細胞工程 第五章 生物制品生產(chǎn)

第五章生物制品消費1主要內(nèi)容第一節(jié)細胞大規(guī)模培育第二節(jié)動物細胞制藥第三節(jié)植物次生代謝產(chǎn)物的消費2第一節(jié)細胞大規(guī)模培育大規(guī)模培育技術是建立在實驗室培育方法〔貼壁培育法和懸浮培育法〕的根底上，再利用固定化細胞、人工灌注、生物反響器技術等技術開展起來的。

一、細胞培育的操作方式二、大規(guī)模細胞培育系統(tǒng)3一、細胞培育的操作方式培育方式分為：分批式流加式培育半延續(xù)式延續(xù)灌注式41、分批式培育指先將細胞和培育液一次性裝入反響器內(nèi)進展培育，細胞不斷生長，產(chǎn)物不斷構(gòu)成，經(jīng)一段時間后，終止培育。5分批式培育特點①系統(tǒng)密閉，只允許氣體和揮發(fā)性代謝物質(zhì)與外界交換。②培育基體積固定，當主要營養(yǎng)物質(zhì)耗盡時，細胞即停頓生長，又稱為分批培育或間歇培育，多在3-5d/批。③細胞數(shù)目、總分量、DNA含量呈“S〞形(五個時期)變化。④為保證細胞不斷增殖，須在到達最大分量時取出1/5～1/3的培育液，轉(zhuǎn)移繼代培育。⑤是傳統(tǒng)的、常用的方法，可直接放大。其工業(yè)反響器規(guī)?？蛇_12000L。672、半延續(xù)式〔流加式〕培育

指在分批式培育的根底上，將分批培育的培育液部分取出，并補充參與等量的新穎培育基，使反響器內(nèi)培育液的總體積堅持不變。83、流加式培育在分批式操作的根底上，在培育過程中根據(jù)細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的不斷耗費和需求，流加濃縮的營養(yǎng)物或培育基，從而使細胞繼續(xù)生長至較高的密度，目的產(chǎn)品到達較高的程度。由于流加式培育能控制更多的環(huán)境參數(shù)，使得細胞生長和產(chǎn)物生成容易維持在優(yōu)化形狀，是當前動物細胞培育工藝中占有主流優(yōu)勢的培育工藝。94、延續(xù)灌注式培育是把細胞接種后進展培育，新穎的培育液不斷從反響器一頭參與，從另一頭不斷取出等量的培育液，細胞仍留在反響器內(nèi)，使細胞處于一種營養(yǎng)不斷供應形狀。使反響條件處于一種恒定形狀。10延續(xù)灌注式培育特點1〕不斷參與新培育基，保證了營養(yǎng)物質(zhì)的充分供應。2〕培育期細胞增殖速度快，細胞生長速率長久地堅持在對數(shù)生長期，構(gòu)成一個穩(wěn)定的培育形狀。3〕適用于細胞大規(guī)模工業(yè)化培育。4〕由于延續(xù)培育需求的設備比較復雜，投入較大，且要維持細胞無菌形狀，技術條件要求苛刻，因此未得到廣泛運用。1112開放式延續(xù)培育----細胞隨排出培育液一同流出且速度恒定。在穩(wěn)定形狀下流出細胞的速率等于培育系統(tǒng)中新細胞的增長速率。封鎖式延續(xù)培育----新穎培育液和老培育液以等量方式進出，而搜集的細胞重新放入原培育系統(tǒng)中繼續(xù)培育，故培育系統(tǒng)中細胞數(shù)量是在不斷添加的。1314二、大規(guī)模細胞培育方法按供養(yǎng)方式分為三種：攪拌式、氣升式、旋轉(zhuǎn)式按細胞固定分為四種：懸浮培育、微載體培育、微囊化培育、微導管培育〔中空纖維培育〕。15機械攪拌式(Spinner)機械攪拌式主要是經(jīng)過不銹鋼攪拌系統(tǒng)使培育物的混勻。在罐體頂端有一些傳感器，監(jiān)測培育物的溫度、pH值、溶氧度(DO)、葡萄糖耗費、NH3、NH4+等參數(shù)。這種反響器培育規(guī)?？蛇_2000L。16該系統(tǒng)優(yōu)點：〔1〕設計簡單，操作方便，易于放大消費；〔2〕細胞密度高，到達107/mL以上；〔3〕便于無菌操作，不易污染；〔4〕氧的轉(zhuǎn)換率高，能滿足細胞在生長時所需的要求。缺陷：對細胞損傷較大，產(chǎn)物含量不高。17氣升攪拌式氣體從罐底的放射管進入反響器的導流管。