透射電鏡樣本的制備課件

透射電鏡樣本的制備超薄切片制樣負(fù)染超薄切片由于電子的穿透能力弱，一般的組織細(xì)胞的切片，無(wú)法在電鏡下獲得清晰的圖像。阻礙了電子顯微鏡的發(fā)展。1957年，英國(guó)Huxley發(fā)明超薄切片機(jī)。超薄切片制片過(guò)程取材取材具體方法將動(dòng)物麻醉或急性處死，暴露的所需臟器。用鋒利剪刀剪下一小塊組織，放到滴有預(yù)冷固定液的蠟片上。將組織切成細(xì)長(zhǎng)條，再將其切成小塊（1mm3）。將小塊移至裝有預(yù)冷固定液的清潔小瓶?jī)?nèi)。若組織塊帶有血液而使小瓶?jī)?nèi)固定液渾濁，應(yīng)更換新鮮固定液，然后置于4℃冰箱內(nèi)固定。灌注固定通過(guò)血液循環(huán)的途徑將醛類固定液灌流到所要男友定的組織中，待組織適度硬化后，切取所需組織。此法固定迅速而均勻，可同時(shí)保存酶的活性和組織超微結(jié)構(gòu)。適用于取材柔軟組織或難以浸透、死后變化快的組織和器官，如對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、視網(wǎng)膜和腎臟等組織的固定。理想固定劑常用固定劑固定方法——戊二醛-鋨酸雙固定先用2.5%戊二醛固定2h以上。緩沖液多次清洗（pH7.40.2mol/L磷酸緩沖液洗三次，15min/次）。1%鋨酸固定2h。清洗組織在固定后，應(yīng)用清洗液洗去殘留的固定液殘留的醛可與鋨酸反應(yīng)產(chǎn)物細(xì)的電子致密的還原鋨。鋨酸可與乙醇作用生成沉淀。清洗液采用與固定液同系列的緩沖液。（磷酸緩沖液，二甲砷酸鈉緩沖液）脫水去除樣品中的水，為包埋劑的均勻浸透做準(zhǔn)備常用脫水劑乙醇，與環(huán)氧樹脂的互溶性差，需用環(huán)氧丙烷作為中間溶劑進(jìn)行轉(zhuǎn)換。丙酮市售的無(wú)水丙酮含少量水分，可加入無(wú)水硫酸鈉或硫酸銅等干燥劑吸去水分。脫水15min15min15min20min20min浸透和包埋通過(guò)脫水劑稀釋包埋劑，最終讓包埋劑逐漸取代脫水劑，使其滲透到組織細(xì)胞中去以包埋劑完全浸透到組織內(nèi)部，經(jīng)加溫逐漸聚合成堅(jiān)硬的固體，成為細(xì)胞結(jié)構(gòu)的支架，能夠承受切片時(shí)的各種力的作用，有利于超薄切片。丙酮：包埋劑2：137℃1h丙酮：包埋劑1：137℃1h純包埋劑37℃1h包埋37℃過(guò)夜，45℃24h，65℃24h理想包埋劑Epon812：環(huán)氧樹脂包埋劑。淡黃色液體，黏度較低，易滲入組織，對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)保存好，在配制時(shí)需充分?jǐn)嚢?。聚合后成為具有穩(wěn)定三維空間結(jié)構(gòu)的固體。Epon812DDSA（十二烷基琥珀酸酐）固化劑：控制軟度MNA（甲基內(nèi)次甲基鄰苯二甲酸酐）固化劑：控制硬度DMP-30（2,4,6三，二甲氨基甲基苯酚）加速劑包埋劑配方季節(jié)配比包埋液成份5mL10mL20mL30mL40mL50mL春秋

Epon8122.4954.999.9814.9719.9624.95DDSA0.621.242.483.724.966.2MNA1.8853.777.5411.3115.0818.85DMP-300.0850.170.340.510.680.85夏

Epon8122.575.1410.2815.4220.5625.7DDSA0.310.621.241.862.483.1MNA2.124.248.4812.7216.9621.2DMP-300.0850.170.340.510.680.85冬

