細(xì)胞工程 第五章 生物制品生產(chǎn)

第五章生物制品消費(fèi)1主要內(nèi)容第一節(jié)細(xì)胞大規(guī)模培育第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞制藥第三節(jié)植物次生代謝產(chǎn)物的消費(fèi)2第一節(jié)細(xì)胞大規(guī)模培育大規(guī)模培育技術(shù)是建立在實(shí)驗(yàn)室培育方法〔貼壁培育法和懸浮培育法〕的根底上，再利用固定化細(xì)胞、人工灌注、生物反響器技術(shù)等技術(shù)開展起來的。

一、細(xì)胞培育的操作方式二、大規(guī)模細(xì)胞培育系統(tǒng)3一、細(xì)胞培育的操作方式培育方式分為：分批式流加式培育半延續(xù)式延續(xù)灌注式41、分批式培育指先將細(xì)胞和培育液一次性裝入反響器內(nèi)進(jìn)展培育，細(xì)胞不斷生長，產(chǎn)物不斷構(gòu)成，經(jīng)一段時(shí)間后，終止培育。5分批式培育特點(diǎn)①系統(tǒng)密閉，只允許氣體和揮發(fā)性代謝物質(zhì)與外界交換。②培育基體積固定，當(dāng)主要營養(yǎng)物質(zhì)耗盡時(shí)，細(xì)胞即停頓生長，又稱為分批培育或間歇培育，多在3-5d/批。③細(xì)胞數(shù)目、總分量、DNA含量呈“S〞形(五個(gè)時(shí)期)變化。④為保證細(xì)胞不斷增殖，須在到達(dá)最大分量時(shí)取出1/5～1/3的培育液，轉(zhuǎn)移繼代培育。⑤是傳統(tǒng)的、常用的方法，可直接放大。其工業(yè)反響器規(guī)模可達(dá)12000L。672、半延續(xù)式〔流加式〕培育

指在分批式培育的根底上，將分批培育的培育液部分取出，并補(bǔ)充參與等量的新穎培育基，使反響器內(nèi)培育液的總體積堅(jiān)持不變。83、流加式培育在分批式操作的根底上，在培育過程中根據(jù)細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的不斷耗費(fèi)和需求，流加濃縮的營養(yǎng)物或培育基，從而使細(xì)胞繼續(xù)生長至較高的密度，目的產(chǎn)品到達(dá)較高的程度。由于流加式培育能控制更多的環(huán)境參數(shù)，使得細(xì)胞生長和產(chǎn)物生成容易維持在優(yōu)化形狀，是當(dāng)前動(dòng)物細(xì)胞培育工藝中占有主流優(yōu)勢的培育工藝。94、延續(xù)灌注式培育是把細(xì)胞接種后進(jìn)展培育，新穎的培育液不斷從反響器一頭參與，從另一頭不斷取出等量的培育液，細(xì)胞仍留在反響器內(nèi)，使細(xì)胞處于一種營養(yǎng)不斷供應(yīng)形狀。使反響條件處于一種恒定形狀。10延續(xù)灌注式培育特點(diǎn)1〕不斷參與新培育基，保證了營養(yǎng)物質(zhì)的充分供應(yīng)。2〕培育期細(xì)胞增殖速度快，細(xì)胞生長速率長久地堅(jiān)持在對數(shù)生長期，構(gòu)成一個(gè)穩(wěn)定的培育形狀。3〕適用于細(xì)胞大規(guī)模工業(yè)化培育。4〕由于延續(xù)培育需求的設(shè)備比較復(fù)雜，投入較大，且要維持細(xì)胞無菌形狀，技術(shù)條件要求苛刻，因此未得到廣泛運(yùn)用。1112開放式延續(xù)培育----細(xì)胞隨排出培育液一同流出且速度恒定。在穩(wěn)定形狀下流出細(xì)胞的速率等于培育系統(tǒng)中新細(xì)胞的增長速率。封鎖式延續(xù)培育----新穎培育液和老培育液以等量方式進(jìn)出，而搜集的細(xì)胞重新放入原培育系統(tǒng)中繼續(xù)培育，故培育系統(tǒng)中細(xì)胞數(shù)量是在不斷添加的。1314二、大規(guī)模細(xì)胞培育方法按供養(yǎng)方式分為三種：攪拌式、氣升式、旋轉(zhuǎn)式按細(xì)胞固定分為四種：懸浮培育、微載體培育、微囊化培育、微導(dǎo)管培育〔中空纖維培育〕。15機(jī)械攪拌式(Spinner)機(jī)械攪拌式主要是經(jīng)過不銹鋼攪拌系統(tǒng)使培育物的混勻。在罐體頂端有一些傳感器，監(jiān)測培育物的溫度、pH值、溶氧度(DO)、葡萄糖耗費(fèi)、NH3、NH4+等參數(shù)。這種反響器培育規(guī)?？蛇_(dá)2000L。16該系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)：〔1〕設(shè)計(jì)簡單，操作方便，易于放大消費(fèi)；〔2〕細(xì)胞密度高，到達(dá)107/mL以上；〔3〕便于無菌操作，不易污染；〔4〕氧的轉(zhuǎn)換率高，能滿足細(xì)胞在生長時(shí)所需的要求。缺陷：對細(xì)胞損傷較大，產(chǎn)物含量不高。17氣升攪拌式氣體從罐底的放射管進(jìn)入反響器的導(dǎo)流管。湍流溫暖而均勻，循環(huán)量大，細(xì)胞與培育液混合均勻。剪切力小，細(xì)胞的損傷小。放射供氧，氧傳送速率高，供氧良好。