǎng)母）：將可育雌鼠與輸精管結(jié)扎后絕育的雄鼠交配，剌激雌鼠發(fā)生一系列妊娠變化而得到假孕母鼠作為受精卵轉(zhuǎn)基因后的養(yǎng)母；⑵受精卵的準(zhǔn)備：可育雌鼠注射孕馬血清與絨毛膜促性腺激素（hcg）促使超排卵。處理后與可育雄鼠交配。次日從輸卵管內(nèi)收集受精卵備用；⑶基因?qū)耄河蔑@微注射裝置將目的基因溶液導(dǎo)入受精卵雄性原核內(nèi)；⑷胚胎移植：將已轉(zhuǎn)入基因的受精卵自背部植入假孕母鼠的輸卵管內(nèi)，使胚胎在養(yǎng)母體內(nèi)發(fā)育成熟；⑸對幼鼠的鑒定：幼鼠發(fā)生斷乳后自尾部提取DNA，與目的基因探針作分子雜交，鑒定外源基因是否整合，有整合的鼠稱為首建鼠（founder）；建立鼠系，將帶有外源基因的小鼠與未經(jīng)轉(zhuǎn)基因的小鼠交配、傳代后，后代有50%機(jī)率帶有整合的基因供實(shí)驗(yàn)用。也可將合適的組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)建立細(xì)胞系；自小鼠內(nèi)臟提取rna，與目的基因探針做分子雜交，比鑒定外源基因的表達(dá)和表達(dá)的組織特異性。表達(dá)產(chǎn)物可以測定活性的，也可直接自血液或組織測定活性蛋白質(zhì)，常用的方法如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（elisa）或放射免疫測定（ria）等。亦可取胚胎進(jìn)行分析。顯微注射法簡化的實(shí)驗(yàn)過程如圖23-2所示。我國已有少數(shù)實(shí)驗(yàn)室（如中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所）應(yīng)用此法進(jìn)行載脂蛋白tgm研究。oXoSouthern—5——二酸如;蟲oXoSouthern—5——二酸如;蟲注射忡圈箭基因打靶與基因剔除技術(shù)ES細(xì)胞是從哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育產(chǎn)生的內(nèi)胚團(tuán)(innercellmass)中分離出來的。它本身是二倍體，能在體外培養(yǎng)，具有高度的全能性，可以形成包括生殖細(xì)胞在內(nèi)的所有組織，并且在不同的培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出不同的功能狀態(tài)。這種細(xì)胞有兩個(gè)特點(diǎn)，一是它本身可以分裂、增殖，形成細(xì)胞集落；另一特點(diǎn)是經(jīng)過發(fā)育可以形成正常的動(dòng)物后代。因此，借用ES細(xì)胞系可將人們企望的某種不完整的、無功能基因直接引入到ES細(xì)胞中，通過細(xì)胞增殖、篩選可得到喪失了某種基因功能的動(dòng)物后代。正是由于ES細(xì)胞的研究成功與廣泛應(yīng)用，才使得基因打靶與基因剔除技術(shù)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的應(yīng)用成為可能而且近來取得長足發(fā)展?；虼虬惺侵竿庠碊NA片段上帶有與受體細(xì)胞染色體相應(yīng)部位的同源序列，導(dǎo)入ES細(xì)胞后在同源部位發(fā)生定點(diǎn)整合，這種整合是通過同源重組的方式來實(shí)現(xiàn)的。該方法的一般策略如下：

墓國15渙純的粗恐祀基疸靶度乾射人戲選ES細(xì)裁中的雜音于忙ES奈舍子E盲/-｝細(xì)產(chǎn)建入袴東胚驛中特⑷一2廿牛怎舲錢尊到

毆尋掘子色于泵選帯有總/去菸于代小夙雜合子小feUM—'左配乘交拜迭.鑒定雜交甌(4"、-Z?i■/卜)和用臨國工最商漬胃越級碑功俺冗祚，蛤坯子已賽亦勒離時(shí)磴挺箏婆用怕沖擊蟄:1」罔代貳茁堵盛蓋特異性掇針盞交法I3爭鶴切屈謹(jǐn)法:丨-加“皋mbk詔噸(D、人卬違乗交〉(2.XftnhcmtlauingtRi^A印iS柴墅)和用臨國工最商漬胃越級碑功俺冗祚，蛤坯子已賽亦勒離時(shí)磴挺箏婆用怕沖擊蟄:1」罔代貳茁堵盛蓋特異性掇針盞交法I3爭鶴切屈謹(jǐn)法:丨-加“皋mbk詔噸(D、人卬違乗交〉(2.XftnhcmtlauingtRi^A印iS柴墅)1-縛靜怪按針來交法2.$(XiE]ViHYM?Tir^;3-?