Epon8122.4254.859.714.5519.424.25DDSA0.9251.853.75.557.49.25MNA1.653.36.69.913.216.5DMP-300.0850.170.340.510.680.85包埋板切片修塊切片超薄切片機(jī)機(jī)械推進(jìn)式：通過(guò)微動(dòng)螺懸及微動(dòng)杠桿使標(biāo)本臂向刀刃作微小推進(jìn)。熱脹冷縮式推進(jìn)：利用機(jī)內(nèi)金屬桿在加熱或冷卻的微小變化來(lái)推進(jìn)。判斷切片厚度：利用切片反射的光和從切片下水面反射光發(fā)生干涉，不同厚度切片在顯微鏡下呈現(xiàn)不同的干涉色，干涉色與切厚度的關(guān)系是：灰色40-50nm分辨率高，反差小銀白色50-70nm金黃色70-90nm分辨率低，反差好紫色90nm以上電子束不易穿過(guò)FORMVAR膜制備Formvar（PVF）溶于純二氯乙烯制成0.2-0.5%的制膜液染色組織細(xì)胞的成分主要由碳、氫、氧、氮等低原子序數(shù)的元素組成，不能形成足夠的反差。利用重金屬離子對(duì)不同細(xì)胞結(jié)構(gòu)的結(jié)合能力不同，使各細(xì)胞結(jié)構(gòu)對(duì)電子產(chǎn)生不同散射程度以增強(qiáng)反差。染色劑30min左右與CO2接觸會(huì)形成不溶性碳酸鉛沉淀10min左右半薄切片制作可進(jìn)行定位，克服超薄切片盲目性，提高電鏡觀察的效果。修塊時(shí)，將切片修得大一些，切成1μm的厚片，甲苯胺藍(lán)染色觀察。超薄切片制樣程序2-3%戊二醛固定液中4℃，2小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。磷酸緩沖液漂洗3次，每次15min。1%鋨酸2h磷酸緩沖液漂洗3次，每次15min。（可4℃過(guò)夜）取材：處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后半分鐘到1分鐘內(nèi)，最多15分鐘取出1mm3的組織塊固定：50%丙酮15min70%丙酮15min90%丙酮

15min100%丙酮2次，每次20min脫水：100%丙酮：Epon812=2:11h;100%丙酮：Epon812=1:11h100%丙酮：Epon812=1:21h純Epon8122-4h浸透：

Epon812包埋劑35℃過(guò)夜Epon812包埋劑45℃24hEpon812包埋劑60℃24h包埋：5%醋酸鈾30min-1h。雙蒸水洗3次檸檬酸鉛染色5-10min雙蒸水洗3次超薄切片：包埋塊修整成四邊光滑尖端呈梯形面的錐體，切成50-70nm的超薄切片。切片染色：

負(fù)染陰性染色，是相對(duì)于普通染色（稱正染色）而言。首先由hall在1955年提出。Hall在病毒研究中用磷鎢酸染色后，發(fā)現(xiàn)圖像的背景很暗，而病毒象一個(gè)亮晶的"空洞"被清楚地顯示出來(lái)。在超薄切片的染色中，染色后的樣品電子密度因染色而被加強(qiáng)，在圖像中呈現(xiàn)黑色。而背景因未被染色而呈光亮，這種染色稱為正染色。而負(fù)染色則相反，由于染液中某些電子密度高的物質(zhì)(如重金屬鹽等)"包埋"低電子密度的樣品，結(jié)果在圖像中背景是黑暗的，而樣品像"透明"地光亮。兩者之間的反差正好相反，故稱為負(fù)染色負(fù)染簡(jiǎn)單快速可顯示生物大分子、細(xì)菌、分離的細(xì)胞器以及蛋白晶體等樣品的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、大小及表面結(jié)構(gòu)的特征。病毒負(fù)染染色劑的條件較強(qiáng)的電子散射能力以產(chǎn)生足夠的圖像反差。熔點(diǎn)高，在電子束的轟擊下不會(huì)升華溶解度大，不易析出沉淀。在電鏡下不呈現(xiàn)可觀察到的結(jié)構(gòu)。分子小，容易滲入不規(guī)則表的凹陷處與樣品不起化學(xué)反應(yīng)。目前常用的負(fù)染液：磷鎢酸，磷鎢酸鉀，磷鎢酸鈉。磷鎢酸、磷鎢酸鈉、磷鎢酸鉀溶液通常用雙蒸水或磷酸緩沖液配制成1％～3％的溶液，使用時(shí)應(yīng)用1mol／L氫氧化鈉溶液將負(fù)染色液的pH值調(diào)至6.4～7.0或?qū)嶒?yàn)所需的值。樣品要求樣品要適當(dāng)提純。不要求樣品懸液的純度很高，但雜質(zhì)過(guò)多，如大量的細(xì)胞碎片，培養(yǎng)基殘?jiān)?，糖類及各種鹽類結(jié)晶的存在會(huì)干擾染色反應(yīng)和電鏡的觀察。樣品懸液濃度適中，太稀不易找到樣品，太濃樣品堆積影響觀察。負(fù)染染色方法懸滴法：懸滴法用一根細(xì)滴吸管吸一滴樣品懸液滴在有膜的銅網(wǎng)上，滴樣時(shí)要防止銅網(wǎng)被液體吸到管上來(lái)或翻轉(zhuǎn)而被污染。滴液后靜置數(shù)分鐘，然后用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸去多余的液體，滴上負(fù)染色液，染色1～2分鐘用濾紙吸去負(fù)染色液，再用蒸餾水滴在銅網(wǎng)上洗1～2次，用濾紙吸去水，待干后可用于電鏡觀察。噴霧法：將染色液和懸液樣品等量混合，用特制的噴霧器噴到有膜的銅網(wǎng)上，待干后可用于電鏡觀察。噴霧法的優(yōu)點(diǎn)是霧滴較