農(nóng)桿菌介導(dǎo)甘蔗生長點遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)規(guī)程

2農(nóng)桿菌介導(dǎo)甘蔗生長點遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)規(guī)程本文件確立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)甘蔗生長點遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的程序，規(guī)定了外植體來源、試劑與溶液、儀器、設(shè)備和用具、培養(yǎng)基準(zhǔn)備、無菌苗培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌液準(zhǔn)備、遺傳轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)基因苗移栽階段的要求。本文件適用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)甘蔗生長點遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的操作。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術(shù)語和定義本文件沒有規(guī)定的術(shù)語和定義。4外植體來源采集外植體的甘蔗應(yīng)健康無病蟲害，且是省級以上良種審（認）定的甘蔗品種。5儀器、設(shè)備和用具5.1儀器主要有：——可調(diào)移液器（0.2uL～10uL，10uL～200uL，100uL～1000uL，0.5mL～5mL)；——分析天平（精度0.1mg)；——純水儀；——燒杯；——三角瓶；——培養(yǎng)瓶；——量筒；——離心管；——培養(yǎng)皿。5.2設(shè)備主要有：——超凈工作臺；——生化培養(yǎng)箱；——搖床；——冰箱；——高壓滅菌鍋；——液氮罐；——離心機。35.3用具主要有：——鑷子；——手術(shù)刀；——接種針；——吸頭；——無菌濾紙；——脫脂棉。6試劑與溶液6.1試驗用水應(yīng)符合GB/T6682中一級水的要求。除非另有說明，在分析中僅使用分析純試劑，所有試劑溶液宜大體積配制、小體積分裝后經(jīng)高壓滅菌后使用，不宜高壓滅菌的試劑應(yīng)用0.22um膜過濾除菌。6.2所使用的試劑及濃度、保存溫度、英文名和縮寫分別如下：——MS培養(yǎng)基：MScuLturemedium，常溫保存；——蔗糖：Sucrose,30g/L，常溫保存；——瓊脂：Agar，6g/L，常溫保存；——2,4-二氯苯氧乙酸：2,4-D，1mg/mL，4℃保存；——萘乙酸：NAA，1mg／mL，4℃保存；——6-芐基氨基嘌呤：6-BA，1mg／mL，4℃保存；——利福平：Rif，50mg／mL，-20℃保存3個月；——葡萄糖：GLucose，10mmL/L，常溫保存；——果糖：Fructose，10mmL/L，常溫保存；——乙酰丁香酮：Acetosyringone（AS），100um/L，-20℃保存；——頭孢霉素：Cefradine（Cef），250mg/mL，-20℃保存。7培養(yǎng)基準(zhǔn)備7.1培養(yǎng)基配制7.1.1MS培養(yǎng)基配制用電子天平稱取12.52gMS培養(yǎng)基放入500mL三角瓶中，添加相應(yīng)的激素，加蒸餾水定容至300mL，于高壓滅菌鍋121℃滅菌20min后于超凈臺分裝至培養(yǎng)皿中，每皿倒25mL～30mL左右的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基凝固后待用。需要配制的MS培養(yǎng)基pH為5.8，類型如下：——愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS0：MS+3.0mg/L2,4-D+30g/L蔗糖+6g/LAgar；——愈傷組織繼代培養(yǎng)基MS1：MS+2.0mg/L2,4-D+30g/L蔗糖+6g/LAgar；——愈傷組織分化培養(yǎng)基MS2：MS+2.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/LAgar；——壯苗培養(yǎng)基MS3：MS+1.0mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/LAgar；——生根培養(yǎng)基MS4：MS+4.0mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/LAgar。7.1.2MR培養(yǎng)基配制用電子天平稱取2.09gMS培養(yǎng)基放入500mL三角瓶中，添加4mg/L的NAA，200μmoL/LAS，10mmoL/L果糖，10mmoL/L葡萄糖，加蒸餾水定容至100mL。7.1.3YEP培養(yǎng)基配制用電子天平稱取10g胰蛋白胨，10g酵母提取物，5g氯化鈉，15g瓊脂（液體培養(yǎng)基不加瓊脂）放入1L量杯中，加入蒸餾水定容至1L,PH值7.0，混勻后分裝至150mL的玻璃瓶中，每瓶裝100mL，于高壓滅菌鍋121℃滅菌20min，備用。需要的溶液配制方法如下：4——2,4-D(1mg/mL)：稱取100mg的2,4-D加入少量95％的酒精和1moL/L的NaOH使其溶解，再加滅菌蒸餾水定容至100mL即可用；——NAA（1mg／mL）：稱100mgNAA干粉，用熱的ddH2O定容至100mL，4℃保存?zhèn)溆?