適用于懸浮細(xì)胞分批培育、微載體和延續(xù)培育。18任務(wù)原理反響器運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)，圓筒以30-60r/min的速度轉(zhuǎn)動(dòng)，由于離心力的作用，攪拌器中心管內(nèi)產(chǎn)生負(fù)壓，使攪拌器外培育基流入中心管，沿管螺旋上升，再從導(dǎo)流筒口排出，從攪拌器外沿下降，構(gòu)成循環(huán)流動(dòng)。在氣腔內(nèi)氣體由分布管鼓泡，氣體溶于液體中，依托氣腔絲網(wǎng)外液體的循環(huán)流動(dòng)及分散作用，使溶于液體中的氣體成分均勻地分布到反響器內(nèi)。19Celltech公司采用氣升式反響器培育雜交瘤細(xì)胞，消費(fèi)單克隆抗體。消費(fèi)周期為14~400h。從10L逐級放大到10000L。17d消費(fèi)抗體100g，抗體合成大多數(shù)處于穩(wěn)定期和衰退期，比傳統(tǒng)搖瓶提高約5倍。20通氣攪拌式細(xì)胞培育反響器212223旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培育系統(tǒng)20世紀(jì)90年代中期，美國宇航局開發(fā)一系列旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培育系統(tǒng)(Therotarycellculturesystem,RCCS)，又叫回轉(zhuǎn)式生物反響器(Rotatingwallvesselbiore-actor,RWVB)。RCCS是繞程度軸旋轉(zhuǎn)、無氣泡、膜分散式氣體交換的培育系統(tǒng)。24該反響器是將細(xì)胞種植到微載體后，將其移入RCCS圓柱狀的培育容器內(nèi)，加滿培育液。整個(gè)容器由電機(jī)驅(qū)動(dòng)沿程度軸旋轉(zhuǎn)，細(xì)胞微載體顆粒在程度軸內(nèi)建立均質(zhì)的液體懸浮軌道，并隨容器一同旋轉(zhuǎn)且不與容器壁和其它物體相撞。細(xì)胞經(jīng)過膜式氣體交換器來吸氧和排出CO2。由于系統(tǒng)無推進(jìn)器、氣泡或攪拌器,使破壞性應(yīng)力減到最小。因此，細(xì)胞可以在相對溫暖的環(huán)境中進(jìn)展三維生長，得到類似人體內(nèi)的培育產(chǎn)物.近年來曾經(jīng)廣泛運(yùn)用于微載體系統(tǒng)，至今已有近百種組織細(xì)胞均在該系統(tǒng)內(nèi)勝利進(jìn)展了大規(guī)模擴(kuò)增。2526懸浮培育與微生物的肉湯培育根本一樣。懸浮培育細(xì)胞增殖快、產(chǎn)量高，沒有接觸抑制特性，是動(dòng)物大規(guī)模培育的理想方法。但只需極少數(shù)動(dòng)物細(xì)胞適宜進(jìn)展懸浮培育，適用于確立細(xì)胞株〔系〕、雜交瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、血液和淋巴細(xì)胞培育。27微載體培育微載體為三維培育系統(tǒng)，細(xì)胞貼附于微載體上伸展和增殖，微載體懸浮于培育液中。微載體培育具貼壁和懸浮培育的雙重優(yōu)點(diǎn)，有很大的比外表積，供單層細(xì)胞貼附和增殖。懸浮微球使細(xì)胞生長的環(huán)境均一，培育基利用率高，反復(fù)性好，容易放大。20世紀(jì)80年代正式用于工業(yè)化消費(fèi)干擾素、疫苗和尿激酶原等。28理想的微載體所具備的性能：質(zhì)地柔軟，微球間摩擦輕；耐高溫，可高壓滅菌；透明性，便于察看細(xì)胞生長；細(xì)胞相容性，利于貼附和生長；無毒性和惰性，對細(xì)胞無毒害，不產(chǎn)生有害物質(zhì)，不吸附培育基；低速即懸浮，靜止即沉降，便于換液和收獲；微粒大小均勻；可回收反復(fù)運(yùn)用。29為了提高貼壁才干，對基質(zhì)外表進(jìn)展包埋，如血清蛋白、多聚賴氨酸處置，可加速貼壁過程。懸浮培育早期，還可向培育液補(bǔ)充丙酮酸、腺嘌呤、次黃嘌呤、胸腺嘧啶等。將這些微載體懸浮在培育液中，大大添加細(xì)胞的貼壁面積，可使每毫升培育基到達(dá)1000萬個(gè)〔108〕細(xì)胞的密度。30常用微載體玻璃珠：直徑約2～3μm，密度1.5g/cm3。在玻璃外表覆蓋塑料或中空玻璃也可到達(dá)此密度。葡聚糖微載體：帶正電，干粉在pH7.2的磷酸鹽緩沖液中吸脹，清洗滅菌后運(yùn)用。Cytodex2：電荷性大大下降，吸附才干很低，適宜于蛋白質(zhì)藥物的消費(fèi)。纖維素微載體DE52和DE53：適宜多種細(xì)胞培育。聚丙烯酰胺載體：貼壁較快，親水性。31多孔微載體：直徑0.2～5mm，孔徑20～300μm，達(dá)占總體積的85%，極大地添加了比外表積，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的固定化，到達(dá)高密度培育。廣泛運(yùn)用的有：Cellsnow、Cytocell〔纖維素基質(zhì)〕、Verax、Cultisphere〔膠原〕、Cytoline1和2〔聚苯乙烯〕、ImmobaSil〔硅橡膠〕及Siran〔玻璃〕等。