蛋白質(zhì)組學(xué)與分析技術(shù)課第九講課件

蛋白質(zhì)組學(xué)與分析技術(shù)

（第九

講）酵母雙雜交技術(shù)基因敲除技術(shù)

2010.5.05酵母雙雜交技術(shù)主要內(nèi)容酵母雙雜交概念酵母雙雜交的基本原理酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用酵母雙雜交衍生系統(tǒng)酵母雙雜交技術(shù)未來(lái)展望

什么是酵母雙雜交？

酵母雙雜交(YeastTwo-Hybrid)，簡(jiǎn)稱雙雜交系統(tǒng)(Two-HybridSystem)，又稱相互作用陷阱(InteractionTrap)，是1989年由StanleyFields和Song等在驗(yàn)證兩個(gè)蛋白質(zhì)間相互作用的親和力時(shí)初步建立的，并在Nature雜志上首先描述了這一系統(tǒng)，該系統(tǒng)是以釀酒酵（S.cerevisiae）為宿主，在酵母菌內(nèi)研究蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用的一種分子生物學(xué)方法。酵母雙雜交正成為探索蛋白質(zhì)相互作用最常用和最有力的工具。

目前已被廣泛地應(yīng)用于真核基因的表達(dá)與調(diào)控、細(xì)胞黏合因子間的相互作用、信號(hào)傳導(dǎo)通路以及細(xì)胞周期與分化、反式因子的鑒定與分離等諸多領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究及藥物開發(fā)。酵母雙雜交的基本原理

酵母雙雜交系統(tǒng)的建立是基于對(duì)真核生物轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控的認(rèn)識(shí)。轉(zhuǎn)錄起始需要轉(zhuǎn)錄激活因子的參與，而真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子大多是由結(jié)構(gòu)上分離、功能上獨(dú)立的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNAbindingdomain,簡(jiǎn)稱為DNA-BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcriptionactivatingdomain,簡(jiǎn)稱AD)。轉(zhuǎn)錄激活蛋白可以和DNA上特異的序列結(jié)合，同時(shí)可啟動(dòng)相應(yīng)因子的轉(zhuǎn)錄。它們是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。單獨(dú)的DNA-BD和AD都不能激活轉(zhuǎn)錄起始。但不同轉(zhuǎn)錄激活因子的DNA-BD和AD形成的融合蛋白仍然具有正常的激活轉(zhuǎn)錄起始的功能。

結(jié)合結(jié)構(gòu)域獵物蛋白激活結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-BD)融合的蛋白一般稱為“誘餌蛋白”(baitprotein)與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)融合的蛋白一般稱為“獵物蛋白”(preyprotein)或“靶蛋白”(targetprotein)誘餌蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域報(bào)告基因UAS

