基因的分離與鑒定課件

基因的分離與鑒定基因的克隆包含著待研究的目的基因的分離和鑒定兩個(gè)主要內(nèi)容在真核生物中,單個(gè)基因僅占整個(gè)基因組的極其微小的比例。必須經(jīng)過擴(kuò)增(amplification)才有可能分離到含有目的基因的DNA片段。因此需要先構(gòu)建基因文庫(genelibrary)或叫DNA文庫(DNAlibrary)。

DNA文庫:來源于染色體DNA基因組,是來自單個(gè)基因組的DNA克隆片段匯總,包含基因組中所有DNA序列。cDNA文庫:來源于基因組DNA的轉(zhuǎn)錄本(mRNA)再反轉(zhuǎn)錄成的cDNA拷貝,是單個(gè)基因組編碼序列的cDNA克隆片段匯總,包含基因組中所有編碼序列。

應(yīng)用大腸桿菌作寄主進(jìn)行外源DNA片段克隆的綜合實(shí)驗(yàn)方案真核基因克隆的基本步驟5.1DNA克隆片段的產(chǎn)生與分離5.1.1基因組DNA的片段化(1)利用限制酶片段化基因組DNA的一般問題

獲得外源DNA片段最簡單的方法是鳥槍法(shotgunapproach):利用限制酶消化給體基因組DNA,不經(jīng)過凝膠電泳分布分離,就直接用來同載體分子作連接反應(yīng)的克隆方法。此種方法的缺點(diǎn)是:載體上插入的外源片段大小不同,克隆群體龐大,不利于選擇帶有目的基因的克隆;當(dāng)目的基因的核苷酸序列中有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)時(shí),需要好幾個(gè)克隆才有可能獲得目的基因的全序列。目的基因核苷酸序列越長,需要的克隆就越多;限制片段太大或太小都不利于正常基因文庫的構(gòu)建。

解決這些問題的方法有:限制酶局部消化;機(jī)械切割法等限制酶酶切片段的隨機(jī)程度和大小與其識(shí)別序列長短有關(guān):4bp:44=256bp;6bp:46=4096bp;8bp:48=65536隨機(jī)程度高隨機(jī)程度低(2)基因組DNA的雙酶消化策略

1978年,有學(xué)者提出了利用兩種限制酶混合消化基因組DNA的實(shí)驗(yàn)策略。應(yīng)用這種方法可以獲得適于克隆的隨機(jī)片段化的DNA群體。

在進(jìn)行局部的雙酶消化后,可產(chǎn)生大部分為10~30kb范圍的隨機(jī)片段,它們之間存在著有效的隨機(jī)的序列重疊現(xiàn)象。然后通過蔗糖密度梯度離心等方法得到20kb左右的隨機(jī)的DNA片段群體,適于λ噬菌體載體的克隆能力。這樣,經(jīng)體外重組、包裝和轉(zhuǎn)化后,有把握獲得足夠多的重組體轉(zhuǎn)化子克隆,構(gòu)建成幾乎完美、代表性的基因文庫。在雙酶消化策略中,可根據(jù)情況選擇限制酶組合或具有同尾酶特點(diǎn)的單酶切──在克隆組合。5.1.2DNA片段的大小分布

構(gòu)建完整的基因文庫(DNA文庫)時(shí),并不需要對某種基因或DNA片段作特別的富集處理。但如果要克隆特定大小的含有目的基因的DNA片段時(shí),可在克隆之前先對片段化的給體DNA群體進(jìn)行按大小的分步分離,則可以顯著提高克隆基因的分離頻率。5.1.3編碼目的基因的克隆片段的富集

如果克隆的目的是分離特定的基因,在對該基因的信息有所了解的情況下,可以通過凝膠電泳或蔗糖梯度離心等方法進(jìn)行富集。但是,被克隆的目的基因的全序列應(yīng)該在一條DNA片段上,所以,隨機(jī)片段化的DNA不適于用此方法。舉例:Qβ蛋白質(zhì)(光合作用相關(guān)蛋白質(zhì))的psbA基因的克隆

將純化的水稻葉綠體DNA(ctDNA)分別用BamHI、EcoRI及HindIII等限制酶局部消化,然后用含有溴化乙錠的1﹪瓊脂糖凝膠電泳作分步分離;進(jìn)行Southern印記轉(zhuǎn)移,同32P放射性標(biāo)記的目的基因探針進(jìn)行雜交,結(jié)果表明,2.2kb的EcoRI片段、3.8kb的BamHI片段等含有psbA基因的編碼序列;

根據(jù)這些結(jié)果,將對葉綠體DNA進(jìn)行再一次的電泳分步分離,把2.2～2.5kb范圍的EcoRI片段(含有psbA基因的編碼序列)從低熔點(diǎn)膠中分離出來;在體外與pBR322質(zhì)粒載體連接重組,轉(zhuǎn)化大腸桿菌寄主細(xì)胞,構(gòu)成水稻葉綠體基因組DNA的EcoRI文庫;

從近200個(gè)轉(zhuǎn)化子菌落中得到8個(gè)陽性克隆,其中有6個(gè)克隆帶有2.2kb的插入片段,進(jìn)一步分析后發(fā)現(xiàn)這些插入片段都含有psbA基因的編碼序列。5.2重組體DNA分子的構(gòu)建及導(dǎo)入受體細(xì)胞5.2.1外源DNA片段同載體分子的重組外源DNA片段同載體分子的連接需要限制酶與連接酶的作用。進(jìn)行連接反應(yīng)時(shí),需要注意以下3點(diǎn):

①實(shí)驗(yàn)步驟要盡可能簡單易行;②連接形成的“接點(diǎn)”序列,應(yīng)能被限制酶重新切割,以便回收插入的外源DNA片段;③有些情況下,對轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯過程中的密碼結(jié)構(gòu)的閱讀不不發(fā)生干擾。(1)外源DNA片段的定向插入(2)非互補(bǔ)粘性末端DNA分子間連接①應(yīng)用化學(xué)合成的銜接物構(gòu)建粘性末端進(jìn)行基因克隆的程序待克隆的DNA片段PstI銜接物T4多核苷酸激酶載體分子T4DNA連接酶轉(zhuǎn)化與擴(kuò)增克隆的DNA片段②應(yīng)用BamHI接頭構(gòu)建重組體分子的基本程序BamHI接頭分子外源DNA片段重組體質(zhì)粒(3)最佳連接反應(yīng)①防止線性載體DNA分子的自我環(huán)化,通用的3種方法:

A.用堿性磷酸酶除去線性載體DNA的5′-P,留下5′-OH;B.使用同聚物加尾技術(shù);C.應(yīng)用柯斯質(zhì)粒進(jìn)行克隆。②正確調(diào)整載體DNA和外源DNA之間的比例;③在體外連接反應(yīng)中的DNA總濃度要高,低于20μgDNA/ml時(shí),DNA分子間的相互作用機(jī)會(huì)少,不利于連接反應(yīng);而高濃度的DNA(300~400μgDNA/ml),則有利于連接反應(yīng);④連接反應(yīng)的溫度:26℃保溫4小時(shí)所得到的轉(zhuǎn)化子數(shù)大約是4℃保溫23小時(shí)的90﹪,而且?guī)缀跏?℃保溫4小時(shí)的25倍以上。DNA片段體外連接反應(yīng)的保溫時(shí)間及其溫度對重組體轉(zhuǎn)化效率的影響5.2.2重組體分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的途徑(1)重組體DNA的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)化(transformation):感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞捕獲和表達(dá)外源DNA片段或質(zhì)粒載體DNA分子的生命過程。

轉(zhuǎn)染(transfection):感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞捕獲和表達(dá)噬菌體DNA分子的生命過程。①轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的基本過程:

將外源DNA分子或與載體重組的重組體DNA分子同經(jīng)過氯化鈣處理的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞混合,置冰浴中培養(yǎng)一段時(shí)間后,轉(zhuǎn)入42℃水浴中作短暫的熱刺激(熱休克,一般90sec)。如果是轉(zhuǎn)染,將這樣處理的細(xì)菌直接涂布在瓊脂平板上,使其形成噬菌斑;如果是轉(zhuǎn)化,將這樣處理的細(xì)菌放置在肉湯培養(yǎng)基中保溫一段時(shí)間(復(fù)蘇培養(yǎng),約為1h),以便新表型得到表達(dá),然后涂布在選擇性培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)。②轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染效率問題一般情況下,每微克pBR322質(zhì)粒DNA可獲得106左右的轉(zhuǎn)化子菌落;每微克λ噬菌體DNA可獲得104~106噬菌斑。轉(zhuǎn)化(或轉(zhuǎn)染)效率也同選用的大腸桿菌受體的菌株有關(guān)。當(dāng)使用重組體DNA分子進(jìn)行轉(zhuǎn)化(或轉(zhuǎn)染)時(shí),頻率要下降102~104,這是由于,一方面載體分子同DNA插入片段之間的連接效率低造成的,另一方面含有DNA插入片段的載體分子比較大,這本身會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率下降。我們可以用堿性磷酸酶處理法或環(huán)絲氨酸富集法等方法提高轉(zhuǎn)化效率。(2)體外包裝的λ噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)5.3基因克隆的實(shí)驗(yàn)方案

從生物有機(jī)體中克隆某一特定DNA片段(或基因)的實(shí)驗(yàn)程序總稱為基因克隆的實(shí)驗(yàn)方案或策略。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮突蚩寺「鞣N要素的特點(diǎn),選擇正確的克隆方案是非常重要的.

