單采、混采、單檢、混檢的區(qū)別

單采、混采、單檢、混檢的區(qū)別概念的區(qū)別—、單檢單檢即“單個(gè)檢測(cè)”，指樣本采集時(shí)是將1個(gè)人的拭子單獨(dú)放在1根病毒采集管中，這根采集管里通常含3mL病毒保存液（注：我們?cè)趯?shí)際工作中也會(huì)建議對(duì)疑似患者采樣時(shí)同時(shí)采口咽拭子和鼻咽拭子，共2根拭子一起放入1根采集管中，以提高檢出率）。每個(gè)采集管單獨(dú)作為一個(gè)獨(dú)立的樣本進(jìn)行檢測(cè)，比如檢測(cè)試劑盒說明書中要求加原始樣本200^1，那么這份單檢樣本就按200^1加入進(jìn)行核酸提取。單檢是疫情初期以及當(dāng)前對(duì)重點(diǎn)人群檢測(cè)、隔離監(jiān)測(cè)以及新冠病毒感染者病程監(jiān)測(cè)的主要檢測(cè)方式。二、混檢混檢即“混合檢測(cè)”，樣本采集完全同單檢的方法，即1個(gè)人用1根病毒采集管（3mL病毒保存液），只是在核酸檢測(cè)時(shí)為了提高檢測(cè)效率和檢測(cè)通量，把幾個(gè)人的病毒采樣管里的液體都減少加樣量，幾個(gè)人受檢者占用1個(gè)檢測(cè)通量進(jìn)行后續(xù)的核酸提取和擴(kuò)增。比如，檢測(cè)試劑盒說明書要求加原始樣本200^1,采用5個(gè)人混檢方案的話，那就是每個(gè)人加入原始樣本量40^1（200^1/5人份=40^1/人份），其他檢測(cè)步驟不變?；鞕z主要是在2020年8月以前國(guó)家混采方案還未出臺(tái)、混采管也未生產(chǎn)出來時(shí)，且為了提高新冠核酸篩查效率，用于人群大批量篩查時(shí)所使用的一個(gè)退而求其次的方案。在有混采的方案后，現(xiàn)在基本不用混檢。三、單采單采即“采集單個(gè)樣本”，這個(gè)名稱強(qiáng)調(diào)的是采集過程，是在混采方案推行后用于區(qū)別于混采的一種名稱，其實(shí)質(zhì)就是和單檢是一樣的，1個(gè)人占用1根采集管，核酸檢測(cè)時(shí)也通常會(huì)單檢，應(yīng)用范圍自然與單檢的一樣?；觳杉础安杉旌蠘颖尽?，采集多個(gè)人的樣本放在一起，以提高效率?；觳捎址譃?合1混采、10合1混采以及20合1混采。2020年8月17日，國(guó)務(wù)院聯(lián)防聯(lián)控機(jī)制醫(yī)療救治組（簡(jiǎn)稱救治組）發(fā)布《關(guān)于印發(fā)新冠病毒核酸10合1混采檢測(cè)技術(shù)規(guī)范的通知》；2022年1月15日救治組發(fā)布《關(guān)于印發(fā)新冠病毒核酸20合1混采檢測(cè)技術(shù)規(guī)范的通知》。這兩份通知里都詳細(xì)介紹了對(duì)病毒采集管和采樣拭子的要求，對(duì)于10合1的采集管，要求內(nèi)含6ml胍鹽或其他有效病毒滅活劑的保存液；對(duì)于20合1的采集管，要求內(nèi)含11-12ml胍鹽或其他有效病毒滅活劑的保存液。10合1是指將采集自10人的10支拭子集合于1個(gè)采集管中進(jìn)行核酸檢測(cè)的方法，20合1是指將采集自20人的20支拭子集合于1個(gè)采集管中進(jìn)行核酸檢測(cè)的方法?；觳蛇m用于全員或區(qū)域大規(guī)模新冠篩查，可明顯提高檢測(cè)效率、加快檢測(cè)速度。以上介紹了“單檢”、“混檢”、“單采”和勺昆采”這些概念的區(qū)別，下面針對(duì)“單檢”、“混檢”、“單采”和氣昆采”對(duì)核酸檢測(cè)結(jié)果的影響逐一進(jìn)行解析。對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響因新冠核酸篩查所用的技術(shù)主要就是熒光PCR技術(shù)，所以今天只討論不同的采集方案對(duì)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果的影響。敏感性和特異性任何一個(gè)診斷指標(biāo)都有兩個(gè)最基本的特征，即敏感性和特異性。用熒光PCR技術(shù)檢測(cè)新冠核酸時(shí)，通俗的理解，其敏感性就是在真正的新冠感染者中，該方法能做出陽性結(jié)果的能力或百分率，敏感性越高，其不漏診的機(jī)會(huì)就越大；所謂特異性，就是在沒有感染新冠的人群中，該方法能做出是陰性結(jié)果的能力或百分率，特異性越高，其不誤診的機(jī)會(huì)就越大。