DB37-T 3531-2019 羊奶中羊、大豆源性成分的定性檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法

67.100.01X

16

DB37

37/T

3531—2019羊奶中羊、大豆源性成分的定性檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光

PCR

法

of

，

and

derived

in

goat

fluorescent

PCR

發(fā)布

實(shí)施山東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局 發(fā)

布DB37/T

3531—2019 前言

................................................................................

II1

范圍

...............................................................................

12

規(guī)范性引用文件

.....................................................................

13

術(shù)語和定義

.........................................................................

14

原理

...............................................................................

15

試劑和材料

.........................................................................

15.1

試劑

...........................................................................

25.2

材料

...........................................................................

26

儀器設(shè)備

...........................................................................

27

檢測(cè)用引物和探針

...................................................................

38

試驗(yàn)步驟

...........................................................................

38.1

取樣

...........................................................................

38.2

提取........................................................................

38.3

實(shí)時(shí)熒光

反應(yīng)

...............................................................

39

試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

.......................................................................

49.1

有效性判定..................................................................

49.2

檢測(cè)結(jié)果分析和表述

.............................................................

410

檢測(cè)過程中防止交叉污染的措施

......................................................

4附

錄 A

（規(guī)范性附錄）

實(shí)時(shí)熒光定性

引物/探針序列、反應(yīng)體系和結(jié)果判定

...........

5附

錄 B

（資料性附錄）

目的基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列

....................................

7DB37/T

3531—2019 本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T

給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧獸醫(yī)局提出并監(jiān)督實(shí)施。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心。步迅。IIDB37/T

3531—2019

1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了羊奶產(chǎn)品中羊、大豆源性成分的實(shí)時(shí)熒光定性檢測(cè)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于生鮮羊奶、滅菌液態(tài)羊奶、羊奶粉等羊奶制品中羊、大豆源性成分的定性檢測(cè)。本方法的檢出限為

%。2 規(guī)范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T

6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T

27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1羊源性本標(biāo)準(zhǔn)提及的羊源性成分為山羊和綿羊。3.2實(shí)時(shí)熒光 real-time

fluorescence

在PCR定量分析。3.3Ct值 cycle

threshold每個(gè)實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。4原理以山羊和綿羊線粒體LectinTaqMan實(shí)時(shí)熒光PCRPCR擴(kuò)增反應(yīng)的熒光信號(hào)及循環(huán)閾值，判定羊和大豆的源性成分。5 試劑和材料DB37/T

3531—2019除非另有說明，在分析中僅使用確認(rèn)為分析純的試劑和符合GB/T

6682規(guī)定的一級(jí)水。5.1 試劑5.1.1

氯化鈉（NaCl）。5.1.2

濃鹽酸（）。5.1.3

三羥甲基氨基甲烷（Tris

base）。5.1.4

二水乙二胺四乙酸二鈉（2EDTA·2H2O）。5.1.5

十二烷基硫酸鈉（）。5.1.6

磷酸鹽緩沖液（PBS）。5.1.7

異硫氰酸胍（GuSCN）。5.1.8

硅珠（silica）。5.1.9

蛋白酶凍干品。5.1.10

聚乙二醇辛基苯基醚（

X-100）。5.1.11

無水乙醇。5.1.12

Chelex-100

樹脂。5.2 材料5.2.1 生理鹽水：稱取

0.85

g

氯化鈉加

20

mL

水溶解，轉(zhuǎn)移至

容量瓶中，加水定容至刻度，103.4

KPa

蒸汽壓（121

℃）滅菌

，降至室溫，4

℃保存?zhèn)溆谩?.2.2 20

mg/mL

蛋白酶

K

溶液：稱取

g

蛋白酶凍干品，轉(zhuǎn)移至

mL

容量瓶中，加水定容至刻度，分裝后于

℃保存。5.2.3 5

%的

Chelex-100：稱取

5

g

Chelex-100

樹脂，轉(zhuǎn)移至

容量瓶中，加水定容至刻度。5.2.4 1

mol/L

Tris-HCl（pH

）溶液：稱取

12.1

g

三羥甲基氨基甲烷置于

100

mL

燒杯中，加入80

mL

pH

至

6.4，轉(zhuǎn)移至

100

mL

103.4

KPa

蒸汽壓（121

℃）滅菌

，室溫保存待用。5.2.5 0.5

mol/L

EDTA（pH

8.0）溶液：稱取

18.61

g

二水乙二胺四乙酸二鈉置于

100

燒杯中，加入

mL

水，用

%的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)