湍流溫暖而均勻，循環(huán)量大，細胞與培育液混合均勻。剪切力小，細胞的損傷小。放射供氧，氧傳送速率高，供氧良好。適用于懸浮細胞分批培育、微載體和延續(xù)培育。18任務原理反響器運轉(zhuǎn)時，圓筒以30-60r/min的速度轉(zhuǎn)動，由于離心力的作用，攪拌器中心管內(nèi)產(chǎn)生負壓，使攪拌器外培育基流入中心管，沿管螺旋上升，再從導流筒口排出，從攪拌器外沿下降，構(gòu)成循環(huán)流動。在氣腔內(nèi)氣體由分布管鼓泡，氣體溶于液體中，依托氣腔絲網(wǎng)外液體的循環(huán)流動及分散作用，使溶于液體中的氣體成分均勻地分布到反響器內(nèi)。19Celltech公司采用氣升式反響器培育雜交瘤細胞，消費單克隆抗體。消費周期為14~400h。從10L逐級放大到10000L。17d消費抗體100g，抗體合成大多數(shù)處于穩(wěn)定期和衰退期，比傳統(tǒng)搖瓶提高約5倍。20通氣攪拌式細胞培育反響器212223旋轉(zhuǎn)式細胞培育系統(tǒng)20世紀90年代中期，美國宇航局開發(fā)一系列旋轉(zhuǎn)式細胞培育系統(tǒng)(Therotarycellculturesystem,RCCS)，又叫回轉(zhuǎn)式生物反響器(Rotatingwallvesselbiore-actor,RWVB)。RCCS是繞程度軸旋轉(zhuǎn)、無氣泡、膜分散式氣體交換的培育系統(tǒng)。24該反響器是將細胞種植到微載體后，將其移入RCCS圓柱狀的培育容器內(nèi)，加滿培育液。整個容器由電機驅(qū)動沿程度軸旋轉(zhuǎn)，細胞微載體顆粒在程度軸內(nèi)建立均質(zhì)的液體懸浮軌道，并隨容器一同旋轉(zhuǎn)且不與容器壁和其它物體相撞。細胞經(jīng)過膜式氣體交換器來吸氧和排出CO2。由于系統(tǒng)無推進器、氣泡或攪拌器,使破壞性應力減到最小。因此，細胞可以在相對溫暖的環(huán)境中進展三維生長，得到類似人體內(nèi)的培育產(chǎn)物.近年來曾經(jīng)廣泛運用于微載體系統(tǒng)，至今已有近百種組織細胞均在該系統(tǒng)內(nèi)勝利進展了大規(guī)模擴增。2526懸浮培育與微生物的肉湯培育根本一樣。懸浮培育細胞增殖快、產(chǎn)量高，沒有接觸抑制特性，是動物大規(guī)模培育的理想方法。但只需極少數(shù)動物細胞適宜進展懸浮培育，適用于確立細胞株〔系〕、雜交瘤細胞、腫瘤細胞、血液和淋巴細胞培育。27微載體培育微載體為三維培育系統(tǒng)，細胞貼附于微載體上伸展和增殖，微載體懸浮于培育液中。微載體培育具貼壁和懸浮培育的雙重優(yōu)點，有很大的比外表積，供單層細胞貼附和增殖。懸浮微球使細胞生長的環(huán)境均一，培育基利用率高，反復性好，容易放大。20世紀80年代正式用于工業(yè)化消費干擾素、疫苗和尿激酶原等。28理想的微載體所具備的性能：質(zhì)地柔軟，微球間摩擦輕；耐高溫，可高壓滅菌；透明性，便于察看細胞生長；細胞相容性，利于貼附和生長；無毒性和惰性，對細胞無毒害，不產(chǎn)生有害物質(zhì)，不吸附培育基；低速即懸浮，靜止即沉降，便于換液和收獲；微粒大小均勻；可回收反復運用。29為了提高貼壁才干，對基質(zhì)外表進展包埋，如血清蛋白、多聚賴氨酸處置，可加速貼壁過程。懸浮培育早期，還可向培育液補充丙酮酸、腺嘌呤、次黃嘌呤、胸腺嘧啶等。將這些微載體懸浮在培育液中，大大添加細胞的貼壁面積，可使每毫升培育基到達1000萬個〔108〕細胞的密度。30常用微載體玻璃珠：直徑約2～3μm，密度1.5g/cm3。在玻璃外表覆蓋塑料或中空玻璃也可到達此密度。葡聚糖微載體：帶正電，干粉在pH7.2的磷酸鹽緩沖液中吸脹，清洗滅菌后運用。Cytodex2：電荷性大大下降，吸附才干很低，適宜于蛋白質(zhì)藥物的消費。纖維素微載體DE52和DE53：適宜多種細胞培育。聚丙烯酰胺載體：貼壁較快，親水性。31多孔微載體：直徑0.2～5mm，孔徑20～300μm，達占總體積的85%，極大地添加了比外表積，可實現(xiàn)細胞的固定化，到達高密度培育。