啟動(dòng)子酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用1檢驗(yàn)－對(duì)功能已知蛋白間的相互作用優(yōu)點(diǎn)快速和高靈敏度，且反映了蛋白在體內(nèi)的相互作用；還能檢測(cè)出瞬間發(fā)生的信號(hào)反應(yīng)，而用體外檢測(cè)法檢測(cè)蛋白要經(jīng)過一系列洗滌過程，常致使相互作用不再發(fā)生。融合蛋白由于BD和DNA序列的相互作用而變得更加穩(wěn)定。并且雜合蛋白一般都是由高拷貝質(zhì)粒的強(qiáng)啟動(dòng)子過量表達(dá)的蛋白，在轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生了一些復(fù)合酶使信號(hào)得以放大。2研究一對(duì)蛋白間發(fā)生相互作用所必需的結(jié)構(gòu)域可應(yīng)用于確定兩已知有生理作用的蛋白間的作用位點(diǎn)或結(jié)構(gòu)域。利用此系統(tǒng)已分析和測(cè)定了多種重要的結(jié)構(gòu)域，當(dāng)證實(shí)了兩個(gè)蛋白有相互作用后，可以對(duì)其進(jìn)行缺失實(shí)驗(yàn)而找到相互作用發(fā)生所必須的氨基酸殘基。通過該方法還能研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能。通常需要對(duì)待測(cè)蛋白做點(diǎn)突變或缺失突變的處理。3發(fā)現(xiàn)新的作用蛋白質(zhì)用已知功能的蛋白基因篩選雙雜交cDNA文庫(kù)，以研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑，尋找與靶蛋白相互作用的新蛋白，是雙雜交系統(tǒng)最廣泛和最有價(jià)值的應(yīng)用。4尋找具有藥物治療作用的小分子多肽通過雙雜交系統(tǒng)篩選和目標(biāo)蛋白相互作用的多肽，如靶蛋白是藥物設(shè)計(jì)的目標(biāo)，則有可能得到一些具有藥物治療作用的小分子多肽藥物。5分析新基因的生物學(xué)功能即以功能未知的新基因蛋白克隆在BD載體上，而把將要篩選的cDNA文庫(kù)克隆在AD載體上，利用雙雜交技術(shù)可以找到一個(gè)新的結(jié)合蛋白，這個(gè)結(jié)合蛋白可能是已知基因也可能是未知基因所編碼，然后根據(jù)調(diào)到的已知基因的功能推測(cè)該新基因的功能。6尋找調(diào)控蛋白相互作用的蛋白，在恢復(fù)轉(zhuǎn)錄活性的雙雜交系統(tǒng)中加入某一分子化合物后再檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)強(qiáng)度，可用來(lái)尋找抑制蛋白質(zhì)之間相互作用的小分子化合物。7蛋白質(zhì)相互作用圖譜的構(gòu)建隨著基因組研究計(jì)劃的開展，及mRNA在不同組織器官的不同發(fā)育階段表達(dá)圖譜的構(gòu)建，蛋白在不同時(shí)空狀態(tài)下相互作用圖譜的構(gòu)建也逐漸展開。酵母蛋白質(zhì)相互作用的橫向研究是近年來(lái)雙雜交系統(tǒng)最引人注目的應(yīng)用，用以揭示多種細(xì)胞活動(dòng)過程中各控制因子間的聯(lián)系。酵母雙雜交技術(shù)應(yīng)用的趨勢(shì)及展望

酵母雙雜交技術(shù)問世至今十多年來(lái)，已經(jīng)在蛋白質(zhì)間的相互作用研究、篩選新的蛋白、研究蛋白質(zhì)的功能等諸多方面發(fā)揮了重要作用。該技術(shù)已經(jīng)成為許多實(shí)驗(yàn)室研究蛋白質(zhì)的相互作用和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的必備手段。目前除了應(yīng)用雙雜交系統(tǒng)繼續(xù)尋找和靶蛋白起相互作用的新蛋白外，相當(dāng)一部分的實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)已放在如何利用雙雜交系統(tǒng)作為媒介來(lái)研究蛋白相互作用的調(diào)控機(jī)制以及尋找蛋白聯(lián)系圖譜，這在后基因組時(shí)代更具意義。

交鏈孢菌植物激活蛋白信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)理的研究——應(yīng)用實(shí)例

利用酵母雙雜交技術(shù)，即將交鏈孢菌植物激活蛋白目的基因克隆在DNA-BD載體上,將擬南芥cDNA文庫(kù)或番茄cDNA文庫(kù)克隆在AD載體上，在酵母中進(jìn)行表達(dá)篩選，可得到目的基因的互作蛋白，然后針對(duì)互作蛋白進(jìn)行植物激活蛋白信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)理的研究。技術(shù)路線圖

