神奇的微生態(tài)制劑飼料添加劑-丁酸梭菌規(guī)模化發(fā)酵生產(chǎn)工藝的優(yōu)化

摘要/Abstract[目的]研究丁酸梭菌的營養(yǎng)條件并優(yōu)化發(fā)酵工藝，為與丁酸梭菌培養(yǎng)發(fā)酵相關(guān)的實驗室研究及規(guī)模化生產(chǎn)工藝優(yōu)化提供依據(jù)。[方法]通過單因素試驗，比較8種常見廉價碳氮源對丁酸梭菌增菌的影響，對高密度發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。[結(jié)果]丁酸梭菌MY-Z發(fā)酵最佳營養(yǎng)組分為：葡萄糖30.0g/L、酵母粉5.0g/L、魚粉30.0g/L或肽粉30.0g/L、K2HPO4

1.05g/L、MgSO4·7H2O1.21g/L、NaCl0.3g/L、CaCO3

1.5g/L、MnSO4·H2O0.012g/L、促生長因子0.2g/L；最佳發(fā)酵工藝為：37℃恒溫培養(yǎng)30～36h，發(fā)酵過程中恒定pH為6.5，并在發(fā)酵10h左右進行總量為5%的連續(xù)變量補料。丁酸梭菌MY-Z在此發(fā)酵工藝下，發(fā)酵32h左右，芽孢數(shù)可達2.28×109

CFU/mL。[結(jié)論]通過優(yōu)化發(fā)酵工藝可有效提高發(fā)酵液菌數(shù)，從而降低生產(chǎn)成本，對丁酸梭菌的產(chǎn)業(yè)化推廣與應(yīng)用具有重要意義。研究背景丁酸梭狀芽孢桿菌（Clostridiumbutyricum），又名丁酸菌、宮入菌、酪酸菌，在自然界中多分布在腸道、酒窖、奶酪中。1933年，由日本千葉醫(yī)科大學(xué)宮入近治博士首次發(fā)現(xiàn)。丁酸梭菌屬于嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陽性內(nèi)生芽孢桿菌，細胞直徑（0.6～1.2）μm×（3.0～7.0）μm；在梭菌增菌培養(yǎng)基（RCM）平板上和高層瓊脂柱內(nèi)菌落呈奶白色，邊緣不整齊；顯微視野中菌體呈桿狀或梭狀，多數(shù)單個，少數(shù)呈短鏈，部分菌株在對數(shù)生長初期菌體會呈現(xiàn)長絲狀。近幾年來，丁酸梭菌作為微生態(tài)制劑被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料與養(yǎng)殖等領(lǐng)域。2009年7月，原農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)了丁酸梭菌為新飼料添加劑。丁酸梭菌作為微生態(tài)制劑飼料添加劑，具有較強的抗生素耐受性，對氨芐西林、強力霉素、甲硝唑等抗生素均不敏感，相對于乳酸菌、枯草芽孢桿菌等常規(guī)菌劑，與抗生素聯(lián)用時受限度較小。因丁酸梭菌是腸道原生有益菌，作為口服的丁酸梭菌制劑較其他益生菌類更能適應(yīng)腸道生存環(huán)境，增強本菌株在腸道中的菌群優(yōu)勢；同時，其與雙歧桿菌、乳酸菌、糞腸球菌等有益菌不僅共生還可促進增殖，維護腸道良性微生態(tài)平衡；其產(chǎn)生的以丁酸、乙酸為主的短鏈脂肪酸可抑制有害菌，大量動物試驗和人體臨床試驗表明，丁酸不僅可以修復(fù)腸道黏膜，還是腸道上皮細胞生長的直接能量來源，促進腸道絨毛發(fā)育，增強腸道對有害物質(zhì)的屏障能力，常用于治療腸道疾病，在抑制動物腹瀉、提高動物免疫力等方面具有積極的效果。丁酸梭菌產(chǎn)生的胞外活性酶如淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等，可幫助機體分解多糖、纖維素、脂肪、蛋白質(zhì)等，利于機體消化吸收。雖然丁酸梭菌是嚴(yán)格厭氧菌，因其是產(chǎn)芽孢桿菌，芽孢不僅具有耐熱、耐胃酸、膽酸還耐氧，使其具有一定的抗逆性，便于工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)、運輸、保存和在常規(guī)環(huán)境下使用。自丁酸梭菌被發(fā)現(xiàn)以來，國內(nèi)外很多生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域的學(xué)者對丁酸梭菌進行了深入的研究，重點在菌株分離鑒定及其應(yīng)用機理，而在丁酸梭菌規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)工藝及菌數(shù)檢測等方面的基礎(chǔ)研究還不夠深入，生產(chǎn)發(fā)酵水平偏低。目前在國內(nèi)，1t以上的發(fā)酵罐產(chǎn)出的發(fā)酵液芽孢數(shù)普遍只在2×108～2×109