廣泛運用的有：Cellsnow、Cytocell〔纖維素基質(zhì)〕、Verax、Cultisphere〔膠原〕、Cytoline1和2〔聚苯乙烯〕、ImmobaSil〔硅橡膠〕及Siran〔玻璃〕等。主要用于攪拌、固定床和流化床反響器。3233微囊化培育利用固定化細胞技術，將一定量細胞與約4％的褐藻酸鈉混合后，滴到CaCl2溶液中，構(gòu)成半透性微膠囊。又稱固定化細胞、大載體培育法。341〕細胞在微膠囊內(nèi)生長，既吸收外界營養(yǎng)，又可排出本身代謝物。2〕細胞所受的剪切力損傷小，細胞生長良好，純度提高。便于延續(xù)培育，提高培育細胞的利用率；3〕細胞培育密度高，生長緩慢，有利于次生代謝產(chǎn)物的積累，提高產(chǎn)量。354〕次生代謝物直接分泌到培育液中，可簡化分別、收獲步驟，提高任務效率。如次生代謝物不分泌，培育終了后，收獲微囊，破微囊，純化抗體。5〕固定化細胞的氧氣、營養(yǎng)供應與傳送及細胞的遺傳穩(wěn)定性等問題有待于進一步研討處理。這種培育方法是消費單克隆抗體、干擾素的一種有效培育方法。目前，美國藥用產(chǎn)品大規(guī)模消費常用此法進展。363738中空纖維〔微導管〕培育是模擬體內(nèi)細胞三維生長環(huán)境而發(fā)明的。將由硝酸纖維素或醋酸纖維素構(gòu)成外徑不超越1mm〔φ≤1mm〕的微導管平鋪成層，相當于體內(nèi)的毛細血管。微導管外表貼壁生長細胞，管內(nèi)通無菌空氣，管外浸泡在培育液中，氣體、水分及其它營養(yǎng)物質(zhì)可以經(jīng)過微導管與細胞進展交換。微導管外表的細胞密度可達100萬/cm2個。細胞密度可達108/mL。39接種孔水套層產(chǎn)物出口培育基入口產(chǎn)物出口培育基入口內(nèi)膜外膜腔室細胞培育基分散后,灌入床層。纖維管壁薄，半透膜，截留不同分子量。纖維管的空腔組成的內(nèi)室：灌流含氧氣的培育基纖維管之間的空間組成的外室：細胞生長。40細胞分泌的產(chǎn)物和血清中的成分由于分子量較大而無法進入內(nèi)室，產(chǎn)物只能在外室積累和濃縮。細胞代謝的廢物是小分子物質(zhì)，可浸透進入內(nèi)室，從內(nèi)腔開口排出，防止了對細胞的毒性。在收獲時，翻開纖維管之間的外室開口，產(chǎn)物就流出來。此時雖然細胞停頓分裂，但細胞的存活、安康和核形狀不變，代謝和分化功能仍可堅持數(shù)月。41第二節(jié)動物細胞生物制藥用動物細胞的培育技術來消費有功能的蛋白質(zhì)，特別是人源細胞的培育，在藥物消費中的位置越來越重要。一、表達蛋白的宿主系統(tǒng)二、消費用動物細胞的要求三、常用動物細胞的特性四、基因工程細胞構(gòu)建和挑選五、細胞庫的建立42常見的動物細胞培育產(chǎn)物疫苗小兒麻痹癥疫苗、狂犬疫苗、腦炎疫苗、皰疹疫苗、風疹疫苗單克隆抗體IgG、IgM、IgA等免疫調(diào)節(jié)劑細胞生長因子、干擾素、白細胞活化因子、胸腺肽酶胰蛋白酶、尿激酶、膠原酶、胃蛋白酶激素生長激素、促紅細胞生成素43基因工程藥物消費表示圖44一、表達目的蛋白的宿主系統(tǒng)總體分為：原核表達系統(tǒng)和真核表達系統(tǒng)。常見的宿主系統(tǒng)細菌、酵母、霉菌、絲狀真菌、植物細胞、哺乳動物細胞等。45原核表達系統(tǒng)----細菌特點：繁衍快、易于培育，限制：表達的蛋白質(zhì)缺乏轉(zhuǎn)錄后的修飾；原核系統(tǒng)表達的蛋白普通為胞內(nèi)產(chǎn)物，需求破碎細胞提取產(chǎn)物，給產(chǎn)物的分別純化帶來困難；還易受外源毒素的污染。46真核表達系統(tǒng)特點表達后的蛋白有修飾作用，與人體本身分泌的天然蛋白非常近似；動物細胞表達的蛋白都是胞外分泌，產(chǎn)物的分別純化過程非常簡單。但是，動物細胞大規(guī)模培育比較復雜，目前仍處于開展完善階段。47表達系統(tǒng)的選擇原核表達系統(tǒng)：普通“小分子、構(gòu)造簡單〞的蛋白消費，且蛋白轉(zhuǎn)錄后無需修飾，如胰島素；真核表達系統(tǒng)：主要“消費大分子、構(gòu)造復雜的蛋白〞，并且轉(zhuǎn)錄后的修飾對蛋白的生物活性具有重要影響，如組織型纖溶酶原激活劑(tPA〕、促紅細胞生成素等〔EPO〕等。