<ctiTi^!tibfciCling目前篩選真正發(fā)生了同源重組的ES細(xì)胞的方案有數(shù)種如正負(fù)雙向選擇法（positiveandnegativeselection,pns）、標(biāo)記基因的特異位點(diǎn)表達(dá)法及PCR法，其中用得最多的方法首推pns法。其基本原理是：構(gòu)建含有一段與靶基因同源序列（10~15kb）的載體，該序列的一個(gè)外顯子插有neor基因作為正選擇的標(biāo)志，在此序列3'端插有不含啟動(dòng)子的皰疹病毒胸苷激酶（hsv-tk）基因作為負(fù)選擇，hsv-tk基因由鄰近的neor基因啟動(dòng)子調(diào)節(jié)。用電轉(zhuǎn)移（electroporation）法將重組體導(dǎo)入ES細(xì)胞，繼續(xù)作體外培養(yǎng)，并以新霉素（g418）和致死核苷類似物（ganc）作雙重篩選。因隨機(jī)插入的DNA通常以從頭至尾整合入受體細(xì)胞DNA中,sv-tk+基因產(chǎn)物可使ganc轉(zhuǎn)變成一種有毒物質(zhì)使細(xì)胞死亡。如果發(fā)生同源重組，由于tk基因在同源區(qū)之外不能整合，neor基因在同源區(qū)之內(nèi)得以保留，這樣受體細(xì)胞抗g418有正選擇作用，對ganc無轉(zhuǎn)變功能而有負(fù)選擇作用，因此認(rèn)為存活的細(xì)胞是與導(dǎo)入基因發(fā)生同源重組的。plump等（1992）用基因剔除技術(shù)已培育出缺apoe基因的tgm模型并利用這一as小鼠模型研究了飲食和遺傳因素對as的影響。23突變型塞閔汨￡藥心2洗I滾菲因5 23突變型塞閔汨￡藥心2洗I滾菲因5 突變據(jù)基兇L野生製基囚5雄》條件性基因剔除是指某一特定細(xì)胞類型或細(xì)胞發(fā)育的特定階段剔除某一特定基因的技術(shù)。目前多采用cre-loxp重組系統(tǒng)(cre-loxp-mediatedgenereplacement,cre-loxprecombinationsystem)。其中cre重組酶來源于侵染大腸桿菌pl噬菌體。分子量38000,無論在大腸桿菌體內(nèi)或體外，它都能啟動(dòng)DNA分子間或分子內(nèi)的聯(lián)合與重組，重組發(fā)生在一^被稱為loxp的特異位點(diǎn)(loxpsite)，且不需要其他的蛋白質(zhì)因子。在cre酶存在時(shí)，兩個(gè)loxp位點(diǎn)可以同源重組，切除其中間的部分，留下一個(gè)loxp位點(diǎn)。其原理如上圖所示。研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中cre重組酶也同樣能引起DNA聯(lián)合和位點(diǎn)特異性重組。條件性基因剔除系統(tǒng)的建立，使得轉(zhuǎn)基因的目的更加明確，效果也進(jìn)一步精確可靠，是基因剔除方法上的一個(gè)重大突破。Cre酶作用原理1、cre基因轉(zhuǎn)譯成cre酶；2、cre酶作用于基因組上loxp位點(diǎn)；3、cre酶使兩個(gè)loxp位點(diǎn)聯(lián)合；4、兩個(gè)loxp位點(diǎn)發(fā)生同源重組切除x基因及一^個(gè)loxp位點(diǎn)而僅留下一^個(gè)loxp位點(diǎn)。1、有待于被剔除的基因組上某野生型基因片段；2、將一個(gè)loxp位點(diǎn)插在野生型基因片段的3'端；3、將新構(gòu)建的DNA序列整合到基因組上；4、在cre酶的作用下切除hsv-tk、neor野生型基因及一個(gè)loxp位點(diǎn)；5、經(jīng)過cre-loxp重組系統(tǒng)作用后所形成的DNA序列。Cu等(1994)在鼠的ES細(xì)胞中利用cre-loxp重組系統(tǒng)進(jìn)行條件性基因剔除的程序如下：①用常規(guī)性基因剔除方法將一段新構(gòu)建的DNA序列整合至內(nèi)源基因組，這段新構(gòu)建的DNA序列由新的(突變的)基因片段，選擇性標(biāo)記基因hsv-tk及neor、一個(gè)將被取代的正?；蚱蔚葞撞糠纸M成。在此新構(gòu)建的DNA序列中，在可選擇性標(biāo)記基因和正?；蚱蔚膬蓚?cè)都連有l(wèi)oxp位點(diǎn)；②經(jīng)過基因剔除的ES細(xì)胞被一個(gè)編碼ere重組酶載體迅速傳染，因此處于兩個(gè)loxp位點(diǎn)之間的hsv-tk、neor及正常的野生型基因均在ere酶的作用下而被切除，只在原來的位置上留下了突變的基因和其3'端帶有一個(gè)loxp位點(diǎn)，其ere-loxp重組系統(tǒng)進(jìn)行條件性基因剔除程序如上圖所示。