主要用于攪拌、固定床和流化床反響器。3233微囊化培育利用固定化細(xì)胞技術(shù)，將一定量細(xì)胞與約4％的褐藻酸鈉混合后，滴到CaCl2溶液中，構(gòu)成半透性微膠囊。又稱固定化細(xì)胞、大載體培育法。341〕細(xì)胞在微膠囊內(nèi)生長，既吸收外界營養(yǎng)，又可排出本身代謝物。2〕細(xì)胞所受的剪切力損傷小，細(xì)胞生長良好，純度提高。便于延續(xù)培育，提高培育細(xì)胞的利用率；3〕細(xì)胞培育密度高，生長緩慢，有利于次生代謝產(chǎn)物的積累，提高產(chǎn)量。354〕次生代謝物直接分泌到培育液中，可簡化分別、收獲步驟，提高任務(wù)效率。如次生代謝物不分泌，培育終了后，收獲微囊，破微囊，純化抗體。5〕固定化細(xì)胞的氧氣、營養(yǎng)供應(yīng)與傳送及細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性等問題有待于進(jìn)一步研討處理。這種培育方法是消費(fèi)單克隆抗體、干擾素的一種有效培育方法。目前，美國藥用產(chǎn)品大規(guī)模消費(fèi)常用此法進(jìn)展。363738中空纖維〔微導(dǎo)管〕培育是模擬體內(nèi)細(xì)胞三維生長環(huán)境而發(fā)明的。將由硝酸纖維素或醋酸纖維素構(gòu)成外徑不超越1mm〔φ≤1mm〕的微導(dǎo)管平鋪成層，相當(dāng)于體內(nèi)的毛細(xì)血管。微導(dǎo)管外表貼壁生長細(xì)胞，管內(nèi)通無菌空氣，管外浸泡在培育液中，氣體、水分及其它營養(yǎng)物質(zhì)可以經(jīng)過微導(dǎo)管與細(xì)胞進(jìn)展交換。微導(dǎo)管外表的細(xì)胞密度可達(dá)100萬/cm2個(gè)。細(xì)胞密度可達(dá)108/mL。39接種孔水套層產(chǎn)物出口培育基入口產(chǎn)物出口培育基入口內(nèi)膜外膜腔室細(xì)胞培育基分散后,灌入床層。纖維管壁薄，半透膜，截留不同分子量。纖維管的空腔組成的內(nèi)室：灌流含氧氣的培育基纖維管之間的空間組成的外室：細(xì)胞生長。40細(xì)胞分泌的產(chǎn)物和血清中的成分由于分子量較大而無法進(jìn)入內(nèi)室，產(chǎn)物只能在外室積累和濃縮。細(xì)胞代謝的廢物是小分子物質(zhì)，可浸透進(jìn)入內(nèi)室，從內(nèi)腔開口排出，防止了對細(xì)胞的毒性。在收獲時(shí)，翻開纖維管之間的外室開口，產(chǎn)物就流出來。此時(shí)雖然細(xì)胞停頓分裂，但細(xì)胞的存活、安康和核形狀不變，代謝和分化功能仍可堅(jiān)持?jǐn)?shù)月。41第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞生物制藥用動(dòng)物細(xì)胞的培育技術(shù)來消費(fèi)有功能的蛋白質(zhì)，特別是人源細(xì)胞的培育，在藥物消費(fèi)中的位置越來越重要。一、表達(dá)蛋白的宿主系統(tǒng)二、消費(fèi)用動(dòng)物細(xì)胞的要求三、常用動(dòng)物細(xì)胞的特性四、基因工程細(xì)胞構(gòu)建和挑選五、細(xì)胞庫的建立42常見的動(dòng)物細(xì)胞培育產(chǎn)物疫苗小兒麻痹癥疫苗、狂犬疫苗、腦炎疫苗、皰疹疫苗、風(fēng)疹疫苗單克隆抗體IgG、IgM、IgA等免疫調(diào)節(jié)劑細(xì)胞生長因子、干擾素、白細(xì)胞活化因子、胸腺肽酶胰蛋白酶、尿激酶、膠原酶、胃蛋白酶激素生長激素、促紅細(xì)胞生成素43基因工程藥物消費(fèi)表示圖44一、表達(dá)目的蛋白的宿主系統(tǒng)總體分為：原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)。常見的宿主系統(tǒng)細(xì)菌、酵母、霉菌、絲狀真菌、植物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。45原核表達(dá)系統(tǒng)----細(xì)菌特點(diǎn)：繁衍快、易于培育，限制：表達(dá)的蛋白質(zhì)缺乏轉(zhuǎn)錄后的修飾；原核系統(tǒng)表達(dá)的蛋白普通為胞內(nèi)產(chǎn)物，需求破碎細(xì)胞提取產(chǎn)物，給產(chǎn)物的分別純化帶來困難；還易受外源毒素的污染。46真核表達(dá)系統(tǒng)特點(diǎn)表達(dá)后的蛋白有修飾作用，與人體本身分泌的天然蛋白非常近似；動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的蛋白都是胞外分泌，產(chǎn)物的分別純化過程非常簡單。但是，動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培育比較復(fù)雜，目前仍處于開展完善階段。