酵母雙雜交體系的實(shí)驗(yàn)程序誘餌蛋白自激活作用檢測(cè)待篩cDNA文庫(kù)片段克隆在AD質(zhì)粒載體上把cDNA文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含誘餌載體BD-X的感受態(tài)酵母菌內(nèi)檢測(cè)挑選陽(yáng)性克隆酵母質(zhì)粒DNA提取并轉(zhuǎn)化大腸桿菌提取細(xì)菌質(zhì)粒酶切鑒定明確與已知靶蛋白X相作用的Y蛋白的核苷酸序列待篩cDNA文庫(kù)質(zhì)粒的準(zhǔn)備將已知靶蛋白質(zhì)X的編碼基因插入BD質(zhì)粒載體，構(gòu)建誘餌載體酵母雙雜交衍生系統(tǒng)單雜交系統(tǒng)（One-hybridsystem）三雜交系統(tǒng)（Three-bindinghybidsystem）反向雙雜交系統(tǒng)（Reversetwo-hybridsystem）無(wú)核雙雜交系統(tǒng)（Non-nucleartwo-hybridsystem）單雜交系統(tǒng)單雜交系統(tǒng)是1993年發(fā)展出來(lái)的一種研究蛋白質(zhì)和DNA相互作用的實(shí)驗(yàn)體系，用于確定識(shí)別特異DNA結(jié)合蛋白。在該系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)錄激活域AD相融合的待篩選蛋白質(zhì)Y直接與DNA結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，使AD直接激活啟動(dòng)子下游報(bào)告基因的表達(dá)。這一過程無(wú)需BD-X的參與，因而通過對(duì)AD-Y文庫(kù)的篩選可分離出與靶DNA序列直接作用的蛋白質(zhì)Y。2酵母單半雜交系統(tǒng)

酵母單半雜交系統(tǒng)(one-and-a-halfhybridsystem)也是一種篩選DNA結(jié)合蛋白的方法，它結(jié)合了單雜交系統(tǒng)和雙雜交系統(tǒng)的特點(diǎn)。是專門用來(lái)鑒別那些只有在與第二個(gè)已知配體以異二聚體形式復(fù)合時(shí)才結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)，或者用來(lái)鑒別那些不能自主結(jié)合DNA、但在有附屬蛋白質(zhì)存在時(shí)可以形成穩(wěn)定的三維復(fù)合物的蛋白質(zhì)。另外，還出現(xiàn)了一些由雙雜交系統(tǒng)衍生而來(lái)的既能篩選蛋白－蛋白相互作用又能篩選蛋白－DNA相互作用的酵母單雙雜交系統(tǒng)（one-two-hybidsystem）等，但應(yīng)用都沒有雙雜交系統(tǒng)廣泛。

3酵母三雜交系統(tǒng)

近幾年來(lái)，以雙雜交思想為基礎(chǔ)建立起來(lái)的三雜交系統(tǒng)（three-bindinghybidsystem）可用來(lái)研究多至三個(gè)分子間的相互作用。兩個(gè)蛋白之間通過第三者發(fā)生相互作用，第三物可以是蛋白質(zhì)、小分子、或RNA。三雜交系統(tǒng)兩個(gè)蛋白之間通過第三種成分，如：聯(lián)結(jié)蛋白、修飾酶、RNA或小分子量的化合物構(gòu)建了三雜交系統(tǒng)。在酵母三雜交系統(tǒng)的最初實(shí)驗(yàn)中，糖皮質(zhì)激素受體與地塞米松FK506聯(lián)結(jié)用于捕捉FK506結(jié)合蛋白。反向雙雜交系統(tǒng)