CFU/mL。少數(shù)企業(yè)在后處理時經(jīng)離心濃縮、噴霧干燥后有效活菌數(shù)才能達到1×1010

CFU/g，市場上現(xiàn)有的丁酸梭菌相關(guān)產(chǎn)品普遍存在有效活菌數(shù)低、貨架期短、價格偏貴等問題。隨著相關(guān)專業(yè)人員和普通大眾“減抗、禁抗”意識的增強及對益生菌劑認(rèn)知的提高，現(xiàn)有的生產(chǎn)發(fā)酵水平已難以滿足食品、醫(yī)藥、養(yǎng)殖及飼料加工等行業(yè)對丁酸梭菌需求量大、有效活菌數(shù)高、貨架期長且價格低廉等要求，嚴(yán)重制約了丁酸梭菌的推廣和應(yīng)用，各生產(chǎn)和使用廠家急切需要解決發(fā)酵工藝中的限制問題，突破現(xiàn)有發(fā)酵水平，降低發(fā)酵成本。本試驗通過探究丁酸梭菌的營養(yǎng)條件及其發(fā)酵工藝優(yōu)化，以期能在實際生產(chǎn)及應(yīng)用等方面提供解決思路和策略，實現(xiàn)丁酸梭菌的高密度發(fā)酵，從而大幅度提高有效活菌數(shù)和芽孢轉(zhuǎn)化率及降低規(guī)?；a(chǎn)成本。材料與方法1.

菌種來源丁酸梭狀芽孢桿菌（C.butyricum

MY-Z），由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室提供。2.

試驗儀器DL-CJ-2ND1潔凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；顯微鏡GC-8860氣相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；GI54DWS型高壓滅菌鍋；AOEINSTRUMENTSUV-1500分光光度計；P70D20TLD4格蘭仕微波爐；UPR-II-5/10T超純水儀；C22-IH960D蘇泊爾電磁爐。3.

培養(yǎng)基梭菌增殖培養(yǎng)基（RCM培養(yǎng)基）：酵母粉3g，牛肉浸膏10g，胰蛋白胨10g，葡萄糖5g，可溶性淀粉1g，氯化鈉5g，三水合乙酸鈉3g，半胱氨酸鹽酸鹽0.5g，0.5%美藍0.2mL，蒸餾水1000mL，調(diào)節(jié)pH至7.0±0.2。發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖10.0g、蛋白胨10.0g、酵母粉5.0g、牛肉粉10.0g、可溶性淀粉2.0g、K2HPO4

1.05g、MgSO4·7H2O1.21g、NaCl0.3g、CaCO3

1.5g、MnSO4·H2O0.012g、促生長因子0.2g、蒸餾水1000mL，調(diào)節(jié)pH至7.0±0.2。計數(shù)培養(yǎng)基：梭菌增殖培養(yǎng)基（RCM培養(yǎng)基）加0.4%～0.8%的瓊脂，分裝試管，上封液體石蠟，制成高層半固體培養(yǎng)基。計數(shù)稀釋液：0.85%的生理鹽水加0.03%的吐溫80。上述培養(yǎng)基均115℃滅菌30min。4.