47表達(dá)系統(tǒng)的選擇原核表達(dá)系統(tǒng)：普通“小分子、構(gòu)造簡單〞的蛋白消費(fèi)，且蛋白轉(zhuǎn)錄后無需修飾，如胰島素；真核表達(dá)系統(tǒng)：主要“消費(fèi)大分子、構(gòu)造復(fù)雜的蛋白〞，并且轉(zhuǎn)錄后的修飾對蛋白的生物活性具有重要影響，如組織型纖溶酶原激活劑(tPA〕、促紅細(xì)胞生成素等〔EPO〕等。對既可用原核、可用真核表達(dá)的蛋白如α-干擾素、人生長激素等，應(yīng)綜合調(diào)查消費(fèi)的經(jīng)濟(jì)本錢和技術(shù)難易程度等選擇表達(dá)系統(tǒng)。48口蹄疫疫苗消費(fèi)表示圖49過去運(yùn)用動(dòng)物消費(fèi)的生物制品，經(jīng)常發(fā)生過敏反響或病原體傳染事件。如脊髓灰質(zhì)炎疫苗能夠被猿猴腎病毒污染；用人血制備的某些生物制品能夠被肝炎或艾滋病病毒污染。采用細(xì)胞工程消費(fèi)的產(chǎn)品能將致病要素降到最?。簞?dòng)物細(xì)胞培育所用的細(xì)胞背景明確，經(jīng)過嚴(yán)厲的平安檢測，消除了污染病原體的危險(xiǎn)。50實(shí)例EPO的消費(fèi)：以前需求從2500L再生妨礙性貧血病人的尿液中才干提取極微量的EPO用于實(shí)驗(yàn)室分析。如今，經(jīng)過大規(guī)模培育基因工程細(xì)胞消費(fèi)的EPO，曾經(jīng)治療了成千上萬的腎性貧血的病人。胰島素的消費(fèi)：過去從豬胰腺中提取胰島素，但某些患者會引起抗原抗體反響?；蚬こ炭梢杂萌艘葝u素基因消費(fèi)人源化蛋白，抑制免疫反響的缺陷。51動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的缺乏細(xì)胞生長緩慢，消費(fèi)效率較低，產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他表達(dá)系統(tǒng)。如骨髓細(xì)胞MPG-11消費(fèi)IgG，每個(gè)細(xì)胞1分鐘為5pg，10L反響器，細(xì)胞密度為107/mL，消費(fèi)才干不到1g/d。延續(xù)細(xì)胞系添加了生長和代謝速率，但同時(shí)導(dǎo)致了副產(chǎn)物的添加。52動(dòng)物細(xì)胞對培育條件要求苛刻和敏感，對溫度、pH、浸透壓、剪切力等忍受才干差。需求添加氨基酸、維生素、血清、生長因子等，培育基要求高，消費(fèi)費(fèi)用較高。53原代細(xì)胞二倍體細(xì)胞系轉(zhuǎn)化細(xì)胞系二、消費(fèi)用動(dòng)物細(xì)胞的要求54⒈原代細(xì)胞直接取自動(dòng)物組織器官，經(jīng)過粉碎消化而獲得的細(xì)胞懸液〔109/g〕。需求大量動(dòng)物，費(fèi)錢費(fèi)勞力。細(xì)胞質(zhì)量不穩(wěn)定。常用雞胚細(xì)胞、原代兔腎細(xì)胞、鼠腎細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等。552.二倍體細(xì)胞系原代細(xì)胞經(jīng)過傳代、挑選克隆，從多種細(xì)胞成分中，挑選并純化出具有一定特征的某種細(xì)胞株。特點(diǎn)①正常細(xì)胞的染色體2n核型；②貼壁依賴接觸抑制；③可傳代培育50代；④無致瘤性。563.轉(zhuǎn)化細(xì)胞系經(jīng)過某個(gè)轉(zhuǎn)化過程構(gòu)成的，常由于染色體斷裂變成異倍體，失去正常細(xì)胞特點(diǎn)，而獲得無限增殖才干。轉(zhuǎn)化過程可以是自發(fā)的、人工的、或從腫瘤組織中產(chǎn)生。57三、常用動(dòng)物細(xì)胞的特性W1-38人胚胎肺組織二倍體成纖維細(xì)胞系。核型為2n=46。貼壁生長，能產(chǎn)生膠原，同工酶為G6PD-B型。培育基用EBM加10%小牛血清，pH7.2。倍增時(shí)間為24h，有限壽命50代。對很多病毒敏感，第一個(gè)被用于制備疫苗，目前廣泛運(yùn)用。58MRC-5正常男性肺組織中獲得的人二倍體成纖維細(xì)胞系。核型為2n=46。培育基需加小牛血清。有限壽命42～46代。增殖速度較W1-38快，對不良環(huán)境敏感性較W1-38低。對人的病毒敏感。用于消費(fèi)疫苗。59Namalwa從患有淋巴瘤病的肯尼亞人獲取，建成人的類淋巴母細(xì)胞系。非整體核型，12～14條標(biāo)志染色體，單條X，無Y。外源基因表達(dá)程度較高，培育基為RPMI1640+7%胎牛血清?？捎脽o血清培育基高密度培育。懸浮生長，表達(dá)IgM。英國Wellcome公司用Namalwa細(xì)胞大規(guī)模消費(fèi)α干擾素，反響器達(dá)8000L。用該細(xì)胞消費(fèi)rhEPO、rhG-CSF、tPA等。60CHO-K1從中國地鼠卵巢中分別的上皮樣細(xì)胞。核型2n=20～22。貼壁生長，也可進(jìn)展懸浮培育，對剪切力和浸透壓有較高的忍受才干。培育基為：DEME+0.1mmol/L次黃嘌呤+0.1mmol/L胸苷+10%小牛血清+脯氨酸。