對既可用原核、可用真核表達的蛋白如α-干擾素、人生長激素等，應綜合調(diào)查消費的經(jīng)濟本錢和技術難易程度等選擇表達系統(tǒng)。48口蹄疫疫苗消費表示圖49過去運用動物消費的生物制品，經(jīng)常發(fā)生過敏反響或病原體傳染事件。如脊髓灰質(zhì)炎疫苗能夠被猿猴腎病毒污染；用人血制備的某些生物制品能夠被肝炎或艾滋病病毒污染。采用細胞工程消費的產(chǎn)品能將致病要素降到最?。簞游锛毎嘤玫募毎尘懊鞔_，經(jīng)過嚴厲的平安檢測，消除了污染病原體的危險。50實例EPO的消費：以前需求從2500L再生妨礙性貧血病人的尿液中才干提取極微量的EPO用于實驗室分析。如今，經(jīng)過大規(guī)模培育基因工程細胞消費的EPO，曾經(jīng)治療了成千上萬的腎性貧血的病人。胰島素的消費：過去從豬胰腺中提取胰島素，但某些患者會引起抗原抗體反響?；蚬こ炭梢杂萌艘葝u素基因消費人源化蛋白，抑制免疫反響的缺陷。51動物細胞表達系統(tǒng)的缺乏細胞生長緩慢，消費效率較低，產(chǎn)量遠遠落后于其他表達系統(tǒng)。如骨髓細胞MPG-11消費IgG，每個細胞1分鐘為5pg，10L反響器，細胞密度為107/mL，消費才干不到1g/d。延續(xù)細胞系添加了生長和代謝速率，但同時導致了副產(chǎn)物的添加。52動物細胞對培育條件要求苛刻和敏感，對溫度、pH、浸透壓、剪切力等忍受才干差。需求添加氨基酸、維生素、血清、生長因子等，培育基要求高，消費費用較高。53原代細胞二倍體細胞系轉(zhuǎn)化細胞系二、消費用動物細胞的要求54⒈原代細胞直接取自動物組織器官，經(jīng)過粉碎消化而獲得的細胞懸液〔109/g〕。需求大量動物，費錢費勞力。細胞質(zhì)量不穩(wěn)定。常用雞胚細胞、原代兔腎細胞、鼠腎細胞、淋巴細胞等。552.二倍體細胞系原代細胞經(jīng)過傳代、挑選克隆，從多種細胞成分中，挑選并純化出具有一定特征的某種細胞株。特點①正常細胞的染色體2n核型；②貼壁依賴接觸抑制；③可傳代培育50代；④無致瘤性。563.轉(zhuǎn)化細胞系經(jīng)過某個轉(zhuǎn)化過程構(gòu)成的，常由于染色體斷裂變成異倍體，失去正常細胞特點，而獲得無限增殖才干。轉(zhuǎn)化過程可以是自發(fā)的、人工的、或從腫瘤組織中產(chǎn)生。57三、常用動物細胞的特性W1-38人胚胎肺組織二倍體成纖維細胞系。核型為2n=46。貼壁生長，能產(chǎn)生膠原，同工酶為G6PD-B型。培育基用EBM加10%小牛血清，pH7.2。倍增時間為24h，有限壽命50代。對很多病毒敏感，第一個被用于制備疫苗，目前廣泛運用。58MRC-5正常男性肺組織中獲得的人二倍體成纖維細胞系。核型為2n=46。培育基需加小牛血清。有限壽命42～46代。增殖速度較W1-38快，對不良環(huán)境敏感性較W1-38低。對人的病毒敏感。用于消費疫苗。59Namalwa從患有淋巴瘤病的肯尼亞人獲取，建成人的類淋巴母細胞系。非整體核型，12～14條標志染色體，單條X，無Y。外源基因表達程度較高，培育基為RPMI1640+7%胎牛血清?？捎脽o血清培育基高密度培育。懸浮生長，表達IgM。英國Wellcome公司用Namalwa細胞大規(guī)模消費α干擾素，反響器達8000L。用該細胞消費rhEPO、rhG-CSF、tPA等。60CHO-K1從中國地鼠卵巢中分別的上皮樣細胞。核型2n=20～22。貼壁生長，也可進展懸浮培育，對剪切力和浸透壓有較高的忍受才干。培育基為：DEME+0.1mmol/L次黃嘌呤+0.1mmol/L胸苷+10%小牛血清+脯氨酸。分泌表達外源蛋白，蛋白質(zhì)翻譯后的修飾準確，表達產(chǎn)物的構(gòu)造、性質(zhì)和生物活性接近天然。運用氨甲酰喋呤可添加外源基因的拷貝數(shù)，提高蛋白質(zhì)表達程度。是目前運用最為普遍和成熟的表達糖基化蛋白藥物的宿主細胞。61BHK-21從1日齡地鼠幼鼠腎臟中分別的成纖維樣細胞，核型為2n=44。