基因打靶目前的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，如顯微注射、電穿孔、磷酸鈣沉淀及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染等方法，已能有效地將外源基因?qū)氚屑?xì)胞內(nèi)。但這些導(dǎo)入的外源基因在靶細(xì)胞基因組中整合的位點(diǎn)一般是隨機(jī)的，可能導(dǎo)致下面幾種情況出現(xiàn)：導(dǎo)入的外源基因整合入某一正?；虻闹胁浚瑢?dǎo)致該正?；虮磉_(dá)的缺如；導(dǎo)入的外源基因整合入細(xì)胞內(nèi)正常基因的側(cè)翼序列，影響了其周圍正常基因的活性；外源基因的導(dǎo)入有可能激活細(xì)胞內(nèi)的原癌基因；導(dǎo)入的外源基因由于其整合位點(diǎn)的不適，而在細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)或表達(dá)難以控制。為避免上述情況的出現(xiàn)，最好的途徑就是將外源基因?qū)腩A(yù)先確定的位點(diǎn)。即對細(xì)胞內(nèi)靶位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)修飾——基因打靶，而研究該基因的功能或在生物發(fā)育中的作用。隨著人類及四十多種微生物基因組測序的完成，發(fā)現(xiàn)了大量未知功能的基因，應(yīng)用基因打靶技術(shù)對這些新基因進(jìn)行靶向修飾，是研究其功能最直接最有效的手段。因此，基因打靶就日益成為繼基因轉(zhuǎn)移技術(shù)后亟待發(fā)展的新技術(shù)。同源重組(Homologousrecombination)又稱一般性重組或非特異性重組(Generalrecombination)，是指相似的DNA交換遺傳信息的過程，外源DNA片段可與宿主基因組的相應(yīng)片段發(fā)生交換(即重組)。基因打靶通常是指用含已知序列的DNA片段與受體細(xì)胞基因組中序列相同或相近的基因發(fā)生同源重組，整合至受體細(xì)胞基因組中并得以表達(dá)的一種外源DNA導(dǎo)入技術(shù)ES細(xì)胞是一類具有在體外培養(yǎng)條件下保持未分化狀態(tài)的增殖能力及分化為多種細(xì)胞類型的細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞注入體內(nèi)與完整胚胎形成嵌合體后，可以發(fā)育形成包括生殖細(xì)胞在內(nèi)的一系列成體組織；正是由于胚胎干細(xì)胞的特殊功能，ES細(xì)胞基因打靶技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用于建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物之中。打靶載體的構(gòu)建 基因打靶載體包括載體骨架、靶基因同源序列和突變序列及選擇性標(biāo)記基因等非同源序列，其中同源序列是同源重組效率的關(guān)鍵因素。基因打靶載體有基因插入型載體(Gene-insertionvector)和基因置換型載體(Gene—replacementvector)。插入型載體中與靶基因同源的區(qū)段中含有特異的酶切位點(diǎn)，線性化后，同源重組導(dǎo)致基因組序列的重復(fù)，從而干擾了目標(biāo)基因的功能。置換型載體進(jìn)行線性化的酶切位點(diǎn)在引導(dǎo)序列和篩選基因外側(cè)，線性化后，同源重組使染色體DNA序列為打靶載體序列替換。大多數(shù)基因敲除突變都采用置換型載體進(jìn)行基因打靶。外源DNA導(dǎo)人的方式——外源DNA導(dǎo)人的方式主要有顯微注射法、電穿孔法、精子載體法和逆轉(zhuǎn)錄病毒法等。目前應(yīng)用最廣的是顯微注射法。占接受外源DNA細(xì)胞的10％~20％，但顯微注射每次只能注射一個(gè)細(xì)胞，而電穿孔法可同時(shí)使許多細(xì)胞得到轉(zhuǎn)染。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法利用某些病毒與組織細(xì)胞有特異的親合力，可用于時(shí)空特異性基因打靶，在人類疾病的基因治療方面具有較大的發(fā)展?jié)摿?。?）