例如,人的-

珠蛋白基因約為1.5kb,而人的單倍體基因組的總長度達(dá)3×106kb左右。那么究竟需要多少個(gè)長度為1.5kb的不同限制片段,才能夠確保(即達(dá)到99﹪的必然性)在重組DNA轉(zhuǎn)化子克隆群體中,至少含有一個(gè)是獲得了這個(gè)基因的分子呢?也就是說一個(gè)完全的人類基因組DNA基因文庫,究竟應(yīng)包括多少個(gè)獨(dú)立的克隆?這取決于基因組的大小和克隆的DNA片段平均大小兩個(gè)參數(shù)。Clarke─Carbon公式給出的一個(gè)完全基因文庫所需要的實(shí)際克隆數(shù)(1975年):

其中:N為一個(gè)完整基因文庫所應(yīng)包含的轉(zhuǎn)化子克隆數(shù);P為重組體群體中出現(xiàn)目的基因序列的幾率(一般設(shè)定為99﹪);f為限制片段平均大小與基因組DNA總量之比。Clarke─Carbon公式可以被簡化為:其中:G為基因組的大小;

f為插入片段平均大小對于上述提到的人的-

珠蛋白基因的例子,N的數(shù)值為:這說明,我們需要從9百萬個(gè)獨(dú)立的菌落或克隆中分離和鑒定人的-

珠蛋白基因,也就是說,我們必須有大量的重組體DNA群體,才有可能匯集整個(gè)人基因組的全部DNA序列。習(xí)慣上,將這種匯集著基因組所有DNA序列的重組體DNA群體稱為基因文庫(genelibrary)或基因庫(genebank),更確切地說,應(yīng)該叫DNA文庫(DNAlibrary)。

如果改用λ噬菌體載體,比如克隆的插入片段平均長度為15kb,那么,一個(gè)完全的人基因文庫所需要的重組體數(shù)量可減少到9×105;若用柯斯克隆,在克隆片段平均長度為40kb時(shí),所需要的重組體數(shù)目又可減少到3.5×105。所以,我們一般選用噬菌體和柯斯質(zhì)粒作載體,克隆大片段DNA并構(gòu)建基因文庫;用質(zhì)粒載體克隆較小片段的DNA(＜15kb),它往往可以提供方便的檢測手段。在決定選擇何種克隆方案時(shí),另一個(gè)值得考慮的重要因素是待克隆DNA分子的性質(zhì)。如果是真核生物的基因全序列克隆,就應(yīng)該使用基因組DNA材料;如果只是克隆編碼氨基酸的表達(dá)序列,則可使用cDNA材料。

在pBR322質(zhì)粒上克隆-珠蛋白的cDNA

加上了HindIII接頭的β-珠蛋白cDNA重組到pBR322載體上以后,轉(zhuǎn)化給大腸桿菌寄主細(xì)胞。將生長在Amp平板上的轉(zhuǎn)化子菌落原位影印培養(yǎng)在Tet平板上,從中可篩選出AmprTets的菌落,此即含有β-珠蛋白cDNA插入的陽性克隆。5.3.1互補(bǔ)作用基因克隆用克隆片段與缺陷型受體細(xì)菌間的功能互補(bǔ)來克隆功能基因的常規(guī)方法。當(dāng)缺陷型大腸桿菌菌株難以被轉(zhuǎn)化時(shí),可先轉(zhuǎn)化含有F質(zhì)粒的大腸桿菌菌株,然后通過F質(zhì)粒為媒介,將重組體質(zhì)粒導(dǎo)入眾多的F－營養(yǎng)缺陷型菌株細(xì)胞。只適于克隆細(xì)菌基因和少數(shù)低等真核生物的相關(guān)功能基因。5.3.2cDNA基因克隆

真核生物基因組DNA十分龐大,其復(fù)雜度是蛋白質(zhì)和mRNA的100倍左右,而且含有大量的重復(fù)序列,所以,不論采取什么方法,都難以直接分離到目的基因片段。

部分生物的基因組DNA大小Human3.0x109Mouse3.0x109Drosophila1.1x108Yeast1.2x107Bacteria1.0-5.0x106

盡管高等生物一般具有幾萬個(gè)不同的基因,但在一定時(shí)間階段的單個(gè)細(xì)胞或個(gè)體都僅有15﹪左右的基因得以表達(dá),產(chǎn)生出幾千個(gè)不同的mRNA分子?？梢?由mRNA出發(fā)的cDNA克隆,其復(fù)雜度要比直接從基因組克隆簡單得多。

以質(zhì)粒為載體構(gòu)建cDNA文庫:雙鏈質(zhì)粒DNA限制酶末端轉(zhuǎn)移酶,dGTPmRNA把oligo(dT)引物加到poly(A)尾巴反轉(zhuǎn)錄酶用NaOH降解mRNA鏈,DNA聚合酶I以發(fā)卡環(huán)作引物合成互補(bǔ)DNA鏈SI核酸酶SI核酸酶降解發(fā)卡結(jié)構(gòu)末端轉(zhuǎn)移酶,dGTP插入質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化給大腸桿菌,擴(kuò)增pBR322(1)cDNA文庫的構(gòu)建①分離總RNA,從中純化出主要含mRNA的分部;②合成cDNA第一鏈(oligo(dT)引導(dǎo)的cDNA合成法、隨機(jī)引物引導(dǎo)的cDNA合成法);③將mRNA-DNA雜交分子轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈cDNA分子(自我引導(dǎo)合成法、RNaseH酶降解取代法);④將合成的雙鏈cDNA分子重組到質(zhì)?；蚴删w載體上,并導(dǎo)入大腸桿菌寄主細(xì)胞增殖。poly(A)mRNA與oligo(dT)雜交而被吸附,其它的tRNArRNA仍處于游離狀態(tài)加入總RNA

oligo(dT)纖維素100mMNaCL洗脫下來的tRNA和rRNA10mMTris1mMEDTA收集洗脫下來的poly(A)mRNA用纖維素柱純化poly(A)的流程示意圖合成雙鏈cDNA的RNaseH酶降解取代法以λ噬菌體作載體構(gòu)建cDNA文庫的流程圖(2)不同豐度mRNA的cDNA克隆不同目的基因的mRNA在特定的生物體組織中的含量有很大的差別,相應(yīng)的cDNA克隆策略也不同。①高豐度mRNA的cDNA克隆相對于低豐度mRNA的cDNA克隆,高豐度mRNA的cDNA克隆并不存在什么實(shí)際的問題。按常規(guī)方法進(jìn)行cDNA克隆后,用菌落雜交技術(shù),從轉(zhuǎn)化的細(xì)菌群體中篩選出目的基因序列的重組體克隆即可。②低豐度mRNA的cDNA克隆通常是構(gòu)建成cDNA基因文庫。組成一個(gè)合理的完全的cDNA文庫所必須的重組體克隆的數(shù)目,可根據(jù)Clarke─Carbon公式算出:

其中:p是得到完整cDNA文庫的概率(通常設(shè)定為99﹪);是某一低豐度mRNA在mRNA群體中出現(xiàn)的概率;N是所需的克隆數(shù)。③稀少mRNA的cDNA克隆此種mRNA的克隆難度極大,主要采取一些特殊的技術(shù)才有可能取得成功。A.應(yīng)用按分子量大小分部分離的技術(shù)富集克隆的mRNA;B.使用化學(xué)合成的寡聚脫氧核苷酸純化特定的mRNA,也可采用根據(jù)氨基酸序列制備的混合探針來篩選cDNA文庫的方法;C.用差別雜交法篩選特異mRNA的cDNA克隆(3)全長cDNA的合成用全長雙鏈cDNA構(gòu)建cDNA文庫,分離目的基因,特稱為全長cDNA克隆(full-lengthcDNAclone)。①oligo(dG)引導(dǎo)合成法A.第一鏈cDNA尚未與mRNA模板分離之前,先在其3′-末端加上一段oligo(dC)序列;B.然后通過堿性蔗糖梯度離心處理,使mRNA模板分子發(fā)生水解作用,回收全長cDNA;C.最后以互補(bǔ)的oligo(dG)序列作引物引導(dǎo)第二鏈cDNA的合成,這樣就不會(huì)形成發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu),也就沒必要使用SI核酸酶進(jìn)行切割處理。寡聚脫氧胸苷酸[oligo(dG)引導(dǎo)法合成全長雙鏈cDNA②載體引導(dǎo)合成法第一連由參入到載體分子上的oligo(dT)序列引導(dǎo)合成;第二鏈也是由參入到載體分子上的oligo(dT)序列引導(dǎo)合成;產(chǎn)生出雙鏈的重組體質(zhì)粒分子以后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌寄主細(xì)胞,通過擴(kuò)增可獲得具有不同插入取向的cDNA克隆。超量變性的載體分子5′

③置換法合成全長cDNA制備帶有一段oligo(dT)尾巴的質(zhì)粒引物和具有oligo(dG)尾巴的接頭DNA;前者引導(dǎo)合成第一鏈cDNA。構(gòu)建質(zhì)粒-cDNA重組體分子,然后用RNaseH酶解取代法合成第二鏈cDNA。轉(zhuǎn)化大腸桿菌寄主細(xì)胞。(4)cDNA克隆的優(yōu)點(diǎn)和用途①優(yōu)點(diǎn):A.對于研究增殖過程并不經(jīng)過DNA中間體的有些RNA病毒,cDNA克隆是唯一可行的方法;B.cDNA文庫的篩選比較簡單易行;C.由于每一個(gè)cDNA克隆都代表一種mRNA序列,在選擇中出現(xiàn)假陽性的幾率比較低cDNA②用途:A.克隆在細(xì)菌中表達(dá)的基因;B.用作基因序列結(jié)構(gòu)的測定;C.有關(guān)在發(fā)育過程中時(shí)間調(diào)節(jié)基因的表達(dá)特征的分析。5.3.4基因組DNA克隆cDNA克隆的局限性

(1)cDNA只反映mRNA的分子結(jié)構(gòu),而并不包括基因組DNA的間隔序列;(2)cDNA基因文庫中,不同克隆的分布狀態(tài)總是反映著mRNA的分布狀態(tài),而mRNA的分布與其豐度相關(guān)的。(3)cDNA克隆不能夠克隆到基因組DNA中的非轉(zhuǎn)錄區(qū)段的序列,因而無法滿足對基因編碼區(qū)外側(cè)調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能的研究?；蚪MDNA克隆的優(yōu)越性(1)能有效地滿足外源真核基因在真核細(xì)胞中的表達(dá);(2)具有所有基因的序列拷貝;(3)能夠滿足對基因非編碼區(qū)結(jié)構(gòu)與功能的研究。(1)應(yīng)用λ噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫①通過銜接物連接法在λ噬菌體載體上構(gòu)建基因組文庫

a.加入HaeIII-AluI對真核基因組DNA作局部雙酶切,分部分離20kb左右的片段;b.EcoRI甲基化酶處理,再連EcoRI銜接物;

c、d.用EcoRI消化目的DNA和載體;e.按大小分部,除去載體中間區(qū)段;

f.插入片段與載體分子退火連接(連接酶);g.體外包裝;

h.感染大腸桿菌細(xì)胞寄主細(xì)胞,構(gòu)成基因組文庫。高分子量真核基因組DNA取代性λ噬菌體載體Charon4A②用Sau3A消化真核基因組DNA在λ噬菌體載體上構(gòu)建基因組文庫a.載體DNA片段的制備;b.真核基因組DNA的制備;c.體外重組構(gòu)建多連體分子;d.體外包裝;e.感染大腸桿菌寄主細(xì)胞。B=BamHI末端S=Sau3A末端(2)應(yīng)用柯斯質(zhì)粒載體構(gòu)建基因組文庫