對(duì)于單獨(dú)一個(gè)指標(biāo)，如果提高其診斷的敏感性，必然降低其診斷的特異性，換句話說，減少漏診必然增加誤診，反之亦然，即提高其特異性，會(huì)降低敏感性。對(duì)于目前傳播力（R0為9.5）如此強(qiáng)大的奧密克戎變異株，更需提高其敏感性，自然也就會(huì)犧牲其部分特異性。那怎樣在盡可能不降低特異性的基礎(chǔ)上又能提高其敏感性呢？當(dāng)然是多次篩查！請(qǐng)先看下面分析：2020年在對(duì)廣州市20348例密切接觸者的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，第1、2、3和第7輪核酸檢測(cè)的敏感性與特異性分別為69.14%與99.99%、89.84%與99.99%、97.27%與99.99%、100%與99.98%。有相當(dāng)一部分的感染者要經(jīng)過多次篩查才能做出陽性，是PCR這個(gè)檢測(cè)技術(shù)不好嗎？我們來分析一下。敏感性達(dá)不到最理想狀態(tài)的100%，原因有很多，比如病程早期病毒載量低、樣本收集的過早或過晚、未取到有效部位、沒有正確的保存、運(yùn)輸和處理樣本導(dǎo)致病毒RNA降解、口咽部食物或藥物等含有PCR抑制物、病毒基因變異以及檢測(cè)試劑盒靈敏度不高等因素。在這兒先解釋一下“靈敏度”這個(gè)術(shù)語，它和敏感性看上去很相似但實(shí)際上是完全不同的兩個(gè)概念。靈敏度是指檢測(cè)試劑或檢測(cè)體系的最低分析濃度或最低檢出限，比如甲公司生產(chǎn)的核酸檢測(cè)試劑能檢測(cè)到的最低病毒原始濃度是500拷貝數(shù)/mL，乙公司生產(chǎn)的試劑能檢測(cè)到的最低病毒原始濃度是100拷貝數(shù)/mL，那么對(duì)于200拷貝數(shù)/mL這樣一個(gè)病毒含量很低的樣本，甲公司試劑做出來的結(jié)果是陰性（靈敏度不夠，低濃度未能檢出），乙公司試劑做出來則是陽性，因此試劑盒檢測(cè)靈敏度是影響這個(gè)方法敏感度的重要因素。除了試劑本身靈敏度對(duì)敏感性的影響以外，其他因素如取樣不到位、病程早期病毒含量低、標(biāo)本運(yùn)輸和保存不當(dāng)，以及口咽部取材時(shí)含有未知的PCR抑制物等這些分析前因素也是影響整體敏感性下降的重要原因。就拿PCR抑制物來說，咽拭子這類標(biāo)本由于受口/鼻咽部分泌物以及進(jìn)食、飲酒、吸煙等因素影響，會(huì)使樣本的成分變得復(fù)雜。目前已證實(shí)乙醇（飲酒）、血紅素（出血）、肝素（肝素抗凝管）、植物多糖（糞便或植物）、蛋白酶（牛奶）、膽酸鹽（糞便）、鈣離子（帶有滑石粉的手套）等等成分可以抑制PCR擴(kuò)增，還有很多未知的可以抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，這些抑制物需要盡可能在取樣時(shí)避免或者在提取核酸的過程中將其去除，否則會(huì)引起核酸擴(kuò)增抑制，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。通過以上分析可知，要想提高新冠核酸檢測(cè)的敏感性，不僅需要靈敏度高的檢測(cè)試劑，還需要控制檢驗(yàn)前的各種影響因素。在此基礎(chǔ)上，通過多次篩查可明顯提高監(jiān)測(cè)敏感性。對(duì)敏感性的影響那接下來要說的就是單檢、混檢、單采、混采對(duì)敏感性的影響，其實(shí)就是這些不同的樣本采集方式是否會(huì)對(duì)上述所提到的因素有影響。相對(duì)于單采、單檢樣本來講，混檢由于在加樣時(shí)減少了單個(gè)樣本的加樣量，會(huì)使得樣本的病毒檢出率降低，但降低多少呢？現(xiàn)在以10混檢為例，假如10份樣本中有1份是陽性樣本，其余9份都是陰性樣本，按照試劑盒說明書提取核酸時(shí)單檢加樣200^1，那么10混檢的話，這份陽性樣本在核酸提取時(shí)只加進(jìn)去20^1，相當(dāng)于病毒含量被稀釋了10倍，這樣出來的病毒擴(kuò)增曲線會(huì)向右平移，平移多少個(gè)循環(huán)數(shù)呢？這里要做一個(gè)理想型的數(shù)學(xué)模式來推算。理論上，一系列稀釋的樣品擴(kuò)增曲線之間有均勻的間距。那么：.5倍稀釋的DNA樣品，2n=5，n=Log2(5)=2.32.10倍稀釋的DNA樣品，2n=10，n=Log2(10)=3.32.20倍稀釋的DNA樣品，2n=20，n=Log2(20)=4.32n為倍比稀釋后的兩條相鄰曲線之間的Ct值差距。