正負(fù)雙向選擇系統(tǒng)（positive-negative-selection,PNS）為了更好地篩選發(fā)生同源重組的克隆，1988年Mansour等人設(shè)計(jì)了PNS,解決了定點(diǎn)整合與隨機(jī)整合的鑒別問題。同源重組時(shí)，只有載體的同源區(qū)以內(nèi)部分發(fā)生重組，同源區(qū)以外部分將被切除。隨機(jī)整合時(shí)，是在載體的兩端將整個(gè)載體連入染色體內(nèi)。置換型載體含有正負(fù)選擇基因各一,正選擇基因多為neor基因，位于同源區(qū)內(nèi)|，其在隨機(jī)整合和同源重組中均可正常表達(dá)。負(fù)選擇基因在靶基因同源區(qū)之外，位于載體的3'末端，常用HSV-tk基因，在同源重組時(shí)，tk基因?qū)⒈磺谐鴣G失，相反在隨機(jī)整合時(shí)，所有的序列均保留（包括tk）。胸苷激酶蛋白（TK）可使無毒的丙氧鳥苷（GANC）轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘院塑账?，而殺死?xì)胞，因而可用丙氧鳥苷篩選排除隨機(jī)整合的細(xì)胞株。故同源重組時(shí)，G418和GANC都有抗性，隨機(jī)整合時(shí)對G418有抗性，但對GANC敏感，細(xì)胞將被殺死，無整合的將被G418殺死。用G418作正篩選，選出含有neor基因的細(xì)胞株，再用丙氧鳥苷作負(fù)篩選淘汰含有tk基因的細(xì)胞株，保留未含有tk基因的同源重組細(xì)胞株。此方法是目前應(yīng)用較廣泛的一種策略。正向篩選標(biāo)記基因Neor具有雙重作用，一方面導(dǎo)致靶基因的插入突變；同時(shí)作為重組細(xì)胞的正向篩選標(biāo)志，該基因產(chǎn)物可使細(xì)胞在含有新霉素的培養(yǎng)基中生長。除了上述方法外，還可用PCR及Southern雜交法進(jìn)一步篩選及鑒定中靶細(xì)胞。常用的選擇標(biāo)記基因：正選擇標(biāo)記基因有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（neor）、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（hph）、黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶（gpt）、次黃嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶（Hprt）、胸腺嘧啶激酶（tk）及嘌呤霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（puro）。負(fù)選擇標(biāo)記基因有單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)、SacB、rpsl(strA)、tetAR、pheS、thyA、CacY、gata-I、ccdB等。(2)正相選擇法(positiveselectionmethod) 這種選擇法適用于在靶細(xì)胞內(nèi)正常表達(dá)的基因的定點(diǎn)突變。其主要程序是：將選擇標(biāo)記基因neor的啟動(dòng)子和起始密碼剪切掉，再嵌合入打靶載體中與靶位點(diǎn)同源的序列內(nèi)，將打靶載體轉(zhuǎn)染進(jìn)靶細(xì)胞，可能出現(xiàn)下面幾種情況：打靶載體不整合入靶細(xì)胞基因組，將隨傳代而丟失；外源打靶序列隨機(jī)整合，由于neor基因缺失了其自身的啟動(dòng)子和起始密碼，整合位點(diǎn)周圍亦無啟動(dòng)子，使neor基因的表達(dá)受阻；雖是隨機(jī)整合，但其整合位點(diǎn)側(cè)翼序列在其它基因的啟動(dòng)子能啟動(dòng)neor基因的表達(dá)；外源打靶載體與靶位點(diǎn)發(fā)生了同源重組，則neor基因可借助靶基因自然存在的啟動(dòng)子和起始密碼的作用而呈現(xiàn)表達(dá)活性。因此，如用G418篩選，則抗性細(xì)胞中將只包含后兩種可能情況，根據(jù)這兩種情況下基因組DNA酶切圖譜的不一致，用Southern印跡雜交即可檢測出同源重組的克隆。位點(diǎn)特異性重組酶(sitespecificrecombinase，SSR)主要有兩個(gè)成員：來自埃希氏大腸桿菌噬菌體P1的Cre/Loxp重組酶系統(tǒng)和來自釀酒酵母2卩質(zhì)粒的FIP/FRT系統(tǒng)。