應(yīng)用λ噬菌體載體克隆外源DNA的真正有效范圍僅有15kb左右,而許多真核基因的長度比這大的多,有的長達(dá)1000kb。由于柯斯質(zhì)粒可攜帶的外源DNA比λ噬菌體載體克隆能力的3倍,所以,柯斯質(zhì)粒載體更適合于克隆真核基因。柯斯克隆一般程序:①用限制酶Sau3A局部消化基因組DNA,然后分離收集長度為35～45kb的片段群體;②同Sau3A的同尾酶,例如用BglII消化為線性化的柯斯質(zhì)粒載體DNA連接重組;③經(jīng)體外包裝之后,感染大腸桿菌寄主細(xì)胞;④在大腸桿菌細(xì)胞中柯斯質(zhì)粒載體按質(zhì)粒的特性進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增,形成基因組文庫?？滤箍寺〉娜秉c(diǎn):①用噬菌斑雜交法篩選λ噬菌體重組體的基因文庫,比用菌落雜交法結(jié)果更加清晰噬菌斑雜交出來的本底,一般總要比菌落雜交產(chǎn)生的本底低得多;②用λ噬菌體載體構(gòu)建的基因文庫,經(jīng)擴(kuò)增后幾乎可以無限期地保存,而含有重組體柯斯質(zhì)粒的細(xì)菌,經(jīng)過貯藏之后,其成活率會(huì)劇烈地下降。

任何一種方法擴(kuò)增的基因文庫中,并不是所有的成員都是等速增殖的。因?yàn)椴迦氲耐庠碊NA片段的大小及序列上的差異,將影響到重組的噬菌體、質(zhì)?；蚩滤官|(zhì)粒的復(fù)制速率,這樣,當(dāng)一個(gè)基因文庫經(jīng)過擴(kuò)增之后,某些特定的重組體的比例可能增加,而有些重組體的比例則可能下降。5.3.4基因定位克隆基因定位克隆是用于分離其編碼產(chǎn)物尚不知道的目的基因的一種有效的方法?；静襟E:①將目的基因(目的基因的突變)定位到染色體上,并在目的基因兩側(cè)確定一對緊密連鎖的RFLP或RAPD分子標(biāo)記;②利用最緊密連鎖的一對分子標(biāo)記作探針,通過染色體步移技術(shù)將位于這兩個(gè)分子標(biāo)記之間的含目的基因的特定的基因組片段克隆并分離出來;③根據(jù)其同突變體發(fā)生遺傳互補(bǔ)的能力從此克隆中鑒定出目的基因。(1)擬南芥菜簡介在植物分子生物學(xué)研究中,一種小型有花植物──擬南芥菜是具有其他植物所不具備的許多優(yōu)點(diǎn):①植物個(gè)體小:一間不大的實(shí)驗(yàn)室里可種植上萬株的實(shí)驗(yàn)材料;②時(shí)代時(shí)間短;約為5周,一年內(nèi)可收集到8～9個(gè)世代的遺傳數(shù)據(jù);③種子產(chǎn)率高:每個(gè)植株可產(chǎn)生4×104粒以上的種子;④基因組小、結(jié)構(gòu)簡單:總長度為7×107bp。比大腸桿菌基因組大20倍,卻只要棉花的10﹪、煙草的5﹪、小麥的1﹪,單一序列比例高,是玉米的120倍。適合于用染色體步移技術(shù)克隆目的基因;⑤天然自花受粉,所以新的突變體都是天然的純合子。便于通過人工雜交受粉進(jìn)行基因定位。

所以,擬南芥菜被稱為植物王國中的果蠅(2)RFLP分子標(biāo)記所謂的RFLP是指DNA限制片段多態(tài)性:不同生態(tài)型或地理隔離群的同源DNA分子之間表現(xiàn)出序列趨異性,結(jié)果,可能使限制酶識(shí)別位點(diǎn)的突變而引起限制位點(diǎn)的增加或減少,形成RFLP。(3)RFLP作圖原理與步驟(擬南芥菜)探針A代表基因A;探針B代表基因B。C:Columbia生態(tài)型N:Niederzenz生態(tài)型探針A探針B探針B探針A探針A探針BF1雜合子F2雜代I.A和B不連鎖II.A和B緊密連鎖探針B探針B探針A探針A子代子代×(4)染色體步移技術(shù)RFLP克隆目的基因(a)構(gòu)建起始克隆的限制圖;(b)亞克隆B-H片段;(c)用放射性標(biāo)記的亞克隆B-H片段,從基因組文庫中篩選具重疊序列的新的一步克隆;(d)構(gòu)建一步克隆的限制圖;(e)亞克隆H-E片段;(f)用放射性標(biāo)記的亞克隆H-E片段,從基因組文庫中篩選具重疊序列的新的二步克隆。如此反復(fù)多次重復(fù)步驟(a)～(c),逐步逼近,直至得到目的基因的克隆。圖中的B、E、H:B:BamHIE:EcoRIH:HindIII值得注意的是:①分子探針必須是唯一序列;②插入到克隆載體上引起致死效應(yīng)的序列無法克隆的。(5)大尺度基因組物理圖譜的構(gòu)建

基因組的1cM圖距,在人類基因組中大約相當(dāng)于1000kb的DNA長度,在擬南芥菜、番茄和小麥中分別相當(dāng)于290kb、750kb和3500kb。而且大多數(shù)高等生物中存在大量的散在重復(fù)序列,這使得如果克隆的基因組DNA片段越長,染色體步移時(shí)出現(xiàn)的難度越大;反之,又會(huì)影響探針標(biāo)記的強(qiáng)度,從而降低檢測的靈敏度。

對于農(nóng)作物的RFLP研究中,一般選用400~2000kb長度的DNA片段構(gòu)建隨機(jī)的基因組文庫。顯然,常規(guī)的克隆技術(shù)是無法承受如此大片段的DNA,下面我們就學(xué)習(xí)解決的辦法。①DNA分子大片段切割

對于DNA分子大片段切割,一般采用切割位點(diǎn)稀少的限制性內(nèi)切酶。比如我國科學(xué)家強(qiáng)伯勤院士首先發(fā)現(xiàn)的限制酶SfiI,其識(shí)別序列是5′─GGCCNNNN↓NGGCC─3′。目前商品化供應(yīng)的切割位點(diǎn)稀少的限制酶已有數(shù)十種,常見的有NotI、SfiI和PacI等,已經(jīng)廣泛應(yīng)用與大尺度的基因組物理圖譜的構(gòu)建。

另外,哺乳動(dòng)物的基因組DNA中,除了CpG島外,CG二核苷酸對是十分少見的。因此,一些識(shí)別序列短,卻含有CG二核苷酸對的限制酶,例如,NruI(TCG↓CGA)和BssHII(G↓CGCGC)等,在哺乳動(dòng)物基因組DNA中的識(shí)別位點(diǎn)是稀少的?？捎脕砬懈町a(chǎn)生大分子量的限制片段。

限制酶DpnI可在序列處切割DNA分子,形成平末端片段。當(dāng)修飾甲基化酶M·TaqI對限制酶TaqI的識(shí)別序列TCGA進(jìn)行甲基化,使其變成時(shí),限制酶DpnI只能在8核苷酸序列處發(fā)生切割作用。修飾甲基化酶M·ClaI對限制酶ClaI的識(shí)別序列ATCGAT進(jìn)行甲基化,使其變成時(shí),限制酶DpnI只能在10核苷酸序列處發(fā)生切割作用。這說明,結(jié)合使用一些甲基化酶和限制酶,有可能產(chǎn)生若干具有額外特性的靶子位點(diǎn),可獲得大片段DNA分子。②大片段DNA分子的分離

應(yīng)用常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳難以分離長度超過50kb的DNA片段。而脈沖電場凝膠電泳(PFGE)可以分離長度范圍200~3000kb的大片段DNA分子?；静襟E:

ⅰ.將研究材料的細(xì)胞埋藏在低熔點(diǎn)瓊脂糖中;ⅱ.加入有關(guān)酶及反應(yīng)試劑,從細(xì)胞蛋白質(zhì)和RNA混合物中游離出DNA。因?yàn)樵谀z基質(zhì)中的DNA分子較少發(fā)生斷裂;ⅲ.用適合于產(chǎn)生大片段DNA的限制酶在低熔點(diǎn)瓊脂糖中進(jìn)行消化;ⅳ.被限制酶消化了的DNA的凝膠塊直接埋在凝膠槽中進(jìn)行電泳,低壓脈沖過夜或幾天以后可得到長達(dá)百萬bp的大片段DNA。

目前可以用倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳(FIGE)的方法可以避免PFGE因?yàn)槭褂谜浑妶龆鸬腄NA譜帶扭曲變形的缺點(diǎn)。因?yàn)镕IGE使用的是周期性的180°交變電場,DNA分子是按直線軌跡泳動(dòng)的。③YAC庫的構(gòu)建

酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)作為載體可以克隆數(shù)百kb的大分子量DNA片段。YAC載體的組成包括:ⅰ.來自酵母染色體的著絲粒序列;ⅱ.一段控制酵母DNA復(fù)制的自主復(fù)制序列(ARS);ⅲ.一對酵母的端粒序列,有的來源于四膜蟲染色體;ⅳ.選擇記號;ⅴ.克隆位點(diǎn)。