pH

至

8.0，轉(zhuǎn)移至

100

mL

容量瓶中，加水定容至刻度，103.4

KPa

蒸汽壓（121

℃）滅菌

，室溫保存待用。5.2.6 10

%

10

g

十二烷基硫酸鈉溶解于

mL

無菌水中，轉(zhuǎn)移至

容量瓶中，加水定容至刻度，儲(chǔ)存于滅菌過的容器中待用。5.2.7 DNA

結(jié)合液：稱取

60

g

異硫氰酸胍，加入

5

mL

1mol/L

（pH

6.4）溶液，再加入

8

0.5

mol/L

乙二胺四乙酸二鈉（pH

8.0）溶液，再加入

4

mL

聚乙二醇辛基苯基醚原液（溫度

60

℃），轉(zhuǎn)移至

100

mL

容量瓶中，加水定容至刻度。5.2.8 TE

緩沖液：將

的

mmol/L

(pH

8.0)、

的

0.5

mol/L

乙二胺四乙酸二鈉

8.0)

加入到

50

mL

的容量瓶中，調(diào)節(jié)

pH

至

8.0，轉(zhuǎn)移至

50

容量瓶中，加水定容至刻度，103.4

KPa

蒸汽壓（121

℃）滅菌

，降至室溫，4

℃保存?zhèn)溆谩? 儀器設(shè)備6.1

實(shí)時(shí)熒光定量

儀：4

通道以上。6.2

電子分析天平：感量

0.1

mg。6.3

離心機(jī)：最大離心力不小于

13

000

g。6.4

振蕩型恒溫金屬浴：0

℃～100

℃。DB37/T

3531—20196.5

高壓滅菌鍋。6.6

低溫冰箱：-20

℃～4

℃

。6.7

超凈工作臺(tái)。6.8

微量移液器：

μL～1

μL，

μL～

μL，2

μL～20

μL，

μL～

μL。6.9

容量瓶：10

mL，50

mL，

mL。7 檢測(cè)用引物和探針內(nèi)標(biāo)引物探針序列及羊和大豆的引物和特異性探針序列見附錄A中表A.1參見附錄B。8 試驗(yàn)步驟8.1 取樣首先收集白細(xì)胞：取液態(tài)羊奶2

mL，或者奶粉20

溶于2

ml無菌水中，每個(gè)樣品設(shè)立2個(gè)平行樣，將樣品于4

℃、2

g離心30

；棄去離心管的上層乳脂和中間層乳液，保留其底部沉淀，向底部加l

mL

pH

滅菌的緩沖液，將底部沉淀吹打懸浮并轉(zhuǎn)移至1.5

mL的離心管中，離心力3

g，常溫離心10

min，棄去上層液體，保留底部沉淀。8.2 DNA

提取8.2.1 向收集的白細(xì)胞中加入

μL

5

%的

Chelex-100

和

μL

20

mg/ml

蛋白酶

K，

℃保溫

min以上；高速震蕩

5

s～10

s，100

℃煮沸

8

5

s～10

s，13

g

離心

3

min，轉(zhuǎn)移上清液至離心柱中，13

000

g

離心

1

8.2.2 向收集液體中加入

μL

硅珠懸浮液和

μL

結(jié)合液，充分混勻，65

℃水浴

min，中間反轉(zhuǎn)

3～5

次；室溫放置

5

，中間反轉(zhuǎn)

3～5

次；4

000

g

離心

1

min，棄上清，留管底沉淀。8.2.3加入

μL

70

%

乙醇，于

8

g

離心

1

min，重復(fù)此步驟

2

次；加入

μL

無水乙醇；吹打懸浮，8

g

離心

1

min，棄上清。8.2.4 于

8

g

離心

30

s，吸走殘余液體，室溫干燥

min，使殘余乙醇揮發(fā)干。8.2.5 加

100

μL

TE

緩沖液溶解

，加入

1

μL

RNA

酶溶液，55

℃水浴

5

，8

g，離心

1

min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，

℃保存?zhèn)溆谩?.2.6 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取的

DNA

濃度與純度，測(cè)定

260

和

280

nm

處吸光值

A260280，比值在1.7～

之間，DNA

濃度約為

μL～

μL。8.3 實(shí)時(shí)熒光

反應(yīng)8.3.1 試樣實(shí)時(shí)熒光

檢測(cè)多重實(shí)時(shí)熒光，反應(yīng)體系中包含羊和大豆2個(gè)物種源性的特異探針，并加入內(nèi)標(biāo)質(zhì)控體系。反應(yīng)體系見附錄A中表A.2。8.3.2 對(duì)照實(shí)時(shí)熒光

反應(yīng)體系每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3次平行。在試樣反應(yīng)的同時(shí)，設(shè)置空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照：a)

空白對(duì)照：以水作為空白對(duì)照；b)

陰性對(duì)照：以

2

個(gè)動(dòng)物之外的其他基因組

DNA

為陰性對(duì)照；DB37/T

3531—2019c)