培育基為DMEM+7%胎牛血清。用于增殖病毒、制備疫苗和重組蛋白。現(xiàn)已用于工程細胞構(gòu)建。62Vero從正常成年非洲綠猴腎臟分別的上皮細胞，貼壁生長，核型2n=60。能順應灌流操作，進展延續(xù)培育。培育基：M199+5%胎牛血清。已有突變系能用無血清培育。常用VeroE6增殖多種病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病毒、乙腦病毒等，消費病毒性疫苗，已被同意用于人體。也可作為轉(zhuǎn)染的宿主細胞，用于表達外源基因的蛋白質(zhì)藥物和病毒的檢測。63SP2/0-Ag14經(jīng)過交融的方法分別獲得。培育基為DMEM+10%胎牛血清。能耐受8氮鳥嘌呤20μg/mL，但在HAT選擇培育基中不能存活。通常用于消費單克隆抗體。64C127：從小鼠乳腺瘤分別的上皮樣細胞。貼壁生長。表達多種外源基因，其中EPO的程度達10mg/L，消費rhGH已被同意上市。3T3：HINSwiss小鼠胚胎培育中分別的細胞系。能大量表達外源蛋白，廣泛用于藥物毒理學研討。COS：從SV40DNA轉(zhuǎn)化的非洲綠猴腎細胞CV1中分別得到的，廣泛用于外源基因瞬時表達的研討。GH3：用于生長激素研討，293：用于基因治療的研討。65昆蟲細胞株系Sf-9從秋粘蟲的卵巢細胞〔SF21〕中分別得到的，是最常用的昆蟲表達細胞。通常用Grace培育基+3.3g/L水解乳蛋白+3.3g/L酵母浸液+10%胎牛血清。抗機械剪切，能在無血清培育基的攪拌反響器中生長。對苜宿尺蠖核型多角體病毒和其它桿狀病毒高度敏感。生長快，能高效表達外源基因。用于高效表達外來蛋白制品。66其他Sf21：從秋粘蟲卵巢細胞中分別得到，細胞較大，容易放大，高效表達外源基因。TN-5B1-4：從粉紋夜蛾卵細胞中分別得到的。無血清培育，快速倍增。分泌表達重組蛋白的才干比Sf9細胞系高20多倍，能順應懸浮培育。67四、基因工程細胞構(gòu)建和挑選在消費中采用更多、更有前景的是交融細胞及各種基因工程細胞。被用于構(gòu)建工程細胞的動物細胞有：CHO-dhfr、BHK-21、Namalwa、Vero、SP2/0、Sf-9等細胞。681.真核細胞基因表達載體的構(gòu)建運用的載體有兩類：病毒載體--牛痘病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體--69病毒作為載體的優(yōu)點：①雙鏈DNA，易重組；②插入7～8kbDNA不影響正常病毒粒子的構(gòu)成③多角體蛋白和病毒粒子的構(gòu)成無直接關系。因此，用外源基因改換多角體蛋白基因，仍能構(gòu)成有感染力病毒粒子；70④多角體蛋白基因有非常強的啟動子，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可占全部蛋白質(zhì)的20%～30%；⑤用光學顯微鏡可看到多角體，可以此作為標志物，選陽性克隆。⑥如家蠶桿狀病毒，可在蠶體表達外源基因。71質(zhì)粒載體與微生物的質(zhì)粒載體類似，普通是穿越質(zhì)粒，具有兩個復制子和抗性挑選標志基因。大腸桿菌的復制子，細菌中繁衍。抗生素抗性標志，原核細胞挑選。動物細胞復制子，在宿主細胞中穩(wěn)定表達。還有絲狀噬菌體復制子。72在細菌和哺乳動物細胞體內(nèi)都能擴增，含有如下根本成分：①允許載體在細菌體內(nèi)擴增的質(zhì)粒序列。②含有使基因表達的調(diào)控元件。③能用以挑選出外源基因已整合的選擇標志。④有時還帶有選擇性添加拷貝數(shù)的擴增系統(tǒng)。73⒉基因的導入和高效表達細胞株挑選74基因載體導入動物細胞常用的方法磷酸鈣沉淀法電穿孔法磷酸鈣沉淀法溶解的DNA加Na2HPO4和CaCl2構(gòu)成磷酸鈣沉淀，DNA被包在磷酸鈣沉淀中，構(gòu)成DNA-磷酸鈣共沉淀物，當和細胞外表接觸時，那么經(jīng)過細胞吞噬作用而將DNA導入。電穿孔法借助電穿孔儀的高壓脈沖電場，使細胞膜出現(xiàn)瞬時可逆性小孔，外源DNA沿小孔進入細胞。轉(zhuǎn)化率較高，拷貝數(shù)低。