YAC載體能夠象染色體一樣在酵母細(xì)胞中正常復(fù)制,并可以克隆大到1mb的大片段DNA分子?！稹稹鹪诮?jīng)過一次脈沖電場凝膠電泳,把含有插入片段的YAC載體分離出來轉(zhuǎn)化已去掉細(xì)胞壁的酵母細(xì)胞④大尺度物理圖譜的構(gòu)建

遺傳圖中,基因間或分子標(biāo)記間的遺傳圖距是以重組頻率來測算的,而在物理圖譜中,其分子標(biāo)記間的物理圖距是以核苷酸的數(shù)目來表示的。物理圖譜可以通過PFGE法進(jìn)行構(gòu)建。

擬南芥菜基因組DNA長度為7×104kp,如果每個(gè)基因組克隆長度為40kb,相鄰克隆之間重疊序列長度為5kb,那么要完全覆蓋全部染色體DNA,則至少需要2000個(gè)克隆。所以,構(gòu)建全基因組物理圖譜,雖然從原理上講是十分簡單的,但實(shí)際上是一項(xiàng)非常龐大而可怕的工程。構(gòu)建全基因組物理圖譜及克隆庫的基本程序

以擬南芥菜為例,14個(gè)重疊的基因組克隆可以覆蓋全部染色體DNA的一條小型染色體。圖中豎線表示限制酶的切割位點(diǎn)。該圖中是根據(jù)具有共同的限制位點(diǎn)模型對基因組克隆進(jìn)行排列的。

5.4克隆基因的分離

近年來分離目的基因的技術(shù)取得了長足的發(fā)展,這與如下三個(gè)因素有直接的關(guān)系。第一、人類基因?qū)＠录ぉatson與Healy之爭;第二、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐的壓力;第三、染色體DNA全序列測定工作的局限性。

同時(shí),有些科學(xué)家對基因組全序列測定的必要性提出了疑義:①具有理論研究或生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值的基因僅占基因組全序列的極少部分;②基因組的大部分序列并無重要的生物學(xué)功能;而且一兩個(gè)個(gè)體的基因組全序列并不含有多態(tài)性的基因信息;③基因組全序列測定工作耗資巨大,發(fā)展中國家無法承受;④農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和醫(yī)療臨床實(shí)踐都迫切需要盡快分離出有關(guān)的目的基因。5.4.1應(yīng)用核酸探針分離克隆的目的基因(核酸雜交篩選法)(1)核酸探針的來源①根據(jù)mRNA的豐度,從cDNA文庫入手制備探針;②從進(jìn)化中保守的核苷酸編碼序列入手,制備探針;③從同一蛋白質(zhì)家族中的保守的氨基酸序列入手,逆向推導(dǎo)合成寡核苷酸探針庫;(2)寡核苷酸探針的人工合成在從蛋白質(zhì)氨基酸序列入手合成寡核苷酸探針時(shí),需要克服2個(gè)方面的困難:

①為了保證足夠的特異性,通常使用17～20個(gè)核苷酸長度的探針,也就是說,需要掌握6個(gè)以上連續(xù)排列的氨基酸組成的蛋白質(zhì)序列的數(shù)據(jù);②為了克服遺傳密碼簡并問題,盡可能選擇簡并性最低的一段由6個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)序列,作為合成寡核苷酸探針的依據(jù)。(3)假陽性克隆的克服①猜測體探針:用于分離克隆基因的低簡并性的人工合成寡核苷酸探針。

如果猜測體探針83﹪的核苷酸能夠同目的基因cDNA序列雜交,并有10~12個(gè)連續(xù)、完全配對的區(qū)域,就可以鑒定出含目的基因的cDNA陽性克隆。②PCR猜測體技術(shù)(尿酸氧化酶編碼基因的分離)(a)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同質(zhì)粒載體重組后轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株;(b)應(yīng)用中間部位的猜測體探針作菌落雜交;(c)從陽性克隆中分離重組體質(zhì)粒DNA;(d)從重組體質(zhì)粒DNA中切下插入序列供作雜交探針篩選cDNA文庫;(e)挑取含全長尿酸氧化酶基因cDNA的陽性克隆,供進(jìn)一步研究使用。5.4.2應(yīng)用差別雜交或扣除雜交法分離克隆的目的基因(1)差別雜交

根據(jù)不同細(xì)胞群體mRNA差異,分別用cDNA探針對含有特異基因表達(dá)序列的cDNA文庫進(jìn)行雜交,分離克隆的目的基因。(a)從表達(dá)和不表達(dá)目的基因mRNA的2個(gè)細(xì)胞群體中分別制備總mRNA;(b)以oligo(dT)或短的寡核苷酸隨機(jī)引物,將總mRNA反轉(zhuǎn)錄成放射性標(biāo)記的探針;(c)堿水解法除去RNA鏈;(d)用每種探針分子分別與cDNA文庫雜交,該文庫是由表達(dá)目的基因的細(xì)胞總mRNA構(gòu)建的。(2)扣除雜交

除去非目的基因的cDNA克隆或DNA序列,富集欲分離的目的基因之cDNA克隆或DNA序列的雜交方法。

比如,T細(xì)胞受體基因TCR只能在T細(xì)胞中表達(dá),而不能在B細(xì)胞中表達(dá)。從T細(xì)胞制備來的單鏈cDNA同大大超量的B細(xì)胞的mRNA進(jìn)行雜交,于是所有互補(bǔ)的序列都能形成DNA-RNA雜交分子,而T細(xì)胞特有的cDNA由于B細(xì)胞中沒有相應(yīng)的mRNA而仍然保持單鏈狀態(tài);將此種雜交混合物通過羥基磷灰石柱,使DNA-RNA雜交分子結(jié)合在柱上,回收過柱流出的單鏈cDNA;將其轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈cDNA后,與適當(dāng)?shù)摩耸删w載體重組并轉(zhuǎn)化大腸桿菌寄主細(xì)胞,這樣便得到了T細(xì)胞特異的cDNA高度富集的扣除文庫;制備cDNA探針,篩選文庫,分離T細(xì)胞的TCR基因。

扣除雜交法分離克隆的目的基因(缺失突變基因)(a)野生型及突變型DNA的切割,后者用生物素標(biāo)記成探針;(b)DNA變性并與生物素標(biāo)記探針雜交;(c)過生物素結(jié)合蛋白質(zhì)柱;將過柱流出的DNA收集,多次重復(fù)步驟(b)~(c);(d)PCR擴(kuò)增DNA片段B;(e)連續(xù)轉(zhuǎn)化形成克隆庫。最后用Southern雜交法進(jìn)一步鑒定出不能同突變型DNA雜交的含有突變基因的陽性克隆。5.4.3應(yīng)用mRNA差別顯示技術(shù)分離克隆的目的基因

根據(jù)表達(dá)特性的差異可將高等真核生物的基因分為2大類:

①看家基因(house-keepinggene):以其組成性表達(dá)模式維持細(xì)胞的基本代謝活動(dòng)的基因。②發(fā)育調(diào)控基因(developmentalregulatedgene):以其時(shí)空特異性表達(dá)模式完成個(gè)體的正常的生長、發(fā)育與進(jìn)化的基因?；虻牟顒e表達(dá)(differentialexpression)

在生物個(gè)體發(fā)育的不同階段,或是在不同的組織或細(xì)胞中發(fā)生的不同基因按時(shí)間、空間進(jìn)行有序表達(dá)的方式

1992年,美國學(xué)者P.Lliang和A.D.Pardee根據(jù)基因的差別表達(dá)這一特性,發(fā)明了mRNA差別顯示PCR技術(shù),簡稱DDRT-PCR(differentaldisplayreversetranscriptionPCR)。(1)mRNA差別顯示的原理①3′端錨定引物

幾乎所有的真核基因mRNA分子3′-末端都帶有一段多聚腺苷酸結(jié)構(gòu),即poly(A)尾巴。那么這段poly(A)序列起點(diǎn)之前的(5′上游)的2個(gè)堿基,在不考慮倒二位為A的情況下,只能有以下12種可能的排列組合:

5′-AGAAAAA…AA-3′5′-ATAAAAA…AA-3′5′-CGAAAAA…AA-3′5′-CTAAAAA…AA-3′5′-GGAAAAA…AA-3′5′-GTAAAAA…AA-3′5′-TGAAAAA…AA-3′5′-TTAAAAA…AA-3′5′-ACAAAAA…AA-3′5′-CCAAAAA…AA-3′5′-GCAAAAA…AA-3′5′-TCAAAAA…AA-3′根據(jù)這種序列結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),設(shè)計(jì)合成12種不同的下游引物,稱為3′錨定引物,其結(jié)構(gòu)通式為:

5′-T11MN或5′-T12MN其中,M為除了T以外任何一種核苷酸;N則為任何一種核苷酸。所以,MN有12種不同的排列組合方式。錨定引物用來反轉(zhuǎn)錄mRNA,合成第一鏈cDNA。這樣,每一種錨定引物都將把總mRNA群體的1/12分子反轉(zhuǎn)錄成mRNA-cDNA雜交分子。由此可知,使用一套5′-T11MN或5′-T12MN引物,可以將整個(gè)mRNA群體在cDNA水平上分成具有序列結(jié)構(gòu)差異的12份亞群體。②5′端隨機(jī)引物

為了把不同發(fā)育階段的目的基因分離出來,在PCR擴(kuò)增時(shí),還需要一種10個(gè)核苷酸組成的5′端隨機(jī)引物,這種引物,可以與特定細(xì)胞類型的總mRNA群體的cDNA互補(bǔ)位點(diǎn)發(fā)生雜交作用,而這種互補(bǔ)位點(diǎn)是分布在距每條新合成的cDNA鏈3′-末端的不同位點(diǎn)上的。用3′錨定引物和5′隨機(jī)引物組成的引物對,對總mRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果,可以將在不同發(fā)育階段或不同基因型材料中基因表達(dá)的差別以cDNA標(biāo)簽的形式顯示出來。此時(shí),凝膠上的譜帶顯示了以cDNA為標(biāo)簽的基因表達(dá)情況,如果不同材料之間的譜帶有差異,就說明著不同材料中基因表達(dá)的差異。而每個(gè)條帶都代表著一種特定的mRNA。

