仿刺參銅鋅超氧化物歧化酶(Aj-SOD1)的功能及性質(zhì)分析.x課件_第1頁
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文檔簡介

仿刺參銅鋅超氧化物歧化酶（Aj-SOD1）的功能及性質(zhì)分析超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,簡稱SOD1)是生物體內(nèi)一種重要的金屬酶,對機體有高效的抗氧化作用。本實驗主要研究仿刺參銅鋅超氧化物歧化酶的功能及性質(zhì)。通過生物信息學(xué)分析方法,對Aj-SOD1理論蛋白等電點及蛋白分子質(zhì)量進行預(yù)測(pI=5.65,MW=15.47kDa)。利用MAGA6.0構(gòu)建了Aj-SOD1的系統(tǒng)進化樹。利用SwissModel分析蛋白的三級結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示目的蛋白能夠結(jié)合銅、鋅離子。利用熒光定量PCR,對Aj-SOD1基因的分布表達情況進行分析。結(jié)果表明,發(fā)現(xiàn)Aj-SOD1在各組織都有相應(yīng)的表達,但在腸和呼吸樹中表達顯著。實驗首先對海參的體腔細胞進行離體培養(yǎng),構(gòu)建H202/LPS的細胞培養(yǎng)模型,對經(jīng)H202/LPS刺激細胞的情況進行分析。結(jié)果表明,在H202/LPS刺激過程中,海參體腔細胞出現(xiàn)了明顯凋亡損傷作用。實驗同時研究了Aj-SOD1蛋白對細胞具有一定的抗氧化作用,并對經(jīng)H202/LPS刺激損傷細胞的修復(fù)功能。本實驗克隆了(Aj-SOD1)cDNA全長編碼序列基因。利用TRIZOL法從海參腸組織中提取總RNA,通過反轉(zhuǎn)錄PCR擴增獲得Aj-SOD1基因的編碼序列(GenBank:JX097096.1,459bp)。構(gòu)建克隆載體pMD18-Aj-SOD1。在目的基因兩端引入XhoI/NdeⅠ酶切位點,及His標簽后,將Aj-SOD1克隆質(zhì)粒與表達載體pET30a(+)分別雙酶切后連接,構(gòu)建重組表達載體pET30a-Aj-SOD1。將含有pET30a-SOD1重組子轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞中。成功構(gòu)建Aj-SOD1的原核表達載體。通過IPTG誘導(dǎo)表達后,實驗利用Ni-NTA親和層析,獲得了純度高、可溶、具有抗氧化活性的海參SOD1蛋白。最后實驗優(yōu)化了蛋白表達的條件,獲得了最優(yōu)表達條件,溫度37℃,誘導(dǎo)時間8h,轉(zhuǎn)速設(shè)置為200r/min,誘導(dǎo)劑濃度0.1mM。本實驗對

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