它們以相似的原理在特異性位點(diǎn)切割和連接DNA，誘發(fā)重組。其中Cre/Loxp系統(tǒng)在重組效率上更勝一籌。Cre重組酶由343個(gè)氨基酸組成，分子量38kD，其編碼基因長度大概lkb。Loxp位點(diǎn)則是由34個(gè)堿基組成的“靶”基因位點(diǎn)，由8bp非對稱的核心序列和兩端各當(dāng)ere重組酶識(shí)別Loxp位點(diǎn)后，可以在該位置切斷DNA，并在斷端形成中間體。此后在ere重組酶催化下可重新連接其他DNA片段，由此會(huì)產(chǎn)生幾個(gè)重組結(jié)果：交叉：如果基因組不同DNA分子上各有一^Loxp位點(diǎn)，可能出現(xiàn)Loxp前后基因片段交叉換位。移位：在兩個(gè)方向相同的Loxp位點(diǎn)之間的基因片段可能會(huì)移動(dòng)到另一個(gè)位置的單獨(dú)Loxp位點(diǎn)上。顛倒：同一條DNA分子上有兩個(gè)Loxp位點(diǎn)，如果順序相反，則可能出現(xiàn)Loxp位點(diǎn)間基因方向顛倒。剔除：同一條DNA分子上有兩個(gè)Loxp位點(diǎn)，如果順序相同，則可能出現(xiàn)Loxp位點(diǎn)間基因剔除，僅留下一^Loxp位點(diǎn)。廠①時(shí)間、空間特異性如果將:re結(jié)構(gòu)基因置于某一特定的啟動(dòng)子Cre 或其他調(diào)節(jié)基因控制之下，便會(huì)實(shí)現(xiàn)酶蛋白在特定組織和特定時(shí)/ 間的可控型表達(dá)，繼而限定了重組發(fā)生的時(shí)空性。Loxp丿 ②高效性重組不受切除片段長短及位置影響，可以在活體動(dòng)物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)，可隨細(xì)胞分裂和動(dòng)物傳代穩(wěn)定遺傳。位 ③準(zhǔn)確性在動(dòng)物模型中至今未發(fā)現(xiàn)xp位點(diǎn)之外的非特異性重點(diǎn)組。重 ④快速性動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)在受精卵分裂之前的短短時(shí)間內(nèi)，Jcre介導(dǎo)的特異性重組便會(huì)完成。Cre/Loxp系統(tǒng)可以使某一基因只在特定的組織、細(xì)胞及細(xì)胞分化、成熟過程中的某一時(shí)段被剔除，這樣減少了對系統(tǒng)發(fā)育的副作用。要實(shí)現(xiàn)時(shí)空特異性基因打靶(spatiotemporalgenetargeting,STGT)需經(jīng)以下三步：其結(jié)果是，子代動(dòng)物在個(gè)體發(fā)育過程中在其時(shí)空特異性地表達(dá)Cre其結(jié)果是，子代動(dòng)物在個(gè)體發(fā)育過程中在其時(shí)空特異性地表達(dá)Cre的組織細(xì)胞的基因組中兩IoxP轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的構(gòu)建建立誘導(dǎo)型GR基因缺陷小鼠模型。其步驟大致是：利用同源重組原理在小鼠ES細(xì)胞中將Cre重組酶的識(shí)別序列(即loxP位點(diǎn))插入GR基因第2外顯子的兩側(cè)，經(jīng)囊胚注射獲得種系嵌合體，然后與表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，由于Cre重組酶的表達(dá)受可被誘導(dǎo)性的啟動(dòng)子調(diào)控，其表達(dá)后loxP位點(diǎn)即發(fā)生重組，剔除2個(gè)loxP位點(diǎn)之間的序列，從而避免了因該胚胎發(fā)育相關(guān)基因的剔除導(dǎo)致小鼠死于肺發(fā)育不良引發(fā)呼吸衰竭而無法獲得成體動(dòng)物的缺點(diǎn)。neo _o工O単打靶載體neci出細(xì)胞5ijutheriL分析擴(kuò)犬培養(yǎng)O胚泡顯徴建射正常小鼠假孕鼠正常小鼠純合型轉(zhuǎn)基因鼠ES細(xì)胞單克隆電轉(zhuǎn)化neo _o工O単打靶載體neci出細(xì)胞5ijutheriL分析擴(kuò)犬培養(yǎng)O胚泡顯徴建射正常小鼠假孕鼠正常小鼠純合型轉(zhuǎn)基因鼠ES細(xì)胞單克隆電轉(zhuǎn)化G&田篩選俄合型小鼠X正當(dāng)小鼠雜合型小規(guī)圖2基因刪除