培養(yǎng)方法1）種子活化及培養(yǎng)方法：取超低溫保存的甘油管菌種100μL，接種到含有15mL的已除氧溶化冷卻至40℃的RCM半固體培養(yǎng)基的試管中，培養(yǎng)基表面覆蓋高2～3cm液體石蠟以隔絕空氣，37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)12～18h。再取此菌液100μL接種到已除氧RCM培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)至對數(shù)期作為種子液備用。2）丁酸梭菌發(fā)酵培養(yǎng)：采用液體深層靜止培養(yǎng)，250mL試劑瓶，裝液量150mL，表面覆蓋高2～3cm液體石蠟以隔絕氧氣，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)24h后計數(shù)。5.

檢測方法1）丁酸梭菌芽孢計數(shù)方法（試管高層半固體瓊脂法）。取菌液于80℃水浴加熱10min，取經(jīng)處理后的待測菌液10mL加到90mL去氧液封稀釋液內(nèi)，并用移液管攪打均勻，不形成氣泡，制成1∶10的均勻稀釋液，取此菌懸液1mL注入到9mL去氧液封稀釋液內(nèi)，同上，制成1∶100均勻稀釋液，按上述操作依次進行10倍遞增稀釋，選擇1～3個合適的稀釋度，取1mL注入到10～15mL已除氧高層半固體培養(yǎng)基內(nèi)，每個梯度做3管平行，置（36±1）℃培養(yǎng)16～24h，計數(shù)。2）還原糖的檢測方法。采用3，5二硝基水楊酸法（DNS法）。3）氣相色譜測定丁酸產(chǎn)量。取發(fā)酵液10mL，用50%硫酸和乙醚提取丁酸，以丁酸標(biāo)準(zhǔn)品為內(nèi)標(biāo)進行氣相色譜儀測定。色譜條件：柱流量為1mL/min，F(xiàn)ID檢測器，檢測器溫度為250℃，進樣量為1μL；升溫程序如下：60℃保持4min，以6℃/min的速度升溫至180℃，再以20℃/min的速度升溫至200℃，保持5min。6.

單因素試驗1）最佳接種量及初始pH的確定。分別以1%、2%、3%、4%、5%、10%的接種量接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，另將基礎(chǔ)培養(yǎng)基初始pH分別用0.5mol/L的鹽酸溶液和飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)制成pH5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，其他培養(yǎng)條件不變，以確定最佳接種量及初始pH。2）碳源的篩選。分別以1.0%的量添加紅糖、糖蜜、甘油、麩皮、玉米粉、可溶性淀粉、乙酸鈉等原料替換初始培養(yǎng)基中的碳源，其他營養(yǎng)組分不變，以初始培養(yǎng)基為對照，探究不同碳源對丁酸梭菌增菌的影響。3%的接種量，37℃培養(yǎng)24h后，取樣測定菌落數(shù)。3）優(yōu)勢碳源添加量的確定。篩選出優(yōu)勢碳源后，再分別以2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、5.0%的量替代初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源，以確定最佳添加量。4）氮源的篩選。分別以2.0%的肽、玉米漿、魚粉、花生粕、酵母粉、豆粕、酶解羽毛粉、硫酸銨等量替代初始發(fā)酵培養(yǎng)基中胰蛋白胨和蛋白胨2種主要的氮源，考察不同的氮源對丁酸梭菌增菌的影響。5）最佳氮源添加量的篩選。本試驗采用增菌明顯的酵母粉、肽粉和魚粉分別以2.5%、3.0%、4.0%、5.0%的量替代初始培養(yǎng)基中的胰蛋白胨和蛋白胨，以確定最佳添加量。7.

發(fā)酵工藝的研究以下試驗培養(yǎng)基均以2.5%的葡萄糖、3.5%魚粉和0.5%的酵母粉，其他營養(yǎng)成分與比例同初始培養(yǎng)基。1）發(fā)酵過程中間歇調(diào)控pH對增菌的影響。在單因素試驗基礎(chǔ)上，三角瓶發(fā)酵靜置培養(yǎng)至10h，10、15h時分別用20%NaOH溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至6.0，并檢測葡萄糖。2）在發(fā)酵過程中補料對增菌的影響。培養(yǎng)至10、15h時分別按1.0%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、5.0%的量向發(fā)酵液中補充初始培養(yǎng)基營養(yǎng)液。3）發(fā)酵過程中在線控制pH并補料對增菌的影響。50L自控發(fā)酵罐，配制優(yōu)化后的培養(yǎng)基，裝液系數(shù)60%，上覆2～3cm厚的液體石蠟或連續(xù)通入氮氣以保證相對厭氧環(huán)境，低速攪拌，接種量3%，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)至10h開始變量流加補充培養(yǎng)基營養(yǎng)液，總流加量為5%，同時用中和劑維持培養(yǎng)液pH在6.0。發(fā)酵過程中分時段取樣檢測葡萄糖、丁酸及芽孢數(shù)。研究結(jié)果1.