；—?-BA（1mg／mL）：稱100mg6-BA，先用少量的濃度為1M的NAOH預(yù)溶，隨后用ddH2O定容至100mL，裝在棕色瓶子中，4℃保存?zhèn)溆?；——Rif（50mg／mL）：稱取0.5gRif干粉，加入10mL二甲基亞砜，分裝到無菌離心管中，用錫紙包住避光貶存于-20℃;——葡萄糖（10mmL/L）：取0.18g葡萄糖粉末，少量水溶解后定容至100mL；——果糖（10mmL/L）：取0.18g葡萄糖粉末，少量水溶解后定容至100mL；——乙酰丁香酮（AS，100um/L）：稱取1.96g干粉，適量二甲基亞砜進行溶解后，加ddH2O定容至10ML，在超凈臺中用0.22um的濾膜過濾除菌，分裝到無菌離必管中，-20℃保存；——頭孢霉素（Cef，250mg/mL稱25g頭孢霉素干粉溶解于100mL水中，在超凈工作臺中0.22um的濾膜過濾除菌，分裝到1.5mL的離心管中，存于-20℃。7.2培養(yǎng)基消毒培養(yǎng)基消毒步驟如下：a)將配好的培養(yǎng)基放入高壓滅菌鍋內(nèi)消毒；b)121℃滅菌20min；c)待消毒室內(nèi)的氣壓降至大氣壓時取出培養(yǎng)基，關(guān)閉電源開光；d)MS培養(yǎng)基應(yīng)置于無風(fēng)和干凈的環(huán)境中冷卻至40℃左右，后于超凈臺分裝至培養(yǎng)皿中，每皿倒25mL～30mL左右的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基凝固后待用；e)MR、YEP留存?zhèn)溆谩?.3培養(yǎng)基儲存培養(yǎng)基應(yīng)盡量現(xiàn)配現(xiàn)用，也可在干凈通風(fēng)的環(huán)境中儲存，但儲存時間不宜超過1個月。8無菌苗培養(yǎng)8.1外植體采集、消毒與接種8.1.1采集田間采取無病蟲害的健康甘蔗蔗稍，做好標(biāo)記，剪掉葉片，留取30cm～40cm長的蔗稍帶回實驗室。8.1.2消毒在實驗室材料處理間用75％乙醇消毒蔗稍表面，后帶入無菌操作室。用75％乙醇消毒雙手，取事先準(zhǔn)備好的無菌紙放在超凈臺里備用。用75％乙醇泡過的脫脂棉擦拭蔗稍，每擦一次剝掉一層葉鞘，待剝掉4～5層葉鞘后放入超凈臺內(nèi)的無菌濾紙上。用電熱消毒器將醫(yī)用剪刀、醫(yī)用鑷子、醫(yī)用手術(shù)刀等接種工具消毒，消毒后應(yīng)適當(dāng)冷卻，避免燙傷培養(yǎng)材料。8.1.3接種在超凈臺繼續(xù)剝?nèi)~直到幼嫩的心葉組織。取距離生長點10cm左右的心葉組織在無菌濾紙上用醫(yī)用手術(shù)刀把心葉切成0.2mm的薄片。用醫(yī)用鑷子把薄片插入含愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS0的培養(yǎng)皿中，用封口膜把培養(yǎng)皿封好，防止污染。把培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中，26℃~28℃,24h黑暗培養(yǎng)，15d～20d轉(zhuǎn)接1次，直到獲得胚性愈傷組織。8.2增值培養(yǎng)定期將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接至新鮮的MS1培養(yǎng)基中擴繁。8.3分化培養(yǎng)將生長狀態(tài)良好的胚性愈傷組織在超凈臺上用鑷子分成大小一致的小顆粒，轉(zhuǎn)接至新鮮的MS2培養(yǎng)基中。把培養(yǎng)瓶放在溫度為26℃~28℃的培養(yǎng)室內(nèi)，光照強度宜為1500Lx～3000Lx，光照時間為每天516h左右。待愈傷組織分化出綠色叢芽，叢芽長至2cm～3cm高時分成單株轉(zhuǎn)接至MS3培養(yǎng)基中壯苗培養(yǎng)，待苗長至4cm～5cm高時可以用于轉(zhuǎn)化。9轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌液準(zhǔn)備9.1從-80℃冰箱取出EHA105農(nóng)桿菌菌株，在含相應(yīng)抗生素和利福平的YEP（細菌培養(yǎng)基）板上劃線，28℃培養(yǎng)48h。9.2挑取部分單菌落接種到10mL含相應(yīng)抗生素和利福平的YEP液體培養(yǎng)基中，溫度為28℃,200rpm振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。9.3取1mL菌液放入50mL含相應(yīng)抗生素和利福平的YEP液體培養(yǎng)基中，溫度為28℃,200rpm振蕩培養(yǎng)至OD值為0.5～0.6，備用。9.4將菌液轉(zhuǎn)到離心管中，溫度為4℃,5000rpm離心5min～8min，棄上清，收集菌體。200rpm培養(yǎng)2h。10遺傳轉(zhuǎn)化10.1選取在壯苗培養(yǎng)基MS3上生長旺盛的甘蔗幼苗作為轉(zhuǎn)化材料。10.2在超凈工作臺上用鑷子分成單株,并用醫(yī)用剪刀從距離根部1cm剪斷，去掉上面帶葉子的部分，留取含生長點在內(nèi)的幼莖，幼莖為1cm的小莖段。10.3把小莖段轉(zhuǎn)至培養(yǎng)瓶中，加入用200μmoL/LAS活化2h的農(nóng)桿菌液，浸染約5min～10min，期間輕微振蕩。10.45min～10min后用鑷子取出，用無菌濾紙將菌液吸干后轉(zhuǎn)入無菌水中清洗2～3次，后再用無菌紙吸干，轉(zhuǎn)接到無抗生素的壯苗培養(yǎng)基MS3上，共