分泌表達(dá)外源蛋白，蛋白質(zhì)翻譯后的修飾準(zhǔn)確，表達(dá)產(chǎn)物的構(gòu)造、性質(zhì)和生物活性接近天然。運(yùn)用氨甲酰喋呤可添加外源基因的拷貝數(shù)，提高蛋白質(zhì)表達(dá)程度。是目前運(yùn)用最為普遍和成熟的表達(dá)糖基化蛋白藥物的宿主細(xì)胞。61BHK-21從1日齡地鼠幼鼠腎臟中分別的成纖維樣細(xì)胞，核型為2n=44。培育基為DMEM+7%胎牛血清。用于增殖病毒、制備疫苗和重組蛋白?，F(xiàn)已用于工程細(xì)胞構(gòu)建。62Vero從正常成年非洲綠猴腎臟分別的上皮細(xì)胞，貼壁生長，核型2n=60。能順應(yīng)灌流操作，進(jìn)展延續(xù)培育。培育基：M199+5%胎牛血清。已有突變系能用無血清培育。常用VeroE6增殖多種病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病毒、乙腦病毒等，消費(fèi)病毒性疫苗，已被同意用于人體。也可作為轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，用于表達(dá)外源基因的蛋白質(zhì)藥物和病毒的檢測。63SP2/0-Ag14經(jīng)過交融的方法分別獲得。培育基為DMEM+10%胎牛血清。能耐受8氮鳥嘌呤20μg/mL，但在HAT選擇培育基中不能存活。通常用于消費(fèi)單克隆抗體。64C127：從小鼠乳腺瘤分別的上皮樣細(xì)胞。貼壁生長。表達(dá)多種外源基因，其中EPO的程度達(dá)10mg/L，消費(fèi)rhGH已被同意上市。3T3：HINSwiss小鼠胚胎培育中分別的細(xì)胞系。能大量表達(dá)外源蛋白，廣泛用于藥物毒理學(xué)研討。COS：從SV40DNA轉(zhuǎn)化的非洲綠猴腎細(xì)胞CV1中分別得到的，廣泛用于外源基因瞬時(shí)表達(dá)的研討。GH3：用于生長激素研討，293：用于基因治療的研討。65昆蟲細(xì)胞株系Sf-9從秋粘蟲的卵巢細(xì)胞〔SF21〕中分別得到的，是最常用的昆蟲表達(dá)細(xì)胞。通常用Grace培育基+3.3g/L水解乳蛋白+3.3g/L酵母浸液+10%胎牛血清?？箼C(jī)械剪切，能在無血清培育基的攪拌反響器中生長。對苜宿尺蠖核型多角體病毒和其它桿狀病毒高度敏感。生長快，能高效表達(dá)外源基因。用于高效表達(dá)外來蛋白制品。66其他Sf21：從秋粘蟲卵巢細(xì)胞中分別得到，細(xì)胞較大，容易放大，高效表達(dá)外源基因。TN-5B1-4：從粉紋夜蛾卵細(xì)胞中分別得到的。無血清培育，快速倍增。分泌表達(dá)重組蛋白的才干比Sf9細(xì)胞系高20多倍，能順應(yīng)懸浮培育。67四、基因工程細(xì)胞構(gòu)建和挑選在消費(fèi)中采用更多、更有前景的是交融細(xì)胞及各種基因工程細(xì)胞。被用于構(gòu)建工程細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞有：CHO-dhfr、BHK-21、Namalwa、Vero、SP2/0、Sf-9等細(xì)胞。681.真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建運(yùn)用的載體有兩類：病毒載體--牛痘病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體--69病毒作為載體的優(yōu)點(diǎn)：①雙鏈DNA，易重組；②插入7～8kbDNA不影響正常病毒粒子的構(gòu)成③多角體蛋白和病毒粒子的構(gòu)成無直接關(guān)系。因此，用外源基因改換多角體蛋白基因，仍能構(gòu)成有感染力病毒粒子；70④多角體蛋白基因有非常強(qiáng)的啟動(dòng)子，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可占全部蛋白質(zhì)的20%～30%；⑤用光學(xué)顯微鏡可看到多角體，可以此作為標(biāo)志物，選陽性克隆。⑥如家蠶桿狀病毒，可在蠶體表達(dá)外源基因。71質(zhì)粒載體與微生物的質(zhì)粒載體類似，普通是穿越質(zhì)粒，具有兩個(gè)復(fù)制子和抗性挑選標(biāo)志基因。大腸桿菌的復(fù)制子，細(xì)菌中繁衍?？股乜剐詷?biāo)志，原核細(xì)胞挑選。動(dòng)物細(xì)胞復(fù)制子，在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。還有絲狀噬菌體復(fù)制子。72在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞體內(nèi)都能擴(kuò)增，含有如下根本成分：①允許載體在細(xì)菌體內(nèi)擴(kuò)增的質(zhì)粒序列。②含有使基因表達(dá)的調(diào)控元件。③能用以挑選出外源基因已整合的選擇標(biāo)志。④有時(shí)還帶有選擇性添加拷貝數(shù)的擴(kuò)增系統(tǒng)。