不同的接種量和初始pH值對菌數(shù)的影響從圖1可以看出，接種量為3%的發(fā)酵液生物量最高，隨著接種量的增加，生物量略有下降。分析原因：由于接種量大，生長速率快，營養(yǎng)消耗快，且接種量過大，種液中的代謝物特別是酸性物質(zhì)降低了培養(yǎng)基的初始pH值，縮短了菌體的生長對數(shù)期。由此可見，在實際應(yīng)用中并不是接種量越大越好，應(yīng)根據(jù)實際的試驗和生產(chǎn)情況確定相應(yīng)的接種量。另外，在本試驗中發(fā)現(xiàn)接種量越小，相對啟動耗時越長，接種量越大，發(fā)酵啟動越快，接種量為10%的發(fā)酵液啟動時間比1%組提前了約1.5h，接種量過低啟動時間過長，增加了動力消耗和發(fā)酵液污染的風(fēng)險。本研究后面試驗均采用3%的接種量。圖1不同的接種量對菌落數(shù)的影響由圖2可知，初始pH為5.5時，丁酸梭菌的啟動很慢，生長很弱，隨著pH值的升高菌數(shù)增加，pH值為6.0時菌數(shù)最高，pH6.5時菌數(shù)略低，2組差異不明顯。此后，隨著pH升高，菌數(shù)開始下降，由此表明初始pH在偏酸范圍內(nèi)較好。后面試驗確定初始pH值為6.0。圖2不同的初始pH值對菌落數(shù)的影響2.

不同碳源篩選碳源是微生物培養(yǎng)基的主要營養(yǎng)成分，為微生物的生長繁殖、構(gòu)成菌體細胞和代謝活動提供能源。丁酸梭菌可以利用多種碳源，包括單糖和多糖。本試驗所選的8種碳源中包括單糖、多糖及乙酸鈉。由圖3可知，葡萄糖作為碳源時芽孢數(shù)最高，達到0.98×108

CFU/mL，明顯高于其他碳源組（P>0.05），因此優(yōu)選葡萄糖作為本次后續(xù)試驗碳源。紅糖和糖蜜僅次于葡萄糖，從原料來源和生產(chǎn)成本考慮，建議在工業(yè)化生產(chǎn)中選這2種作為主要碳源。圖3不同碳源對丁酸梭菌菌落數(shù)的影響3.

最佳碳源添加量的確定微生物在生長過程中對營養(yǎng)物質(zhì)的需求有一定的限量范圍，營養(yǎng)物質(zhì)過低或過高都會對菌體的生長造成很大的影響，因此確定適當(dāng)?shù)牧?，對微生物生長尤為重要。本試驗在確定最佳碳源的基礎(chǔ)上，優(yōu)化其最佳添加量，結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，葡萄糖添加量為3.0%的發(fā)酵液菌數(shù)最高，達到2.33×108

CFU/mL，明顯高于1.0%組，與2.5%組差異不顯著，與4.0%、5.0%組差異顯著。由表1可知，發(fā)酵結(jié)束后1.0%、2.0%組的培養(yǎng)液所含還原糖分別為0.18%和0.23%，表明糖幾乎消耗殆盡，2.5%添加量的培養(yǎng)液內(nèi)還原糖為0.48%，3.0%及以上各組培養(yǎng)液里還原糖均高于2.5%組，5.0%組還原糖值最高，達到了2.21%。隨著糖量的增加，培養(yǎng)液還原糖值越高，培養(yǎng)基內(nèi)的殘?zhí)窃蕉?，并且從發(fā)酵液的pH值可以看出，所添加的糖并沒有被利用轉(zhuǎn)化，由此確定葡萄糖的最適添加量為2.5%。圖4優(yōu)勢碳源不同添加量對丁酸梭菌菌落數(shù)的影響表1各組發(fā)酵液中還原糖及pH的檢測結(jié)果4.