75化學轉(zhuǎn)染是最常用的轉(zhuǎn)染方法。浸透性休克和DMSO等化學試劑能促進DNA進入細胞。轉(zhuǎn)染試劑盒已有商業(yè)化供應，特別是脂質(zhì)體資料的轉(zhuǎn)染試劑。影響要素細胞培育物的密度、DNA的大小、純度與用量、化學試劑的用量與處置時間、促進劑的運用等。76轉(zhuǎn)染體挑選與分別轉(zhuǎn)染后1～6天收獲細胞，進展核酸分子雜交或蛋白質(zhì)雜交，檢測外源基因的瞬時表達。為了獲得穩(wěn)定整合的細胞系，先在非選擇性培育基上培育24～48小時，讓細胞倍增1～2代，使轉(zhuǎn)染DNA表達。再按1：15比例轉(zhuǎn)移到選擇性培育基上，每2～4天改換培育基，繼續(xù)2～3周，促進抗性細胞生長，去除死細胞殘骸，最后得到獨立的克隆。在轉(zhuǎn)染中大約有萬分之一的細胞將穩(wěn)定整合外源基因，因此需求運用與之相對應的顯性選擇標志來分別轉(zhuǎn)染細胞。77五、細胞庫的建立必需建立兩個細胞庫⒈原始細胞庫

⒉消費用細胞庫78原始細胞庫存有該細胞的詳細擋案，包括：①該細胞系的歷史②該細胞系的特性③對各種有害因子的檢查結(jié)果79消費用細胞庫從原始細胞庫來的，或從單一安瓶來，或從多個安瓶來即刻混合，經(jīng)培育擴增再分裝儲存構(gòu)成消費細胞庫。需建立檔案，進展無菌、無細胞交叉污染的檢查。需確定最高運用的傳代次數(shù)。80第三節(jié)植物次生代謝產(chǎn)物的消費隨著植物細胞懸浮培育技術的開展及各種新型生物反響器的出現(xiàn)，植物細胞能像微生物細胞那樣在發(fā)酵罐中大量延續(xù)培育，產(chǎn)生相當于幾倍或幾十倍該完好植株所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物。植物細胞培育的產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、化工、農(nóng)業(yè)等領域得到了廣泛運用。如：人參愈傷組織在培育基中培育數(shù)周，所含粗皂苷的含量可達19.3%，而天然人參根中含量僅為4.1%。81一、次生代謝產(chǎn)物二、培育條件下次消費物積累的特性三、提高細胞次消費物產(chǎn)量的途徑四、培育技術的選擇五、植物細胞培育的運用82一、次生代謝產(chǎn)物次生代謝產(chǎn)物是代謝的最終產(chǎn)物，并非普通生命活動所必需的產(chǎn)物。多是一類小分子有機化合物，如黃酮、色素、毒素、抗生素、生長素、生物堿等。次生代謝產(chǎn)物分布具有種、屬、器官、組織以及發(fā)育階段的特異性，也就是說不同植物類型或同一植物不同生長階段及組織部位產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物及產(chǎn)量是不同的。83主要分為三類萜類、酚類、含氮次級化合物。84酚類--黃酮類、醌類和簡單酚類黃酮類構(gòu)造：C6-C3-C6生物合成前體：苯丙氨酸和丙二酸單酰輔酶A效果：治療心血管和高血壓的藥物成分。醌類化合物構(gòu)造：由苯式多環(huán)芳烴衍生的芳香二氧化合種類：苯醌、萘醌。效果：呈現(xiàn)顏色，具有抗菌、抗癌作用。85簡單酚類構(gòu)造：苯丙酸類、苯丙酸內(nèi)酯和苯甲酸衍生物分布：廣泛分布于維管植物。功能：許多是植物防御食草昆蟲和真菌侵襲的維護劑。常用的藥物有：綠原酸、姜酚、肉桂醛等。86萜類化合物單萜和倍半萜是植物揮發(fā)油和香料的主要成分，有的具有重要的藥用價值。萜類化合物已超越2萬種。倍半萜：抗瘧疾藥物青蒿素。二萜生物堿：抗癌藥物紫杉醇。三萜皂甙：人參皂甙。甾體皂甙：薯蕷皂甙。87含氮化合物包括：生物堿、胺類、非蛋白質(zhì)氨基酸和生氰苷合成：從普通的氨基酸合成的。分布：雙子葉植物種類：主要有生物堿、含氰苷、芥子油苷和非蛋白、氨基酸等，有5500種以上。88二、次消費物積累的特性生長偶聯(lián)型----產(chǎn)物合成與細胞生長成正比。如長春花堿的合成、煙草中煙堿合成。