73⒉基因的導(dǎo)入和高效表達(dá)細(xì)胞株挑選74基因載體導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞常用的方法磷酸鈣沉淀法電穿孔法磷酸鈣沉淀法溶解的DNA加Na2HPO4和CaCl2構(gòu)成磷酸鈣沉淀，DNA被包在磷酸鈣沉淀中，構(gòu)成DNA-磷酸鈣共沉淀物，當(dāng)和細(xì)胞外表接觸時(shí)，那么經(jīng)過細(xì)胞吞噬作用而將DNA導(dǎo)入。電穿孔法借助電穿孔儀的高壓脈沖電場，使細(xì)胞膜出現(xiàn)瞬時(shí)可逆性小孔，外源DNA沿小孔進(jìn)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)化率較高，拷貝數(shù)低。75化學(xué)轉(zhuǎn)染是最常用的轉(zhuǎn)染方法。浸透性休克和DMSO等化學(xué)試劑能促進(jìn)DNA進(jìn)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)染試劑盒已有商業(yè)化供應(yīng)，特別是脂質(zhì)體資料的轉(zhuǎn)染試劑。影響要素細(xì)胞培育物的密度、DNA的大小、純度與用量、化學(xué)試劑的用量與處置時(shí)間、促進(jìn)劑的運(yùn)用等。76轉(zhuǎn)染體挑選與分別轉(zhuǎn)染后1～6天收獲細(xì)胞，進(jìn)展核酸分子雜交或蛋白質(zhì)雜交，檢測外源基因的瞬時(shí)表達(dá)。為了獲得穩(wěn)定整合的細(xì)胞系，先在非選擇性培育基上培育24～48小時(shí)，讓細(xì)胞倍增1～2代，使轉(zhuǎn)染DNA表達(dá)。再按1：15比例轉(zhuǎn)移到選擇性培育基上，每2～4天改換培育基，繼續(xù)2～3周，促進(jìn)抗性細(xì)胞生長，去除死細(xì)胞殘骸，最后得到獨(dú)立的克隆。在轉(zhuǎn)染中大約有萬分之一的細(xì)胞將穩(wěn)定整合外源基因，因此需求運(yùn)用與之相對應(yīng)的顯性選擇標(biāo)志來分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞。77五、細(xì)胞庫的建立必需建立兩個(gè)細(xì)胞庫⒈原始細(xì)胞庫

⒉消費(fèi)用細(xì)胞庫78原始細(xì)胞庫存有該細(xì)胞的詳細(xì)擋案，包括：①該細(xì)胞系的歷史②該細(xì)胞系的特性③對各種有害因子的檢查結(jié)果79消費(fèi)用細(xì)胞庫從原始細(xì)胞庫來的，或從單一安瓶來，或從多個(gè)安瓶來即刻混合，經(jīng)培育擴(kuò)增再分裝儲存構(gòu)成消費(fèi)細(xì)胞庫。需建立檔案，進(jìn)展無菌、無細(xì)胞交叉污染的檢查。需確定最高運(yùn)用的傳代次數(shù)。80第三節(jié)植物次生代謝產(chǎn)物的消費(fèi)隨著植物細(xì)胞懸浮培育技術(shù)的開展及各種新型生物反響器的出現(xiàn)，植物細(xì)胞能像微生物細(xì)胞那樣在發(fā)酵罐中大量延續(xù)培育，產(chǎn)生相當(dāng)于幾倍或幾十倍該完好植株所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物。植物細(xì)胞培育的產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、化工、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域得到了廣泛運(yùn)用。如：人參愈傷組織在培育基中培育數(shù)周，所含粗皂苷的含量可達(dá)19.3%，而天然人參根中含量僅為4.1%。81一、次生代謝產(chǎn)物二、培育條件下次消費(fèi)物積累的特性三、提高細(xì)胞次消費(fèi)物產(chǎn)量的途徑四、培育技術(shù)的選擇五、植物細(xì)胞培育的運(yùn)用82一、次生代謝產(chǎn)物次生代謝產(chǎn)物是代謝的最終產(chǎn)物，并非普通生命活動(dòng)所必需的產(chǎn)物。多是一類小分子有機(jī)化合物，如黃酮、色素、毒素、抗生素、生長素、生物堿等。次生代謝產(chǎn)物分布具有種、屬、器官、組織以及發(fā)育階段的特異性，也就是說不同植物類型或同一植物不同生長階段及組織部位產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物及產(chǎn)量是不同的。83主要分為三類萜類、酚類、含氮次級化合物。84酚類--黃酮類、醌類和簡單酚類黃酮類構(gòu)造：C6-C3-C6生物合成前體：苯丙氨酸和丙二酸單酰輔酶A效果：治療心血管和高血壓的藥物成分。醌類化合物構(gòu)造：由苯式多環(huán)芳烴衍生的芳香二氧化合種類：苯醌、萘醌。效果：呈現(xiàn)顏色，具有抗菌、抗癌作用。85簡單酚類構(gòu)造：苯丙酸類、苯丙酸內(nèi)酯和苯甲酸衍生物分布：廣泛分布于維管植物。功能：許多是植物防御食草昆蟲和真菌侵襲的維護(hù)劑。常用的藥物有：綠原酸、姜酚、肉桂醛等。