(2)DDRT-PCR基本步驟ⅰ.分別從A組和B組提取總mRNA;ⅱ.加入3′錨定引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA;ⅲ.加入一對特定組合的3′錨定引物和5′隨機(jī)引物,以及35S-dNTP進(jìn)行PCR擴(kuò)增;ⅳ.將同位素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物加樣在變性的DNA序列膠中作電泳分離,并進(jìn)行放射自顯影;ⅴ.將有關(guān)差別表達(dá)的DNA條帶從測序膠上切割下來;ⅵ.用相同的引物對進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增,得到一定數(shù)量后,再作重組克隆;ⅶ.將克隆的特定DNA分別同基因組DNA及總mRNA作雜交或測序;鑒定出可能是目的基因的DNA片段;ⅷ.用此目的DNA作探針,從基因組文庫或cDNA文庫中篩選全長克隆;ⅸ.對篩選出的陽性克隆進(jìn)行核苷酸序列結(jié)構(gòu)分析及功能鑒定,獲得差別表達(dá)的目的基因。(3)mRNA差別顯示法的優(yōu)點(diǎn)和不足優(yōu)點(diǎn):

ⅰ.可以同時(shí)比較多個(gè)樣品間基因表達(dá)的差異;ⅱ.可以同時(shí)檢測“上游”和“下游”基因;ⅲ.檢測靈敏度高,所需樣品少;ⅳ.由于用了PCR和序列膠電泳,更加簡單方便。不足:

ⅰ.假陽性比例高,可高達(dá)50~75﹪,一方面,由于泳動(dòng)速率相同,長度一樣的多種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合在一條帶中;另一方面,鄰近條帶間的距離很近,在根據(jù)放射自顯影底片來確定特異條帶位置時(shí)容易出現(xiàn)操作誤差。ⅱ.擴(kuò)增的差別條帶分子長度比較短小,一般只有110~450bp之間。ⅲ.絕大多數(shù)差別顯示的條帶都僅僅含有3′-UTR的一短片段的信息,而這樣的序列與基因的編碼區(qū)來說是比較保守的,根據(jù)這樣的序列制備的探針,在進(jìn)行northern分析時(shí)容易出現(xiàn)假陽性。5.4.4應(yīng)用表達(dá)文庫分離克隆的目的基因

由于眾所周知的原因,真核基因不能在大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的。通常選用表達(dá)載體來解決這一難題。表達(dá)載體中,外源DNA片段插入后在可調(diào)節(jié)的原核啟動(dòng)子之下,能夠在大腸桿菌細(xì)胞中準(zhǔn)確地轉(zhuǎn)錄和表達(dá)出外源蛋質(zhì)。(1)把cDNA克隆到表達(dá)載體上,構(gòu)建cDNA表達(dá)庫,表達(dá)的蛋白質(zhì)是融合蛋白質(zhì),而且不被細(xì)菌細(xì)胞中有關(guān)蛋白酶消化降解。通過對蛋白質(zhì)產(chǎn)物的鑒定,分離克隆的目的基因。把原處平板上的噬菌斑及其產(chǎn)生的融合蛋白質(zhì)影印到硝酸纖維素濾膜上濾膜與第一抗體溶液溫育漂洗濾膜除去未結(jié)合的第一抗體。加入放射性標(biāo)記的第二抗體放射自顯影硝酸纖維素濾膜(2)通過測定蛋白質(zhì)的功能來篩選cDNA表達(dá)文庫

在存在著Ca++離子的情況下鈣調(diào)蛋白(calmodulin)能夠同許多種酶結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物。因此,放射性同位素標(biāo)記的鈣調(diào)蛋白可以用作一種篩選cDNA表達(dá)文庫的分子探針,從中鑒定出能夠表達(dá)可在體外同鈣調(diào)蛋白結(jié)合的目標(biāo)蛋白質(zhì)的陽性克隆。(3)用放射性同位素標(biāo)記的、帶有特定蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的DNA片段作探針篩選cDNA表達(dá)文庫

利用這種方法,從cDNA表達(dá)文庫中鑒定出與它發(fā)生特異性結(jié)合的目標(biāo)蛋白質(zhì)的陽性克隆。這種方法在真核基因表達(dá)調(diào)控的研究中十分有用。尤其是用于分離與啟動(dòng)子元件特異性結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因方面具有良好的效果。5.4.5酵母雙雜交系統(tǒng)(參見《現(xiàn)代遺傳學(xué)》186頁相同內(nèi)容)

許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子都是有結(jié)構(gòu)上可以分開、功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成。

DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(bd)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(ad)目的蛋白基因X與編碼bd的DNA序列人工重組成X-GAL4ad;將另一個(gè)已知的蛋白質(zhì)基因與編碼bd的DNA序列人工重組成X-GAL4bd,克隆以后分別產(chǎn)生雜合蛋白,如果X與Y相互作用,在共同轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞中回產(chǎn)生有功能的轉(zhuǎn)錄激活因子,下游基因便可表達(dá)。5.5重組體分子的選擇與鑒定外源DNA片段與載體分子連接的反應(yīng)體系中,包括了:ⅰ.不帶有外源DNA片段的載體自我環(huán)化片段;ⅱ.載體與不同數(shù)目外源DNA片段連接構(gòu)成的重組體子;ⅲ.不同數(shù)目外源DNA片段彼此連接形成的多聚DNA分子等多種類型的DNA分子。

由這種混合的DNA制劑轉(zhuǎn)化而來的克隆群體中,我們首先需要采用特殊的方法才能篩選出可能含有目的基因片段的重組體克隆;然后還要用某種方法檢測這些篩選的重組體克隆中是否確實(shí)具有一段插入的外源DNA片段;最后必須進(jìn)行認(rèn)真的選擇和鑒定,從這些轉(zhuǎn)化子克隆中分離出真正含有目的基因的重組體克隆。5.5.1遺傳檢測法(1)直接選擇法──根據(jù)載體的表型特征選擇重組體分子

根據(jù)載體分子攜帶的遺傳標(biāo)記或表型特征來選擇的一些方法①抗藥性記號插入失活選擇法(以pBR322為例)②β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法(pUC系列載體)β-半乳糖苷酶乳糖半乳糖葡萄糖β-半乳糖苷酶異構(gòu)乳糖乳糖1、β-半乳糖苷酶對乳糖的消化作用(上圖)2、β-半乳糖苷酶使乳糖成為異構(gòu)乳糖,異構(gòu)乳糖是β-半乳糖苷酶基因表達(dá)的誘導(dǎo)物(下圖)。在基因工程實(shí)驗(yàn)中所使用的誘導(dǎo)物是IPTG,所用的顯色劑是X-gal。pUC18和pUC19質(zhì)粒載體的MCS結(jié)構(gòu)(2)根據(jù)插入序列的表型特征選擇重組體分子的直接選擇法如果插入在載體分子上的外源基因能夠在大腸桿菌寄主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)其功能性的表達(dá),我們就可以根據(jù)其表型特征進(jìn)行直接選擇。

其基本原理是:轉(zhuǎn)化進(jìn)來的外源基因能夠?qū)в腥毕?如營養(yǎng)缺陷型)的大腸桿菌寄主菌株發(fā)生體內(nèi)抑制或互補(bǔ)效應(yīng),從而使被轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞表現(xiàn)出外源基因編碼的表型特征。目前已有相當(dāng)數(shù)量的對其突變作了詳盡研究的大腸桿菌實(shí)用菌株。而且有些類型的突變,只要外源基因產(chǎn)物獲得低水平的表達(dá)便會(huì)抑制或發(fā)生互補(bǔ)作用。5.5.2物理檢測法

在有關(guān)DNA序列結(jié)構(gòu)的研究中,需要將DNA序列中的非基因編碼區(qū)的片段也克隆到質(zhì)粒載體上。根據(jù)重組體載體比野生型載體大這一特點(diǎn),就可以檢測出來。(1)凝膠電泳檢測法

轉(zhuǎn)化工作之后,將含有質(zhì)粒的單菌落的溶菌物,通常一次制備12個(gè)不同單菌落的溶菌樣品,同時(shí)進(jìn)行凝膠電泳分析測定。在細(xì)菌染色體DNA前面會(huì)出現(xiàn)獨(dú)立的質(zhì)粒DNA電泳譜帶。在不同單菌落溶菌樣品的電泳結(jié)果的分析中,就可以根據(jù)野生型質(zhì)粒和重組體質(zhì)粒DNA的遷移率的差異而鑒定出含有重組體質(zhì)粒的陽性克隆。(2)R-環(huán)檢測法

在臨近雙鏈DNA變性溫度下和高濃度(70﹪)甲酰胺溶液中,雙鏈的DNA-RNA分子要比雙鏈的DNA-DNA分子更為穩(wěn)定。因此,將RNA及DNA的混合物置于這種退火條件下,RNA便會(huì)同雙鏈DNA中的互補(bǔ)鏈退火形成穩(wěn)定的DNA-RNA雜交分子,而被取代的另一鏈處于單鏈狀態(tài),這種由單鏈DNA分支與雙鏈DNA-RNA分支形成的“泡狀”體稱為R-環(huán)結(jié)構(gòu)。

在有利于形成R環(huán)的條件下,使待檢測的純化的質(zhì)粒DNA,在含有mRNA分子的緩沖液中局部地變性,如果質(zhì)粒DNA分子上存在著與mRNA探針互補(bǔ)的序列,那么這種mRNA就將取代DNA分子中的相應(yīng)的互補(bǔ)鏈,形成R環(huán)。然后在電子顯微鏡下觀察,便可以檢測出重組體質(zhì)粒的DNA分子。5.5.3菌落或噬菌斑雜交篩選法

應(yīng)用放射性標(biāo)記的特定的DNA或RNA作探針,進(jìn)行DNA/DNA或DNA/RNA雜交檢測法。具體步驟參見第二章相應(yīng)內(nèi)容。5.5.4免疫化學(xué)檢測法