優(yōu)勢氮源添加量的確定氮是構(gòu)成生命重要物質(zhì)蛋白質(zhì)和核酸等的主要元素，與碳源相同，氮源也是微生物的主要營養(yǎng)物質(zhì)，通常分為有機氮源和無機氮源。本試驗以市場上常見的包含有機氮和無機氮的8種氮源，以部分替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中原有氮源的方式，考查不同氮源對丁酸梭菌生長的影響，結(jié)果見圖5。其中，肽粉、魚粉和酵母粉3組間菌數(shù)差異不顯著，但優(yōu)于對照組，且顯著高于其他氮源。圖5不同氮源對丁酸梭菌菌落數(shù)的影響本試驗選擇菌落數(shù)相對較高的酵母粉、魚粉和肽粉作為優(yōu)勢氮源，在一定范圍內(nèi)以確定最佳添加量，結(jié)果見圖6，酵母粉在2.5%時菌數(shù)為3.12×108

CFU/mL。肽粉和魚粉分別在3%菌數(shù)最高，分別達到2.95×108、3.05×108

CFU/mL。各組添加比例間菌落數(shù)沒有隨著添加量的增加而顯著提升，且各組最高菌數(shù)間差異不顯著。3種優(yōu)勢氮源中，酵母粉不僅是微生物生長的優(yōu)質(zhì)氮源，還含有多種生長因子，但價格相對來說要高出很多。在發(fā)酵生產(chǎn)中，為保證營養(yǎng)互補多采用復(fù)合氮源的方式。因此，本試驗確定酵母粉為0.5%與3.0%的肽粉或3.0%的魚粉組合成復(fù)合氮源。圖63種優(yōu)勢氮源不同的添加量對丁酸梭菌菌落數(shù)的影響5.

發(fā)酵過程中間歇調(diào)控pH對增菌的影響試驗結(jié)果顯示，初始pH在5.5時菌體生長緩慢，表明過低的pH值對丁酸梭菌生長會形成抑制。由試驗結(jié)果可知，發(fā)酵結(jié)束時培養(yǎng)液的pH值顯示為4.7左右，且除1.0%組外，其他各組培養(yǎng)液內(nèi)均有不等量的殘留葡萄糖，表明菌體可能是由于受到酸性代謝物的抑制，糖沒有被完全利用。為了解除酸抑制，本試驗在培養(yǎng)至10h和培養(yǎng)至10、15h分別調(diào)節(jié)pH至6.0，培養(yǎng)結(jié)果見圖7。由圖7可知，在培養(yǎng)過程中調(diào)節(jié)pH可以明顯提高丁酸梭菌的生物量，在10h和10、15h分別調(diào)節(jié)pH至6.0的試驗組菌落數(shù)比對照組分別提高了21.02%和39.66%。檢測培養(yǎng)液內(nèi)剩余葡萄糖，由表2可知，1次補堿組剩余葡萄糖為0.31%、2次補堿組剩余葡萄糖為0.06%。經(jīng)2次補堿后，葡萄糖基本被利用完全。表明解除酸抑制，不僅延長了菌體的生長對數(shù)期，還可提高糖的利用率，同時也大幅度提高了生物量。圖7不同補堿次數(shù)對丁酸梭菌菌落數(shù)的影響表2間歇控酸發(fā)酵液殘?zhí)橇繖z測結(jié)果6.

發(fā)酵過程中補料對增菌的影響從試驗可知解除酸抑制后，培養(yǎng)液里的糖基本利用完全，培養(yǎng)基內(nèi)的碳量偏低，表明對數(shù)期菌體生長快，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)消耗也快，可能會造成后期發(fā)酵動力不足。本試驗通過培養(yǎng)至10、15h在2次補堿的同時分別按總量為1%、2%、3%、5%補充初始培養(yǎng)基營養(yǎng)液，結(jié)果見圖8。2%的補料量菌數(shù)最高，但與1%組差異不顯著。3%、5%補料組的菌落