Ct值Ct值全稱Cyclethreshold，即循環(huán)閾值，其含義是指擴(kuò)增到一定的循環(huán)數(shù)時(shí)，其擴(kuò)增產(chǎn)物所攜帶的熒光值可以達(dá)到能被檢測(cè)到的臨界值水平，這時(shí)候所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)就是其Ct值。所以稀釋后的標(biāo)本與原始標(biāo)本相比，需要比原先更多的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)才能達(dá)到檢測(cè)臨界值，其Ct值是增加的，曲線會(huì)右移。由此可見，以10混檢、擴(kuò)增程序設(shè)置總循環(huán)數(shù)是40為例，如果其中一個(gè)樣本的病毒在單檢時(shí)其Ct值大于36.68,那么在混檢時(shí)其擴(kuò)增曲線就會(huì)向右平移3.32個(gè)循環(huán)，也就是說混檢后就檢測(cè)不出來了，結(jié)果就是陰性。那該如何避免混檢所帶來的弱陽性樣本漏檢的風(fēng)險(xiǎn)呢？筆者建議可以通過加大擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，比如要做10混檢的話，就在原先40個(gè)擴(kuò)增的程序上再增加3-5個(gè)循環(huán)，這樣就可避免Ct值為36左右的弱陽性樣本漏檢。當(dāng)然對(duì)于Ct值大于36.68的樣本，這是屬于非常弱的樣本，但其對(duì)應(yīng)的病毒載量究竟是多少？單純這個(gè)定性實(shí)驗(yàn)無法得知，必須有新冠病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線才能準(zhǔn)確計(jì)算出來。在這里需要指出的是：不僅是咽拭子，還有宮頸脫落細(xì)胞、潰瘍面分泌物等這類標(biāo)本，由于受取樣時(shí)拭子擦拭力度和擦拭次數(shù)的影響，取樣的初始量不容易標(biāo)準(zhǔn)化，不能像檢測(cè)血液中乙肝病毒、丙肝病毒那樣可以精準(zhǔn)控制血清加樣量，因此在進(jìn)行分泌物標(biāo)本的核酸檢測(cè)項(xiàng)目時(shí)通常是做的定性試驗(yàn)，而不是絕對(duì)定量試驗(yàn)。定性實(shí)驗(yàn)就不能過分依賴單次的分泌物樣本的Ct值結(jié)果，需要第二次甚至更多次取樣復(fù)核，兩次取樣的Ct值相差較大也是可能的。此外，混檢帶來的另一個(gè)隱患是其中的一個(gè)或幾個(gè)樣本即使因采樣不到位，因其內(nèi)參基因會(huì)被其他樣本的內(nèi)參基因掩蓋，而失去了內(nèi)參基因監(jiān)測(cè)樣本取樣是否合格的內(nèi)質(zhì)控作用。因此，對(duì)于疑似患者、發(fā)熱門診就診患者、新冠患者的病程觀察、密接者的篩查時(shí)，不建議用混檢的方法。接下來要說一下混采對(duì)結(jié)果的影響了。以10合1混采為例，前面已介紹過，10合1混采是10個(gè)人的拭子放在1個(gè)管子里，管子里的液體是6mL，相對(duì)于單采管的3mL來說，混采里某個(gè)樣本的病毒濃度是被稀釋了1倍。我們?nèi)砸?0個(gè)樣本中有1個(gè)為陽性，其余9個(gè)樣本都為陰性的例子來看，提取核酸時(shí)加的總液體量仍然是200^1，由于這個(gè)陽性患者的病毒濃度被稀釋了1倍，因此最終的Ct值會(huì)延后1【計(jì)算公式n=Log2（2）=1】。那假如這10個(gè)混采的人里面有2個(gè)人是陽性，那就和單采是一樣的了，敏感性不會(huì)減弱；那如果大于2個(gè)人陽性，那就比單采的敏感性還高。不管是5混采，10混采，還是20混采，都可以按以上這個(gè)理論推算出來。但要注意的是以上計(jì)算都是理論上和理想條件（核酸提取效率為100%，核酸擴(kuò)增效率也是100%）下的計(jì)算方法，而實(shí)際工作中核酸提取效率和擴(kuò)增效率不一定100%，所以按以上公式計(jì)算出來的Ct值差距和真實(shí)的是有出入的。同樣，混采帶來的另一個(gè)隱患是其中的一個(gè)或幾個(gè)樣本即使因采樣不到位，也不會(huì)被監(jiān)測(cè)出來，道理同上面介紹的混檢。不管是混采還是混檢，