中間型----產(chǎn)物僅在細胞生長下降時合成，細胞在指數(shù)生長期或停頓期產(chǎn)物都不合成。如蒽醌類物質(zhì)、莨菪烷類的合成等。非生長偶聯(lián)型----產(chǎn)物合成在細胞生長停頓以后。如紫草寧。89三、提高細胞次消費物產(chǎn)量的途徑選擇適宜的起始資料－－種類、部位梔子胚軸銀杏 子葉當歸 根紅豆杉幼嫩的莖茜草葉柄培育基既要滿足植物細胞的生物量增長，還要滿足細胞合成及積累次消費物的需求。90前體〔precursor〕的運用主要是提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。對某一目的產(chǎn)物來講，能夠有多種前體物質(zhì)。同一種前體物質(zhì)又能夠有多條代謝途徑，從而構(gòu)成不同的代謝產(chǎn)物。針對其合成的關鍵生化過程進展前體物質(zhì)添加。多數(shù)前體物質(zhì)對細胞生長并不非常有利，能夠有前體濃度過量產(chǎn)生的反響抑制。91激發(fā)子〔elicitor〕的運用是指可以誘導植物細胞中某些反響，并構(gòu)成細胞特征性本身反響的分子，也稱誘導子。非生物激發(fā)子----如輻射、金屬離子、茉莉酸類似物〔茉莉酸甲酯，M-JA〕等。生物激發(fā)子外源激發(fā)子：菌絲、微生物機體提取物及微生物產(chǎn)生的多糖、蛋白和脂肪酸等。內(nèi)源性激發(fā)子：來源于植物構(gòu)造化合物。如降解細胞壁的酶、細胞壁碎片、寡聚糖等有機分子。92激發(fā)子促進次消費物積累激發(fā)子對南方紅豆杉細胞培育合成紫杉醇的影響激發(fā)子適宜濃度（mM）與對照比提高產(chǎn)物效率（倍）M-JA0.17.0花生四烯酸0.16.5硝酸柿胺1.05.5水楊酸0.14.5硝酸鹽0.013.093四、培育技術的選擇包括反響器的選擇和培育方式的選擇。培育技術的選擇不僅要思索細胞生長和產(chǎn)物積累的效率，同時還應思索技術根底和消費本錢。如兩相培育技術。培育方式可采用兩步培育，即在生長培育基中培育細胞，在消費培育基中積累產(chǎn)物。94兩相培育技術指在植物細胞培育體系中參與水溶性或脂溶性的有機化合物，或者是具有吸附作用的多聚化合物，使培育體系由于分配系數(shù)不同而構(gòu)成上、下兩相，細胞在其中一相中生長并合成次生代謝物，而這些次生代謝物又經(jīng)過自動或被動運輸?shù)姆绞结尫诺桨?，被另一相所吸附?5特點可及時分別次生代謝物，減少負反響抑制，提高次生代謝產(chǎn)物含量，而且有機相可循環(huán)運用，根本實現(xiàn)了植物組織的延續(xù)培育。迄今為止，已有18種植物細胞運用此項技術獲得勝利。例如添加十六烷提取紫草素，可使產(chǎn)量提高7倍多；添加十六烷可使孔雀草發(fā)根培育的噻吩分泌量由原來的1％提高至70％。96舉例兩相培育紅豆杉細胞消費紫杉醇紫杉醇為抗癌藥，價99%純度的1500元/g，35%的元/g。第一相：B5培育基第二相：5％(v/v)的松油醇產(chǎn)物釋放劑：5％(v/v)二甲基亞砜。10g(鮮重)/100mL培育基/250mL三角燒瓶。25℃，120rpm，黑暗培育。97毛狀根培育技術發(fā)根土壤桿菌的Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)移并整合到雙子葉植物基因組中誘導出毛狀根。其生長迅速，分支多，且具有器官化的特征，遺傳性、生理生化特征穩(wěn)定，具有更強的次生代謝物合成才干，可建立培育系統(tǒng)。毛狀根具有很強的繁衍才干，可以制成人工種子長期保管。98毛狀根具有生物轉(zhuǎn)化功能，可以產(chǎn)生許多新的化合物；能產(chǎn)生某些植物的愈傷組織不能合成的新的有效成分；由于毛狀根培育技術的高產(chǎn)，并且可從基因程度上對某些酶和特定次生代謝過程進展調(diào)控，因此，被公認是消費植物次生代謝物的一條新途徑。目前誘導植物產(chǎn)生毛狀根的種類已達幾十種以上，且次生代謝產(chǎn)物消費程度到達相當于或高于原植株的程度。