蛋白質(zhì)的分離純化課件

蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)的兩性電離

蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(isoelectricpoint,pI)

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時(shí)，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時(shí)溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)

蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至100萬之巨，其分子的直徑可達(dá)1～100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。*蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素顆粒表面電荷水化膜+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)水化膜++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質(zhì)的聚沉蛋白質(zhì)的紫外吸收

由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質(zhì)的OD280與其濃度呈正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測定。蛋白質(zhì)的分離純化方法

透析(dialysis)

利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。幾種重要的蛋白質(zhì)電泳SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS）：常用于蛋白質(zhì)分子量的測定。等電聚焦電泳（isoelectricfocusing，IEF）通過蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。pH梯度以兩性電解質(zhì)ampholyte（脂肪族多胺和多羧同系物）在外電場作用下自然形成。

雙向凝膠電泳two-dimensionalelectrophoresis

層析(chromatography)

原理待分離蛋白質(zhì)溶液（流動相）經(jīng)過一個(gè)固態(tài)物質(zhì)（固定相）時(shí)，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。層析的主要設(shè)備常見色譜柱自動分步收集器離子交換層析ionexchangechromatography

離子交換層析法是利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進(jìn)行分離。電荷不同的蛋白質(zhì)，對管柱上的離子交換劑有不同的親和力，改變沖洗液的離子強(qiáng)度和pH值，物質(zhì)就能依次從層析柱中分離出來。

離子交換層析法大致分為5個(gè)步驟

離子擴(kuò)散到樹脂表面

離子通過樹脂擴(kuò)散到交換位置

在交換位置進(jìn)行離子交換；被交換的分子所帶電荷愈多，它與樹脂的結(jié)合愈緊密，也就愈不容易被其它離子取代

被交換的離子擴(kuò)散到樹脂表面

沖洗液通過，被交換的離子擴(kuò)散到外部溶液中

離子交換層析的原理凝膠過濾(gelfiltration)凝膠過濾色譜亦稱凝膠色譜、排阻色譜或分子篩，是利用凝膠把分子大小不同的物質(zhì)分離開的一種方法。凝膠色譜的機(jī)理是分子篩效應(yīng)，凝膠顆粒在合適的溶劑中浸泡，充分吸脹后裝入色譜柱內(nèi)，加入欲分離的混合物后，再以同一溶劑洗脫。在洗脫過程中，大分子不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部，而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外；而小分子可以進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，路徑長、流速慢，以至最后流出柱外。因此，混合樣品如同“過篩”一樣，因分子大小的不同得以彼此分開。

凝膠過濾的作用機(jī)制

凝膠過濾的過程超速離心

超速離心法(ultracentrifuga