86萜類化合物單萜和倍半萜是植物揮發(fā)油和香料的主要成分，有的具有重要的藥用價(jià)值。萜類化合物已超越2萬種。倍半萜：抗瘧疾藥物青蒿素。二萜生物堿：抗癌藥物紫杉醇。三萜皂甙：人參皂甙。甾體皂甙：薯蕷皂甙。87含氮化合物包括：生物堿、胺類、非蛋白質(zhì)氨基酸和生氰苷合成：從普通的氨基酸合成的。分布：雙子葉植物種類：主要有生物堿、含氰苷、芥子油苷和非蛋白、氨基酸等，有5500種以上。88二、次消費(fèi)物積累的特性生長偶聯(lián)型----產(chǎn)物合成與細(xì)胞生長成正比。如長春花堿的合成、煙草中煙堿合成。中間型----產(chǎn)物僅在細(xì)胞生長下降時(shí)合成，細(xì)胞在指數(shù)生長期或停頓期產(chǎn)物都不合成。如蒽醌類物質(zhì)、莨菪烷類的合成等。非生長偶聯(lián)型----產(chǎn)物合成在細(xì)胞生長停頓以后。如紫草寧。89三、提高細(xì)胞次消費(fèi)物產(chǎn)量的途徑選擇適宜的起始資料－－種類、部位梔子胚軸銀杏 子葉當(dāng)歸 根紅豆杉幼嫩的莖茜草葉柄培育基既要滿足植物細(xì)胞的生物量增長，還要滿足細(xì)胞合成及積累次消費(fèi)物的需求。90前體〔precursor〕的運(yùn)用主要是提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。對某一目的產(chǎn)物來講，能夠有多種前體物質(zhì)。同一種前體物質(zhì)又能夠有多條代謝途徑，從而構(gòu)成不同的代謝產(chǎn)物。針對其合成的關(guān)鍵生化過程進(jìn)展前體物質(zhì)添加。多數(shù)前體物質(zhì)對細(xì)胞生長并不非常有利，能夠有前體濃度過量產(chǎn)生的反響抑制。91激發(fā)子〔elicitor〕的運(yùn)用是指可以誘導(dǎo)植物細(xì)胞中某些反響，并構(gòu)成細(xì)胞特征性本身反響的分子，也稱誘導(dǎo)子。非生物激發(fā)子----如輻射、金屬離子、茉莉酸類似物〔茉莉酸甲酯，M-JA〕等。生物激發(fā)子外源激發(fā)子：菌絲、微生物機(jī)體提取物及微生物產(chǎn)生的多糖、蛋白和脂肪酸等。內(nèi)源性激發(fā)子：來源于植物構(gòu)造化合物。如降解細(xì)胞壁的酶、細(xì)胞壁碎片、寡聚糖等有機(jī)分子。92激發(fā)子促進(jìn)次消費(fèi)物積累激發(fā)子對南方紅豆杉細(xì)胞培育合成紫杉醇的影響激發(fā)子適宜濃度（mM）與對照比提高產(chǎn)物效率（倍）M-JA0.17.0花生四烯酸0.16.5硝酸柿胺1.05.5水楊酸0.14.5硝酸鹽0.013.093四、培育技術(shù)的選擇包括反響器的選擇和培育方式的選擇。培育技術(shù)的選擇不僅要思索細(xì)胞生長和產(chǎn)物積累的效率，同時(shí)還應(yīng)思索技術(shù)根底和消費(fèi)本錢。如兩相培育技術(shù)。培育方式可采用兩步培育，即在生長培育基中培育細(xì)胞，在消費(fèi)培育基中積累產(chǎn)物。94兩相培育技術(shù)指在植物細(xì)胞培育體系中參與水溶性或脂溶性的有機(jī)化合物，或者是具有吸附作用的多聚化合物，使培育體系由于分配系數(shù)不同而構(gòu)成上、下兩相，細(xì)胞在其中一相中生長并合成次生代謝物，而這些次生代謝物又經(jīng)過自動(dòng)或被動(dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞结尫诺桨?，被另一相所吸附?5特點(diǎn)可及時(shí)分別次生代謝物，減少負(fù)反響抑制，提高次生代謝產(chǎn)物含量，而且有機(jī)相可循環(huán)運(yùn)用，根本實(shí)現(xiàn)了植物組織的延續(xù)培育。迄今為止，已有18種植物細(xì)胞運(yùn)用此項(xiàng)技術(shù)獲得勝利。例如添加十六烷提取紫草素，可使產(chǎn)量提高7倍多；添加十六烷可使孔雀草發(fā)根培育的噻吩分泌量由原來的1％提高至70％。96舉例兩相培育紅豆杉細(xì)胞消費(fèi)紫杉醇紫杉醇為抗癌藥，價(jià)99%純度的1500元/g，35%的元/g。第一相：B5培育基第二相：5％(v/v)的松油醇產(chǎn)物釋放劑：5％(v/v)二甲基亞砜。10g(鮮重)/100mL培育基/250mL三角燒瓶。25℃，120rpm，黑暗培育。97毛狀根培育技術(shù)發(fā)根土壤桿菌的Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)移并整合到雙子葉植物基因組中誘導(dǎo)出毛狀根。其生長迅速，分支多，且具有器官化的特征，遺傳性、生理生化特征穩(wěn)定，具有更強(qiáng)的次生代謝物合成才干，可建立培育系統(tǒng)。毛狀根具有很強(qiáng)的繁衍才干，可以制成人工種子長期保管。98毛狀根具有生物轉(zhuǎn)化功能，可以產(chǎn)生許多新的化合物；能產(chǎn)生某些植物的愈傷組織不能合成的新的有效成分；由于毛狀根培育技術(shù)的高產(chǎn)，并且可從基因程度上對某些酶和特定次生代謝過程進(jìn)展調(diào)控，因此，被公認(rèn)是消費(fèi)植物次生代謝物的一條新途徑。