99舉例誘導人參愈傷組織消費人參皂苷在無外源激素的條件下，毛狀根生長速度為激素誘導根的2倍，人參皂苷的含量達干重的0.95％，高于再生根(0.91％)和天然栽培根(0.4％)。人參愈傷組織100101青蒿毛狀根消費青蒿素青蒿為雙子葉植物藥菊科植物。青蒿素為治療瘧疾的首選藥。構(gòu)造為倍半萜內(nèi)酯類化合物102由發(fā)根農(nóng)桿菌R1601誘導青蒿葉片產(chǎn)生青蒿毛狀根。培育方法及條件固體培育：20～30mm青蒿毛狀根根尖，在MS固體培育基上，添加30L蔗糖，繼代時間為15d。液體培育：每升MS培育液接種5g毛狀根培育物，120-130rpm，25±1℃，12h／d光照，液體培育的繼代時間為10d。反響器培育：MS培育液400mL，接種量為0.8g，12h／d光照培育，25±I℃。通氣量為0.5L／min，通氣時間為15mln。103最大生物量10.3g/L，青蒿素產(chǎn)量到達179.1mg/L，青蒿素的含量為1.74％。104提高次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)率的方法----小結(jié)1.選育高效合成次生代謝產(chǎn)物才干的細胞。2.選擇適宜的培育基及培育條件，尋覓最正確工藝條件實現(xiàn)工業(yè)化消費。3.提高次生代謝前體物質(zhì)濃度，尋覓添加次生前體物質(zhì)的途徑和調(diào)理方式，提高產(chǎn)量。4.降低次生代謝產(chǎn)物的濃度：固定化細胞培育、延續(xù)培育、兩相培育技術等。5.設計適宜的生物反響器：氣升式反響器被以為是最適反響器。105五、植物細胞培育的運用1.初級及次級代謝產(chǎn)物的消費。有400種左右。已實現(xiàn)工業(yè)化培育的有：煙草、人參、紫草、黃連等。2.天然植物色素的消費。有葉黃素、胡蘿卜素、花青素、單寧等。3.生物轉(zhuǎn)化。利用植物細胞氧化、復原、皂化、羥基化等多種酶源，使某種前體化合物生成為相應有用的產(chǎn)物。如：毛地黃細胞將β-甲基毛地黃毒素羥基化為β-甲基地高辛，為臨床多用強心藥。106舉例紫草細胞生物反響器消費紫草色素紫草寧〔紫草紅色素〕外用治療皮膚癌、濕疹、帶狀皰疹等；內(nèi)服治療病毒性肝炎、肺癌、肝癌等。1.細胞來源紫草細胞來自于紫草葉誘導的愈傷組織，經(jīng)多次培育挑選獲得。在固體培育基中培育的紫草細胞直接接種于液體培育基中懸浮培育，作為反響器培育的種子。1072.培育過程24℃左右搖瓶培育紫草細胞作為種子，接種于裝有7L細胞生長的B5液體培育基，培育14天。利用過濾網(wǎng)放出培育液，并用適量無菌水沖洗殘留在反響器內(nèi)的培育液。然后參與7L紫草色素積累的培育液(M9)，培育20天，溫度控制在23-25℃。培育過程中監(jiān)測培育液酸堿度變化和電導率，以及紫草細胞濃度和色素含量變化。3.代謝產(chǎn)物紫草色素構(gòu)成與細胞生長根本同步。108

自然植物和細胞培育的紫草寧含量比較消費方式消費周期紫草寧含量〔％干重〕完好植物2～3年1～2植物細胞培育3周14109植物次生代謝產(chǎn)品的市場潛能產(chǎn)品成分用途年銷售額〔億美圓〕長春花堿治療白血病18～20〔美國〕奎寧治療瘧疾5～10〔美國〕致熱素殺蟲劑20〔全世界〕毛地黃心臟病藥20～55〔美國〕110本章小結(jié)細胞規(guī)?；嘤心軌虺蔀樾滦蜕I(yè)的重要途徑，細胞懸浮培育是細胞規(guī)模化培育的根底。各種單細胞培育技術是細胞克隆的根底，也適用于植物花粉培育和原生質(zhì)體培育。高等生物細胞規(guī)?；嘤w系的建立必需于生物反響器的研制相匹配。根據(jù)目的產(chǎn)物建立包括培育基、種細胞、培育方式等在內(nèi)的一系列配套技術是商業(yè)化的前提。111Goodbye!Goodbye!112紫杉醇：二萜類化合物最早由太平洋紅豆杉Taxusbrevifolia的樹皮中分別廣泛用于治療卵巢癌、乳腺癌、非小細胞肺癌等十幾種癌癥。NCI稱其為過去15年中開發(fā)的最好的抗癌藥物，20世紀90年代抗腫瘤藥的三大成就之一，湯姆森科技桂冠獎。目前主要來源于紅豆杉屬植物。紫杉醇簡介113紫杉醇研發(fā)過程年代進