反向雙雜交系統(tǒng)提供了簡(jiǎn)便的鑒定阻斷蛋白間相互作用的方法。這項(xiàng)技術(shù)的關(guān)鍵是報(bào)道基因URA3的引入。URA3基因在這里起到了反向選擇的作用，它編碼尿嘧啶合成的關(guān)鍵酶，同時(shí)它又可催化5-氟乳清酸（5-FOA）轉(zhuǎn)化為對(duì)細(xì)胞有毒的物質(zhì)。Vidal等將URA3基因的啟動(dòng)子內(nèi)引入GAL4的結(jié)合位點(diǎn)，從而改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的選擇培養(yǎng)基上只有當(dāng)“誘餌”和“獵物”相互作用激活URA3基因的表達(dá)才能生長(zhǎng)。而在含有5-FOA的完全培養(yǎng)基上“誘餌”和“獵物”的相互作用則抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。如果目的蛋白，即與BD或AD融合的蛋白質(zhì)發(fā)生了突變或者由于外加藥物的干擾不再相互作用，URA3基因不能表達(dá)，則細(xì)胞能在含有5-FOA的完全培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。因此可通過篩選5-FOA抗性克隆從隨即突變庫(kù)中鑒定出下調(diào)蛋白相互作用的突變體。反向雙雜交系統(tǒng)可更有效地反應(yīng)蛋白質(zhì)間作用的位點(diǎn)或起決定作用的個(gè)別氨基酸，進(jìn)而分析蛋白結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。無(wú)核雙雜交系統(tǒng)

經(jīng)典的酵母雙雜交系統(tǒng)局限性之一是不適合轉(zhuǎn)膜蛋白的相互作用?，F(xiàn)在，在基因組范圍內(nèi)的酵母雙雜交對(duì)轉(zhuǎn)膜蛋白的研究甚少，近幾年來(lái)，其他幾種酵母雙雜交系統(tǒng)已經(jīng)鑒定了膜蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白相聯(lián)系的蛋白質(zhì)的相互作用。其中包括反向Ras補(bǔ)充系統(tǒng)，G蛋白融合方法和分離泛素膜蛋白酵母雙雜交技術(shù)。酵母雙雜交技術(shù)應(yīng)用的趨勢(shì)及展望

酵母雙雜交技術(shù)問世十多年來(lái)，已經(jīng)在蛋白質(zhì)間的相互作用研究、篩選新的蛋白、研究蛋白質(zhì)的功能等諸多方面發(fā)揮了重要作用。據(jù)估計(jì)，目前發(fā)表的研究蛋白質(zhì)相互作用的文獻(xiàn)中超過一半的發(fā)現(xiàn)來(lái)源于酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)。該技術(shù)已經(jīng)成為許多實(shí)驗(yàn)室研究蛋白質(zhì)的相互作用和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的必備手段。目前，相當(dāng)一部分的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)把重點(diǎn)放在如何利用雙雜交系統(tǒng)作為媒介來(lái)研究蛋白相互作用的調(diào)控機(jī)制以及尋找蛋白質(zhì)作用圖譜，這在后基因組時(shí)代更具意義。

PUBMED搜索“yeasttwohybrid”1989年～2005年基因敲除技術(shù)基因功能研究的主要策略基因敲除基因陷阱T-DNA標(biāo)簽轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽反義RNA技術(shù)

基因敲除的產(chǎn)生背景

80年代后半期，在同源重組技術(shù)及胚胎干細(xì)胞（ESC）技術(shù)逐步完善基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的一門新興的生物技術(shù)技術(shù)基礎(chǔ)—80年代初，ESC分離和體外培養(yǎng)的成功理論基礎(chǔ)—1985年Smithies首次在哺乳動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)了同源重組基因敲除的應(yīng)用現(xiàn)狀

作為功能基因組學(xué)研究方法，在動(dòng)物小鼠和酵母中使用較為廣泛，但在植物中僅在苔蘚植物中使用較為成功，雖有人在高等植物中作了大量實(shí)驗(yàn)，但大部分是不成功的，或至少是用常規(guī)途徑是不可行的。通過對(duì)突變小鼠的表型分析，許多與人類疾病相關(guān)的新基因的功能已得到闡明，并直接導(dǎo)致了現(xiàn)代生物學(xué)研究各個(gè)領(lǐng)域中許多突破性的進(jìn)展現(xiàn)已逐步完善，已從簡(jiǎn)單的完全基因敲除發(fā)展到條件基因敲除，且正朝著特定組織基因敲除、特定時(shí)間基因敲除的可調(diào)控方向發(fā)展