陽性對(duì)照：將羊和大豆

2

種動(dòng)物和植物基因組

DNA

等量混勻作為陽性對(duì)照。8.3.3 實(shí)時(shí)熒光

反應(yīng)體系配制按照附錄A中表PCRPCR，3

000

g離心1

，取出管，放入熒光定量PCR儀中。8.3.4 實(shí)時(shí)熒光

反應(yīng)程序95

℃預(yù)變性3

；95

℃

變性

s，62

℃退火延伸35

s，40個(gè)循環(huán)。9 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理9.1PCR

有效性判定空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照全部滿足下述條件，表明PCR體系有效：a)

和

ROX

Ct

值＞40.0，有

CY5

Ct

值≤35.0；b)

FAM

和

熒光的

S

值＞40.0

質(zhì)控探針的熒光信號(hào)，且

Ct

值≤35.0；c)

陽性對(duì)照：有

、ROX

和

CY5

熒光信號(hào)的

S

型擴(kuò)增曲線，且

Ct

值≤35.0。否則判定為PCR無效。9.2 檢測(cè)結(jié)果分析和表述9.2.1 在

PCR

FAM、、

值≤35.0定樣品中檢出相應(yīng)的羊或大豆源性成分；若無

S

型擴(kuò)增曲線，則判定樣品中未檢出相應(yīng)的源性成分。在

PCR

、、CY5

35.0＜Ct

值＜40.0需要加大模板量進(jìn)行

PCR

反應(yīng)。若再次擴(kuò)增后的

Ct

值＜，則判定樣品中檢出相應(yīng)的源性成分；若再次擴(kuò)增后無

S

型擴(kuò)增曲線，則判定樣品中未檢出相應(yīng)的源性成分。9.2.2 對(duì)樣品檢測(cè)結(jié)果的判定，見附錄

A

中表

。10 檢測(cè)過程中防止交叉污染的措施防治污染的措施按GB/T

規(guī)定執(zhí)行。5'-3'bpLectin-FCTCTACTCCACCCCCATCCACAT128Lectin-RAGAAAGAAGGCAAGCCCATCTGUNFAAGACGAGAAGACCGTATGGAG228UNRGATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTAIMFACCGTTACCGAGTCCAGGTG134IMRTTCGGACTCGATCAGAGCACGly-P5’FAM-CGCCGCTTCCTTCAACTTCACGCGGCG-3’DabcylY-P5’ROX-CCACCAAGGGATAACAACACTCTGGTGG-3’DabcylIACP5’CY5-CGACGGTCCTTTCTAATGTTGCGTCG-3’Dabcyl加量（μL）2×TaqManMaster

2×TaqManMaster

101×10×

Primer

UNF/

0.50

μmol/LLectinF/R0.50

μmol/LIMF/IMR0.25

μmol/L10×

Y-P(ROX)0.05

μmol/LGly-P(FAM)0.10

IMP(CY5)0.05

-310

～50

ddH2

20DB37/T

3531—2019AA附

錄A（規(guī)范性附錄）實(shí)時(shí)熒光定性

引物/探針序列、反應(yīng)體系和結(jié)果判定A.1 實(shí)時(shí)熒光定性引物和探針序列實(shí)時(shí)熒光定性引物和探針序列見表A.1。表A.1 實(shí)時(shí)熒光定性

表A.1 實(shí)時(shí)熒光定性

引物和探針序列實(shí)時(shí)熒光定性引物和探針序列見表A.2。表A.2多重實(shí)時(shí)熒光表A.2多重實(shí)時(shí)熒光

反應(yīng)體系對(duì)各種樣品檢測(cè)結(jié)果的判定見表A.3。

CtCt

源性

性成

檢出大豆和羊源性成和羊

如果同時(shí)進(jìn)行的陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果正常，檢測(cè)實(shí)際

Ct35

①如果同時(shí)進(jìn)行的陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果正常，則可能

DNA

②如果同時(shí)進(jìn)行的陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果不正常，則可DB37/T

3531—2019表A.3表A.3實(shí)時(shí)熒光

定性檢測(cè)方法各種實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定DB37/T

3531—2019BB附

錄 B（資料性附錄）目的基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列B.1 大豆（Glycine

max）PCR產(chǎn)物序列（GenBank:NM_001354824.1）大豆（Glycine

max）PCR產(chǎn)物序列（GenBank:NM_001354824.1）CTCTACTCCACCCCCATCCACATTTGGGACAAAGAAACCGGTAGCGTTGCCAGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCACCTTCTATGCCCCTGACACAAAAAGGCTTGCAGATGGGCTTGCCTTCTTTCTB.2 山羊（Capra

hircus）產(chǎn)物序列（GenBank:KY523511.1）山羊（Capra

hircus）產(chǎn)物序列（GenBank:KY523511.1