用抗體鑒定那些產(chǎn)生外源DNA編碼的抗原的菌落或噬菌斑的方法。只要克隆的目的基因能夠在大腸桿菌寄主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)表達(dá),合成出外源的蛋白質(zhì),就可以采用免疫化學(xué)法檢測重組體克隆。這種方法突出的優(yōu)點(diǎn)是能夠檢測不為寄主細(xì)胞提供任何選擇特征的克隆基因,但需要使用特異性的抗體。(1)放射性抗體檢測法(2)免疫沉淀檢測法現(xiàn)今醫(yī)學(xué)分為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)、基于“生物-醫(yī)學(xué)模式”近代發(fā)展起來的西醫(yī)，20世紀(jì)西醫(yī)又發(fā)展到“社會(huì)-心理-生物醫(yī)學(xué)”或綜合醫(yī)學(xué)模式，后基因組時(shí)代系統(tǒng)生物學(xué)的興起，形成了系統(tǒng)醫(yī)學(xué)在全球的迅速發(fā)展，成為繼傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)、西醫(yī)學(xué)之后中、西醫(yī)學(xué)匯通的未來醫(yī)學(xué)。當(dāng)代中國醫(yī)學(xué)類專業(yè)比較優(yōu)秀的學(xué)校有北京大學(xué)、華中科技醫(yī)學(xué)化驗(yàn)醫(yī)學(xué)定義（medicine），是處理人健康定義中人的生理處于良好狀態(tài)相關(guān)問題的一種科學(xué)，（高血壓心臟病糖尿病）以治療預(yù)防生理疾病和提高人體生理機(jī)體健康為目的。狹義的醫(yī)學(xué)只是疾病的治療和機(jī)體有效功能的極限恢復(fù)，廣義的醫(yī)學(xué)還包括中國養(yǎng)生學(xué)和由此衍生的西方的營養(yǎng)學(xué)?，F(xiàn)在世界上醫(yī)學(xué)主要有西方微觀西醫(yī)學(xué)和東方宏觀中醫(yī)學(xué)兩大系統(tǒng)體系。醫(yī)學(xué)的科學(xué)性在與應(yīng)用基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的理論不斷完善和實(shí)踐的驗(yàn)證，例如生化、生理、微生物學(xué)、解剖、病理學(xué)、（肺炎青霉素肝炎）藥理學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、流行病學(xué)，中醫(yī)學(xué)及中醫(yī)技能等，來治療疾病與促進(jìn)健康。雖然東西方由于思維方式的不同導(dǎo)致（高血壓心臟病糖尿?。┭芯咳梭w健康與外界聯(lián)系及病理機(jī)制的宏觀微觀順序不同，但在不遠(yuǎn)的將來中西醫(yī)實(shí)踐的豐富經(jīng)驗(yàn)的積累和理論的形成必將誕生新的醫(yī)學(xué)---------人類醫(yī)學(xué)。（腫瘤癌癥胃癌腸癌肺癌）不同于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，不同于傳統(tǒng)中醫(yī)，（傳染病丙肝乙肝甲肝）金水醫(yī)學(xué)誕生了，金水醫(yī)學(xué)是以驅(qū)除病理，恢復(fù)生理為主張的全新醫(yī)學(xué)，走出了人類醫(yī)學(xué)的誤區(qū)，（肺血液血小板紅血球白血球）治療疾病的特色鮮明，不論是任何疾病都能做到從危為安，由重到輕的恢復(fù)辦法。金水醫(yī)學(xué)認(rèn)識(shí)到人體是生命體，生命體有自己的強(qiáng)大的生理自我愈合功能，（高血壓心臟病糖尿?。椭w恢復(fù)自主作用才是治療疾病的根本。針對當(dāng)今現(xiàn)代文明病，現(xiàn)代疑難病，現(xiàn)代慢性病，亞健康，一體多病，取得了巨大的成功，治療法則為“胃腸潔，氣血流，玄府開，營衛(wèi)昌”人生命體運(yùn)動(dòng)符合自然節(jié)律，最終達(dá)到人體生理增強(qiáng)，消滅疾病的目的。（腫瘤癌癥胃癌腸癌肺癌）編輯本段醫(yī)學(xué)的分類醫(yī)學(xué)研究醫(yī)學(xué)可分為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)（即通常說的西醫(yī)學(xué)）和傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)（包括中醫(yī)學(xué)、（高血壓心臟病糖尿?。┎蒯t(yī)學(xué)、蒙醫(yī)學(xué)等）多種醫(yī)學(xué)體系。不同地區(qū)和民族都有相應(yīng)的一些醫(yī)學(xué)體系，宗旨和目的不相同。印度傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)系統(tǒng)也被認(rèn)為很發(fā)達(dá)。（傳染病丙肝乙肝甲肝）研究領(lǐng)域大方向包括基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)、保健醫(yī)學(xué)、康復(fù)醫(yī)學(xué)等。（腫瘤癌癥胃癌腸癌肺癌）基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)包括：醫(yī)學(xué)生物數(shù)學(xué),醫(yī)學(xué)生物化學(xué),醫(yī)學(xué)生物物理學(xué),人體解剖學(xué),醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué),人體生理學(xué),人體組織學(xué),人體胚胎學(xué),醫(yī)學(xué)遺傳學(xué),人體免疫學(xué),（肺血液血小板紅血球白血球）醫(yī)學(xué)寄生蟲學(xué),醫(yī)學(xué)微生物學(xué),醫(yī)學(xué)病毒學(xué),人體病理學(xué),病理生理學(xué),藥理學(xué),醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué),醫(yī)學(xué)心理學(xué),生物醫(yī)學(xué)工程學(xué),醫(yī)學(xué)信息學(xué),急救學(xué),護(hù)病學(xué),新中心法則。（肺炎青霉素肝炎）臨床醫(yī)學(xué)包括：臨床診斷學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué).影像診斷學(xué)+放射診斷學(xué)+超聲診斷學(xué)+核醫(yī)診斷學(xué)*臨床治療學(xué)職能治療學(xué)化學(xué)治療學(xué)生物治療學(xué)血液治療學(xué)組織器官治療學(xué)飲食治療學(xué)（高血壓心臟病糖尿?。┪锢碇委煂W(xué)語言治療學(xué)心理治療學(xué)內(nèi)科學(xué)外科學(xué)泌尿科學(xué)婦產(chǎn)科學(xué)兒科學(xué)老年醫(yī)學(xué)眼科學(xué)耳鼻喉科學(xué)口腔醫(yī)學(xué)傳染病學(xué)皮膚醫(yī)學(xué)神經(jīng)醫(yī)學(xué)精神病學(xué)腫瘤醫(yī)學(xué)急診醫(yī)學(xué)麻醉學(xué)護(hù)理學(xué)家庭醫(yī)學(xué)性醫(yī)學(xué)（傳染病丙肝乙肝甲肝）臨終關(guān)懷學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)保健醫(yī)學(xué)聽力學(xué)。（肺炎青霉素肝炎）編輯本段醫(yī)學(xué)的起源