目前誘導(dǎo)植物產(chǎn)生毛狀根的種類已達(dá)幾十種以上，且次生代謝產(chǎn)物消費(fèi)程度到達(dá)相當(dāng)于或高于原植株的程度。99舉例誘導(dǎo)人參愈傷組織消費(fèi)人參皂苷在無外源激素的條件下，毛狀根生長速度為激素誘導(dǎo)根的2倍，人參皂苷的含量達(dá)干重的0.95％，高于再生根(0.91％)和天然栽培根(0.4％)。人參愈傷組織100101青蒿毛狀根消費(fèi)青蒿素青蒿為雙子葉植物藥菊科植物。青蒿素為治療瘧疾的首選藥。構(gòu)造為倍半萜內(nèi)酯類化合物102由發(fā)根農(nóng)桿菌R1601誘導(dǎo)青蒿葉片產(chǎn)生青蒿毛狀根。培育方法及條件固體培育：20～30mm青蒿毛狀根根尖，在MS固體培育基上，添加30L蔗糖，繼代時(shí)間為15d。液體培育：每升MS培育液接種5g毛狀根培育物，120-130rpm，25±1℃，12h／d光照，液體培育的繼代時(shí)間為10d。反響器培育：MS培育液400mL，接種量為0.8g，12h／d光照培育，25±I℃。通氣量為0.5L／min，通氣時(shí)間為15mln。103最大生物量10.3g/L，青蒿素產(chǎn)量到達(dá)179.1mg/L，青蒿素的含量為1.74％。104提高次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)率的方法----小結(jié)1.選育高效合成次生代謝產(chǎn)物才干的細(xì)胞。2.選擇適宜的培育基及培育條件，尋覓最正確工藝條件實(shí)現(xiàn)工業(yè)化消費(fèi)。3.提高次生代謝前體物質(zhì)濃度，尋覓添加次生前體物質(zhì)的途徑和調(diào)理方式，提高產(chǎn)量。4.降低次生代謝產(chǎn)物的濃度：固定化細(xì)胞培育、延續(xù)培育、兩相培育技術(shù)等。5.設(shè)計(jì)適宜的生物反響器：氣升式反響器被以為是最適反響器。105五、植物細(xì)胞培育的運(yùn)用1.初級及次級代謝產(chǎn)物的消費(fèi)。有400種左右。已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化培育的有：煙草、人參、紫草、黃連等。2.天然植物色素的消費(fèi)。有葉黃素、胡蘿卜素、花青素、單寧等。3.生物轉(zhuǎn)化。利用植物細(xì)胞氧化、復(fù)原、皂化、羥基化等多種酶源，使某種前體化合物生成為相應(yīng)有用的產(chǎn)物。如：毛地黃細(xì)胞將β-甲基毛地黃毒素羥基化為β-甲基地高辛，為臨床多用強(qiáng)心藥。106舉例紫草細(xì)胞生物反響器消費(fèi)紫草色素紫草寧〔紫草紅色素〕外用治療皮膚癌、濕疹、帶狀皰疹等；內(nèi)服治療病毒性肝炎、肺癌、肝癌等。1.細(xì)胞來源紫草細(xì)胞來自于紫草葉誘導(dǎo)的愈傷組織，經(jīng)多次培育挑選獲得。在固體培育基中培育的紫草細(xì)胞直接接種于液體培育基中懸浮培育，作為反響器培育的種子。1072.培育過程24℃左右搖瓶培育紫草細(xì)胞作為種子，接種于裝有7L細(xì)胞生長的B5液體培育基，培育14天。利用過濾網(wǎng)放出培育液，并用適量無菌水沖洗殘留在反響器內(nèi)的培育液。然后參與7L紫草色素積累的培育液(M9)，培育20天，溫度控制在23-25℃。培育過程中監(jiān)測培育液酸堿度變化和電導(dǎo)率，以及紫草細(xì)胞濃度和色素含量變化。3.代謝產(chǎn)物紫草色素構(gòu)成與細(xì)胞生長根本同步。108

自然植物和細(xì)胞培育的紫草寧含量比較消費(fèi)方式消費(fèi)周期紫草寧含量〔％干重〕完好植物2～3年1～2植物細(xì)胞培育3周14109植物次生代謝產(chǎn)品的市場潛能產(chǎn)品成分用途年銷售額〔億美圓〕長春花堿治療白血病18～20〔美國〕奎寧治療瘧疾5～10〔美國〕致熱素殺蟲劑20〔全世界〕毛地黃心臟病藥20～55〔美國〕110本章小結(jié)細(xì)胞規(guī)?；嘤心軌虺蔀樾滦蜕I(yè)的重要途徑，細(xì)胞懸浮培育是細(xì)胞規(guī)模化培育的根底。各種單細(xì)胞培育技術(shù)是細(xì)胞克隆的根底，也適用于植物花粉培育和原生質(zhì)體培育。高等生物細(xì)胞規(guī)?；嘤w系的建立必需于生物反響器的研制相匹配。根據(jù)目的產(chǎn)物建立包括培育基、種細(xì)胞、培育方式等在內(nèi)的一系列配套技術(shù)是商業(yè)化的前提。111Goodbye!Goodbye!112紫杉醇：二萜類化合物最早由太平洋紅豆杉Taxusbrevifolia的樹皮中分別廣泛用于治療卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等十幾種癌癥。NCI稱其為過去15年中開發(fā)的最好的抗癌藥物，20世紀(jì)90年代抗腫瘤藥的三大成就之一，湯姆森科技桂冠獎(jiǎng)。目前主要來源于紅豆杉屬植物。紫杉醇簡介113紫杉醇研發(fā)過程年代進(jìn)