基因敲除的基本概念基因敲除（geneknockout），又稱基因打靶（genetargeting）,是指用外源的DNA與受體細(xì)胞基因組中順序相同或非常相近的基因發(fā)生同源重組，整合至受體細(xì)胞基因組中并得以表達(dá)的一種外源DNA導(dǎo)入技術(shù)對(duì)一個(gè)結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因，從分子水平上設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，將該基因敲除，或用其他順序相近基因取代，然后從整體觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)（植）物，推測(cè)相應(yīng)基因的功能基因敲除的基本方法

通過構(gòu)建一個(gè)突變或缺失的同源媒介基因載體，與受體細(xì)胞基因組中序列相同或相近的正常細(xì)胞因子基因進(jìn)行同源重組，從而整合到受體細(xì)胞的基因組中獲得同源重組的基因，并篩選出所需要的突變或缺失基因，經(jīng)鑒定后將此基因用胚囊顯微注射、電穿孔技術(shù)等導(dǎo)入ESC，寄養(yǎng)于假孕的動(dòng)物體得到嵌合體，嵌合體再將突變或缺失的基因遺傳給子代雜合子，雜合子相互交配可得到野生型、雜合子和突變純合子，最后對(duì)純合子的表型、基因型、基因表達(dá)及其產(chǎn)物等進(jìn)行分析來(lái)確定基因功能基因敲除的主要類型條件型基因敲除

通過定位重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)基因的敲除完全基因敲除

通過同源重組直接將靶基因在細(xì)胞或個(gè)體中的活性完全消除基因敲除的基本原理

利用同源重組的原理，用突變的外源DNA片段整合入受體細(xì)胞的DNA同源序列中，取代某一特定基因從而獲得基因型發(fā)生改變的打靶小鼠，以研究靶基因的體內(nèi)功能或相關(guān)疾病的致病機(jī)制基因敲除的基本程序?qū)⒒蚪M中某一基因克隆，產(chǎn)生其全部或部分的DNA序列，用插入、刪除、置換、修飾等手段對(duì)DNA序列重新構(gòu)建，獲得一個(gè)攜帶DNA突變序列的打靶載體（其側(cè)翼是與基因組中靶基因同源的序列）將靶載體導(dǎo)入小鼠ESC中，使突變DNA與ESC基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，將靶載體DNA序列整合到內(nèi)源基因組中從而得到表達(dá)從細(xì)胞水平和分子水平篩選富集發(fā)生突變的細(xì)胞，注入小鼠囊胚腔中，將囊胚導(dǎo)入假孕母鼠的子宮內(nèi)，發(fā)育成嵌合鼠將雄性嵌合鼠與正常鼠交配，獲得生殖系攜帶突變基因的純合鼠，分析純合鼠的表型、基因型、基因表達(dá)及其產(chǎn)物

基因敲除的主要技術(shù)圖基因敲除技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)整合位點(diǎn)確定、精確，轉(zhuǎn)移基因效率高既可用正?；蚯贸蛔兊幕颍赃M(jìn)行性狀的改良和遺傳病的治療，又可用突變的基因敲除正常的基因，以研究基因在發(fā)育和調(diào)控方面的作用遺傳改變非常清晰，可研究經(jīng)典遺傳學(xué)無(wú)法了解的基因的表現(xiàn)型效應(yīng)基因敲除技術(shù)的缺點(diǎn)操作復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，費(fèi)用居高不下由于基因不完全敲除導(dǎo)致泄漏突變，即在基因敲除過程中，由于被破壞的只是染色體中靶基因的某一個(gè)或幾個(gè)外顯子而不是該基因的整個(gè)編碼區(qū)，殘留的編碼序列有可能獲得新的未知的功能，這將給表型分析帶來(lái)麻煩基因敲除過程中大規(guī)模的染色體片段刪除導(dǎo)致其它基因的編碼區(qū)