醫(yī)學(xué)教材東、西方文化歷史背景是中、西醫(yī)學(xué)形成、發(fā)展的土壤。公元2世紀(jì)東、西方的兩位醫(yī)學(xué)巨匠張仲景和蓋倫，傳承了不同的學(xué)術(shù)思想，創(chuàng)建了迥異的醫(yī)學(xué)范式，發(fā)展和完善了不同的理論體系，使中、西醫(yī)學(xué)各自走向了（高血壓心臟病糖尿?。﹥蓷l完全不同的發(fā)展道路。在漢代醫(yī)學(xué)家張仲景所著述的《傷寒雜病論》之前，就有《內(nèi)經(jīng)》、《難經(jīng)》、《本草經(jīng)》等古典醫(yī)藥典籍。張仲景總結(jié)了漢代以前的醫(yī)學(xué)成就，繼承了《內(nèi)經(jīng)》等基本理論和豐富的醫(yī)藥（傳染病丙肝乙肝甲肝）知識(shí)，結(jié)合自己的臨床實(shí)踐，寫成了《傷寒雜病論》。其貢獻(xiàn)在于確立了中醫(yī)學(xué)辨證論治的理論體系，為后世中醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展，奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。（肺炎青霉素肝炎）在西方，蓋倫的一生生活在羅馬帝國時(shí)安東尼父子的執(zhí)政期。彼時(shí)，羅馬帝國的繁榮，為蓋倫的醫(yī)學(xué)成就、以及西方醫(yī)學(xué)的昌盛，提供了可靠的政治、經(jīng)濟(jì)、科技和文化保證。蓋倫繼承希波克拉底的學(xué)術(shù)思想，（肺血液血小板紅血球白血球）著述200余部著作，現(xiàn)存的83部著作中，內(nèi)容涉及解剖、生理、病理、衛(wèi)生、藥物、《希波克拉底文集》研究、哲學(xué)、語言學(xué)、邏輯學(xué)、數(shù)學(xué)、歷史、（傳染病丙肝乙肝甲肝）法律等。倡導(dǎo)實(shí)證醫(yī)學(xué)，他的科學(xué)（高血壓心臟病糖尿?。┓椒ㄕ摼哂兄匾晫?shí)驗(yàn)、疾病局部定位思想、重視形式邏輯、強(qiáng)調(diào)演繹法等特點(diǎn)，對后世西醫(yī)學(xué)的發(fā)展影響深遠(yuǎn)。中、西醫(yī)學(xué)在張仲景和蓋倫完全相悖的醫(yī)學(xué)范式引導(dǎo)下，開始步入了分道揚(yáng)鑣的歷史進(jìn)程。在中華文化強(qiáng)調(diào)“中和”的大背景下，學(xué)術(shù)界便有了“海納百川”的寬松氣氛。出現(xiàn)了學(xué)術(shù)流派精彩分呈，如瘟病的寒溫之爭，經(jīng)方時(shí)方之別等。中醫(yī)學(xué)按張仲景的思維范式，蓬蓬勃勃的發(fā)展起來了。（傳染病丙肝乙肝甲肝）隨著科學(xué)的進(jìn)步和社會(huì)的發(fā)展特別是醫(yī)療實(shí)踐的發(fā)展，最初的中醫(yī)學(xué)理論已無法詮釋新的科學(xué)事實(shí)，因此，醫(yī)學(xué)理論必須不斷創(chuàng)新，（高血壓心臟病糖尿?。┎拍苓m應(yīng)社會(huì)需要，這就促使中醫(yī)學(xué)進(jìn)入漢代以后，呈現(xiàn)出全面發(fā)展的階段，這個(gè)階段共包括四個(gè)時(shí)期：編輯本段魏晉隋唐時(shí)期（腫瘤癌癥胃癌腸癌肺癌）由于重視總結(jié)臨床經(jīng)驗(yàn)，并繼承整理發(fā)揮《黃帝內(nèi)經(jīng)》、《傷寒雜病論》等經(jīng)典醫(yī)著的理論，出現(xiàn)了眾多名醫(yī)名著。如晉代王叔和的《脈經(jīng)》和皇甫謐的《針灸甲乙經(jīng)》、隋代巢元方的《諸病源候論》、唐代孫思邈的《千金要方》和《千金翼方》。（肺炎青霉素肝炎）編輯本段宋金元時(shí)期我國經(jīng)濟(jì)和科學(xué)技術(shù)日益發(fā)展，學(xué)術(shù)文化領(lǐng)域百家爭鳴，特別是思想家的革新精神，為中醫(yī)學(xué)理論的創(chuàng)新和突破性進(jìn)展，提供了有利的文化背景。宋代陳無擇著《三因極一病證方論》一書，提出三因?qū)W說；并產(chǎn)生了最具盛名四大學(xué)派，（肺血液血小板紅血球白血球）劉完素倡導(dǎo)火熱論；張從正力倡“攻邪論”；李杲提出“內(nèi)傷脾胃，百病由生”的理論；朱震亨創(chuàng)造性（高血壓心臟病糖尿?。┑仃U明了相火的演變規(guī)律。編輯本段明清時(shí)期是中醫(yī)學(xué)理論綜合匯編、深化發(fā)展，臨床各科辨證體系豐富、提高階段。如明代樓英的《醫(yī)學(xué)綱目》和王肯堂的《證治準(zhǔn)繩》，清代吳謙等編著的《醫(yī)宗金鑒》和陳夢雷主編的（傳染病丙肝乙肝甲肝）《古今圖書集成·醫(yī)部全錄》等。王清任著《醫(yī)林改錯(cuò)》，注重實(shí)證研究，糾正了古醫(yī)籍中關(guān)于解剖知識(shí)的某些錯(cuò)誤，肯定了“腦主思維”，（肺炎青霉素肝炎）發(fā)展了瘀血理論。溫病學(xué)說的形成和發(fā)展，標(biāo)志著中醫(yī)理論的創(chuàng)新與突破，吳有性著《溫疫論》，葉天士著（高血壓心臟病糖尿?。稖?zé)岵∑罚瑓蔷贤ㄖ稖夭l辨》等，在藥物學(xué)研究方面，李時(shí)珍著的《本草綱目》，總結(jié)了16世紀(jì)以前我國藥物學(xué)研究的成就。（腫瘤癌癥胃癌腸癌肺癌）而西方醫(yī)學(xué)隨著西羅馬帝國的滅亡，逐漸進(jìn)入了中世紀(jì)的千年黑暗，科學(xué)變成了神學(xué)的奴婢，牧師取代醫(yī)師。（傳染病丙肝乙肝甲肝）從13世紀(jì)開始，始漸復(fù)明，直到15世紀(jì)，沖破封建宗教藩籬，才得以迅速發(fā)展。達(dá)·芬奇開創(chuàng)現(xiàn)代解剖學(xué)，維薩里創(chuàng)立解剖生理學(xué)；1731年意大利摩爾干尼創(chuàng)立了病理解剖學(xué)；1855年德國魏爾嘯創(chuàng)建了細(xì)胞病理學(xué)；與此同時(shí)西方科學(xué)方法論對醫(yī)學(xué)發(fā)展具有指導(dǎo)作用。以實(shí)驗(yàn)為主的實(shí)證方法(觀察實(shí)驗(yàn)和比較分析)、及對醫(yī)學(xué)研究中的“經(jīng)院哲學(xué)”的徹底決裂、依靠各門自然科學(xué)所提供的技術(shù)手段和方法，（肺血液血小板紅血球白血球）培養(yǎng)了醫(yī)學(xué)家們的科學(xué)意識(shí)，賦予了醫(yī)學(xué)的自然科學(xué)屬性，使其擺脫了思辯推理的玄想而成就了生物醫(yī)學(xué)模式（傳染病丙肝乙肝甲肝）下的實(shí)驗(yàn)科學(xué)。（高血壓心臟病糖尿?。┲链酥嗅t(yī)學(xué)在實(shí)證醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已無法于西醫(yī)同日而語。但中醫(yī)學(xué)相對于西醫(yī)學(xué)的優(yōu)勢是從宏觀入手，注重整體，強(qiáng)調(diào)局部與局部、局部與整體之間的聯(lián)系，重視辨證，主張“三因治宜”的個(gè)體化診療方略等。編輯本段東西方醫(yī)學(xué)差異（腫瘤癌癥胃癌腸癌肺癌）中、西醫(yī)學(xué)運(yùn)用不同的思維模式診治疾病，其基本理論各成體系并有（傳染病丙肝乙肝甲肝）根本差異。中西醫(yī)學(xué)的差異不僅僅是有否實(shí)證的科學(xué)理念，最主要的是兩種文化體系的差別。從理論上講，中西醫(yī)學(xué)是兩種不可能統(tǒng)一的醫(yī)學(xué)體系?！爸畜w西用”曾成為中西醫(yī)匯通派的指導(dǎo)思想，但由于兩種醫(yī)學(xué)的根基不同，硬在中醫(yī)之體上套上西醫(yī)之用，近一個(gè)世紀(jì)的事實(shí)證明，“匯通醫(yī)學(xué)的體用判斷脫離了中西醫(yī)學(xué)的事實(shí)認(rèn)識(shí)，以價(jià)值認(rèn)識(shí)代替了事實(shí)認(rèn)識(shí)，決定最終結(jié)果勞而無功”，因此，中、西醫(yī)學(xué)應(yīng)并存共榮而不必強(qiáng)求統(tǒng)一。（腫瘤癌癥胃癌腸癌肺癌）盡管目前中、西醫(yī)學(xué)還不可能融合成為一種統(tǒng)一的醫(yī)學(xué)模式，但可以獨(dú)立發(fā)展，并存共榮，整合互補(bǔ)。緣于現(xiàn)代信息論、系統(tǒng)論和控制論的影響，西醫(yī)學(xué)的發(fā)展趨勢若僅僅是單純地重視分析而忽略了（傳染病丙肝乙肝甲肝）整體結(jié)構(gòu)和整體功能，無疑將漸行漸窄。而中醫(yī)講究“感悟”，未免夾帶有很多主觀因素，（肺血液血小板紅血球白血球）難以客觀地定量，定性。若中醫(yī)的診察疾病能參考現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的微觀分析，將辨證與辨病相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)宏觀與微觀的統(tǒng)一，使中醫(yī)診斷客觀化，即把分析與綜合相結(jié)合的方法引入中醫(yī)理、法、方（高血壓心臟病糖尿?。?、藥的研究，使二者有機(jī)結(jié)合（肺炎青霉素肝炎），互相借鑒、補(bǔ)充，避免各自的片面性、局限性，這將有利于中西醫(yī)學(xué)的優(yōu)勢互補(bǔ)，“和而不同”，多元發(fā)展。近年來，中醫(yī)藥在防治非典、禽流感和艾滋病方面發(fā)揮的獨(dú)特作用也證實(shí)了二者的有機(jī)結(jié)合，具有肯定的臨床療效。編輯本段東西方醫(yī)學(xué)交融（傳染病丙肝乙肝甲肝）不管是中醫(yī)學(xué)還是西醫(yī)學(xué)，從二者現(xiàn)有的思維方式的發(fā)展趨勢來看，均是走向現(xiàn)代系統(tǒng)論思維，中醫(yī)藥學(xué)理論與現(xiàn)代科學(xué)體系之間具有系統(tǒng)同型性，屬于本質(zhì)相同而描述表達(dá)方式不同的兩種科學(xué)形式?？赏诂F(xiàn)代系統(tǒng)論思維上實(shí)現(xiàn)交融或統(tǒng)一，（高血壓心臟病糖尿?。┏蔀橹形麽t(yī)在新的發(fā)展水平上實(shí)現(xiàn)交融或統(tǒng)一的支撐點(diǎn)，希冀籍此能給中醫(yī)學(xué)以至生命科學(xué)帶來良好的發(fā)展機(jī)遇，進(jìn)而對醫(yī)學(xué)理論帶來新的革命。編輯本段現(xiàn)代中醫(yī)史（腫瘤癌癥胃癌腸癌肺癌）上個(gè)世紀(jì)末,本世紀(jì)初，1996年,清華學(xué)界對中醫(yī)氣本質(zhì)，經(jīng)絡(luò)實(shí)質(zhì)，陰陽，五行，藏象，中醫(yī)哲學(xué)觀等都有了新的全面整體創(chuàng)造性的認(rèn)識(shí)和解說。如，鄧宇等發(fā)現(xiàn)的:氣是流動(dòng)著的‘信息－能量－物質(zhì)’的混合統(tǒng)一體；（傳染病丙肝乙肝甲肝）分形分維的經(jīng)絡(luò)解剖結(jié)構(gòu)；數(shù)理陰陽；中醫(yī)分形集：分形陰陽集－陰陽集的分形分維數(shù)，五行分形集－五行集的分維數(shù)；分形藏象五系統(tǒng)－暨心系統(tǒng)、肝系統(tǒng)、脾系統(tǒng)、肺系統(tǒng)、腎系統(tǒng)；中醫(yī)三個(gè)哲學(xué)觀－新提出的第三哲學(xué)觀：相似觀－分形論等。（肺血液血小板紅血球白血球）還包括近代針灸經(jīng)絡(luò)的發(fā)展史,近代中醫(yī)氣的進(jìn)展簡史,中西醫(yī)結(jié)合史,中醫(yī)中藥史等.古代(經(jīng)典)中醫(yī)史（腫瘤癌癥胃癌腸癌肺癌）中國的中醫(yī)學(xué)起源于三皇五帝時(shí)期，相傳伏羲發(fā)明了（傳染病丙肝乙肝甲肝）針灸并嘗試草藥。在公元前3000多年，中國的軒轅黃帝寫下了人類第一部醫(yī)學(xué)著作——《祝由科》，后世人在這部醫(yī)藥著作的基礎(chǔ)上不斷增補(bǔ)刪改，逐漸形成了后來的《黃帝內(nèi)經(jīng)》和《黃帝外經(jīng)》，并由祝由科里將純粹的醫(yī)藥分離了出來，形成了后來的中醫(yī)學(xué)。而其中的《黃帝內(nèi)經(jīng)》則在世界上（高血壓心臟病糖尿?。┑谝粋€(gè)提出了“不治已病治未病”這一防病養(yǎng)生保健康的預(yù)防醫(yī)學(xué)觀點(diǎn)。（肺炎青霉素肝炎）軒轅黃帝早在周代(公元前1046年（肺血液血小板紅血球白血球）－公元前771年)就建立了世界上第一個(gè)醫(yī)院和醫(yī)療制度，周代的醫(yī)療機(jī)構(gòu)設(shè)有醫(yī)師、上士、下士、府（管藥庫）、史（管記錄）、徒若干人。下面又分食醫(yī)（管飲食衛(wèi)庫）、疾醫(yī)（內(nèi)科）、瘍醫(yī)（外科）、獸醫(yī)四種，這是世界上最早的醫(yī)學(xué)分科。醫(yī)師總管醫(yī)藥行政，并在年終對醫(yī)生進(jìn)行考核；《周禮》記載“歲冬則稽其事，以制其食”，就是說，醫(yī)生每年都要通過年終考核增減俸祿。（傳染病丙肝乙肝甲肝）當(dāng)時(shí)的患者已經(jīng)分科治療，而且建立病歷。（高血壓心臟病糖尿病）“死終則各書其所以，而入于醫(yī)師”，（肺血液血小板紅血球白血球）規(guī)定在死者病歷上要寫明死因，然后送交醫(yī)師存檔，以便總結(jié)醫(yī)療經(jīng)驗(yàn)，提高醫(yī)療技術(shù)。這也是世界上最早的病歷制度。在春秋戰(zhàn)國（公元前770年－前221年）時(shí)期名醫(yī)輩出，（肺血液血小板紅血球白血球）秦國有名醫(yī)醫(yī)緩，齊國有長桑和他的徒弟扁鵲。扁鵲發(fā)明了中醫(yī)獨(dú)特的辨證論治，并總結(jié)為“四診”方法，即“望、聞、問、切”。扁鵲看病行醫(yī)有“六不治”原則：一是依仗權(quán)勢，驕橫跋扈的人不治；（肺血液血小板紅血球白血球）二是貪圖錢財(cái)，不顧性命者不治；三是暴飲暴食，飲食無常者不治；四是病深不早求醫(yī)者不治；五是身體虛弱不能服藥者不治；六是相信巫術(shù)不相信醫(yī)道者不治。后世則尊稱他為神醫(yī)扁鵲。春秋戰(zhàn)國時(shí)流行的主要醫(yī)學(xué)著作有《黃帝內(nèi)經(jīng)》、（高血壓心臟病糖尿?。饵S帝外經(jīng)》、《扁鵲內(nèi)經(jīng)》、《扁鵲外經(jīng)》、《白氏內(nèi)經(jīng)》、《白氏外經(jīng)》和《旁篇》這七本，（傳染病丙肝乙肝甲肝）合成“七經(jīng)”。（肺炎青霉素肝炎）在秦朝（公元前221年—公元前207年）出現(xiàn)了世界上最早的專門法醫(yī)——"令史"。秦律規(guī)定，死因不明的案件原則上都要進(jìn)行尸體檢驗(yàn)，司法官如果違法不進(jìn)行檢驗(yàn)，將受到處罰。秦代的《封診式》對法醫(yī)鑒定的方法、程序等有較為詳細(xì)的記載。在人命案件中，鑒定檢驗(yàn)的主要內(nèi)容有尸體的位置、創(chuàng)傷的部位、數(shù)量、方向以及大小等。（肺血液血小板紅血球白血球）令史檢驗(yàn)完成之后，必須提交書面報(bào)告，稱為“爰書”，是世界上最早的法醫(yī)鑒定和現(xiàn)場勘察報(bào)告。秦代還在世界上第一個(gè)建立傳染病醫(yī)院——“癘遷所”，（高血壓心臟病糖尿?。┎⒅贫俗钤绲闹委焸魅静〉母綦x制度。據(jù)1975年湖北省云夢睡虎地出土秦簡中記載：當(dāng)時(shí)規(guī)定，凡經(jīng)醫(yī)生在給病人檢查后發(fā)現(xiàn)有鼻梁塌陷、手上無汗毛、聲音沙啞、刺激鼻腔不打噴嚏等癥狀者，一律送至癘遷所隔離治療。（傳染病丙肝乙肝甲肝）這說明中國古代對傳染性疾病的治療措施，很早就已經(jīng)是得力有效的。到了西漢時(shí)期(公元前202年－公元8年)，中醫(yī)的陰陽五行理論已經(jīng)非常完備，名醫(yī)則有太倉公淳于意和公乘陽慶。東漢出現(xiàn)了著名醫(yī)學(xué)家張仲景和華佗。張仲景完善了中醫(yī)的辨證理論，他還是世界上第一個(gè)臨床醫(yī)學(xué)大師，被尊稱為醫(yī)圣。他著有（高血壓心臟病糖尿?。秱摗贰动煁D人方》、《黃素方》、《口齒論》、《平病方》等等醫(yī)書，最終流傳下來的醫(yī)書被并被后人編纂為《傷寒雜病論》和《金匱要略》。張仲景采用辨證論治的基本原則，在《傷寒論》中歸結(jié)為“八綱辨證”和“六經(jīng)論治”，經(jīng)由這兩種方法辨證論治后，再采用“八法”（汗、吐、下、（傳染病丙肝乙肝甲肝）和、溫、清、補(bǔ)、消）治療疾病。“八綱辨證”是書中貫徹辨證論治的具體原則，所謂“八綱”（陰、陽、表、里、寒、熱、虛、實(shí)）是運(yùn)用“四診”（望、聞、問、切）分析和檢查疾病的部位、性質(zhì)而歸納出來，“六經(jīng)論治”是整個(gè)臟腑經(jīng)絡(luò)學(xué)說在臨床醫(yī)學(xué)上的具體運(yùn)用。東漢末年，華佗則以精通外科手術(shù)和麻醉名聞天下，華佗是世界上（高血壓心臟病糖尿?。┑谝粋€(gè)使用麻醉術(shù)進(jìn)行手術(shù)的人，他發(fā)明的麻沸散是世界上最早的麻醉藥物，還創(chuàng)立了世界上最早的健身體操“五禽戲”?？上A佗所著醫(yī)書的（肺血液血小板紅血球白血球）《青囊書》最后被付之一炬。在漢代，大量的醫(yī)藥和歷算等書籍傳入西藏（《西藏王統(tǒng)記》記載）。在漢代還出現(xiàn)了專門性的婦科醫(yī)院，西漢時(shí)的“乳舍”，是世界上最早的婦產(chǎn)醫(yī)院。（肺炎青霉素肝炎）南北朝時(shí)期(420年－589年)問世了世界上最早的兩本兒科專著，即王末鈔的《小兒用藥本草》和徐叔響的《療少小百病雜方》。南朝宋元嘉二十年(公元443年)，（傳染病丙肝乙肝甲肝）太醫(yī)令秦承祖創(chuàng)建了世界上第一個(gè)醫(yī)學(xué)院。到了公元6世紀(jì)，隋朝完善了這一醫(yī)學(xué)教育機(jī)構(gòu)，并命名為“太醫(yī)署”，署內(nèi)分醫(yī)、藥兩部，太醫(yī)令是最高官職，丞為之助理，下有主藥、醫(yī)師、藥園師、醫(yī)博士、助教、按摩博士、祝禁博士，（高血壓心臟病糖尿?。┰谛熒疃鄷r(shí)達(dá)580人之多。（腫瘤癌癥胃癌腸癌肺癌）在唐朝（公元618年－907年），孫思邈總結(jié)前人的理論并總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，收集藥方多達(dá)5000多個(gè)，出版了《大醫(yī)精誠》、（肺血液血小板紅血球白血球）《千金要方》和《千金翼方》三本醫(yī)學(xué)著作，后世尊稱他為藥王。唐朝以后，中國醫(yī)學(xué)理論和著作大量外傳到突厥、高句麗、日本、中亞、西亞等地。（傳染病丙肝乙肝甲肝）到了在唐末宋初，兒科專著《顱囟經(jīng)》問世流行，而世界醫(yī)學(xué)史上第一個(gè)著名兒科專家錢乙（公元1032－1113年）則受此書啟發(fā)，撰寫了著名的兒科巨著《小兒藥證直訣》，后人把錢乙尊稱為“兒科之圣”，“幼科之鼻祖”。北宋時(shí)期（960年－1127年），宋政府設(shè)立翰林醫(yī)學(xué)院即太醫(yī)局，醫(yī)學(xué)分科已經(jīng)非常完備，并且統(tǒng)一了中國針灸穴位，出版《圖經(jīng)》。北宋的宋慈出版了世界上最早的法醫(yī)學(xué)著作（高血壓心臟病糖尿?。断丛┘洝?。（肺炎青霉素肝炎）在明朝（1368年－1644），著名醫(yī)學(xué)家李時(shí)珍的醫(yī)學(xué)巨著《本草綱目》成書，這本書不僅是藥物學(xué)專著，還包括植物學(xué)、動(dòng)物學(xué)、（傳染病丙肝乙肝甲肝）礦物學(xué)、化學(xué)等方面的知識(shí)?！侗静菥V目》刊行后很快傳入日本、朝鮮及越南等亞洲地區(qū)，（肺血液血小板紅血球白血球）在公元17、18世紀(jì)先后被翻譯成多種歐洲語言。另一方面，李時(shí)珍是世界上第一個(gè)提出