單細胞實驗技術(shù)

、單細胞裂解（3h）1、 UP1引物定容到0.5um：1ul的UP1引物（100um）加入199ul去核酸酶H2O中，用小管盛裝，并充分混勻；（所有的引物序列都列在表1）2、 準備細胞裂解液（4.45ul每個樣品），使用0.5ml薄壁PCR管，加入并混勻以下組分：組分最終濃度體積(ul)(1X)體積(ul)(6X)10XPCRbufferII(無MgCl2)0.9X0.45625mMMgCl21.35mM0.27—10%NP400.45%0.2251.350.1MDTT4.5mM0.2251.35SUPERase-In(20Uul-1)0.18Uul-10.045—RNaseinhibitor(40Uul-1)0.36Uul-10.0450.540.5uMUP1引物12.5nM0.1250.75dNTPmix(2.5mMeach)0.045mM(each)0.090.54Nuclease-freewater—2.97516.17總體積—4.4526.7注意：NP40有毒；3、 從輸卵管獲得四細胞時期胚胎，用口吸管轉(zhuǎn)移到一滴臺氏液（acidicTyrode’ssolution），以去除透明帶；關(guān)鍵步驟：在所有轉(zhuǎn)移步驟中，在轉(zhuǎn)移一個單細胞到裂解液前，需保證使用吸管時沒有形成氣泡。4、 將胚胎轉(zhuǎn)移到無鈣離子培養(yǎng)液中，輕輕吸動知道單個卵裂球分離出來；5、 隨后將卵裂球轉(zhuǎn)移到三個PBS-BSA液滴中（50-100ul），洗滌。6、 單個細胞被轉(zhuǎn)移到含有4.45ul新鮮準備的細胞裂解液中（用0.5ml薄壁PCR管）。先吸一小段PBS-BSA，再吸細胞，然后全部打入裂解液中。關(guān)鍵步驟：每個吸管只能用一次，不能重復(fù)利用，不能多次用于轉(zhuǎn)移別的細胞到裂解液中。關(guān)鍵步驟：應(yīng)該有一個隱形對照樣品，即沒有細胞加入。7、 樣品短暫離心：7500g，30s，4°C。然后立刻放置于冰上。8、 70C孵育90s，馬上轉(zhuǎn)移到冰上；9、 7500g，30s，4C，然后立刻轉(zhuǎn)移到冰上1min。這個步驟之后，所有的mRNAs將從單細胞中釋放。二、反轉(zhuǎn)錄（2h）10、加入0.45ulRTmix（如下表）到每一個管中，從而每個RT反應(yīng)的體積達到5ul每管:4.45ul裂解液，約0.1ul吸胚胎時帶出的PBS-BSA，以及0.45ulRTmix。組分終濃度（Uul-1）1X體積(ul)6X體積(ul)SuperScriptIIIreversetranscriptase(200Uul-1)13.20.331.98RNaseinhibitor(40Uul-1)0.40.050.3T4gene32protein(1-10Uul-1)0.07U0.070.42總體積—0.452.711、 50C孵育30min；12、 逆轉(zhuǎn)錄酶失活，70C，15min；13、 離心7500g，4C,30s，然后立刻轉(zhuǎn)移到冰上1min。這個步驟后，所有的mRNAs的第一

條鏈cDNAs合成。三、自由引物去除（2h）14、準備核酸外切酶I并混勻并混合以下組分，每一個反應(yīng)加入1.0ul混合物;組分終濃度1X體積（ul）5X體積（ul）10XExonucleaseIbuffer1X0.10.5Nuclease-freewater—0.84ExonucleaseI(5Uul-1)0.5Uul-10.10.5總體積—1515、 37°C孵育30min；16、 核酸外切酶失活：80C,25min；17、 離心7500g,4C,30s，然后馬上轉(zhuǎn)移到冰上1min。此步后，所有自由UP1引物被破壞，只保留了完整的5‘cDNA末端；四、3’Poly（A）加尾18、準備TdT反應(yīng)混合物，如下表。每個反應(yīng)加入6.0ul混合物;組分終濃度1X體積（ul）6X體積（ul）10XPCRbufferII(withoutMgCl2)1X0.63.625mMMgCl21.5mM0.362.16100mMdATP3mM0.181.08Nuclease-freewater—3.6621.96Terminaltransferase(5Uul-1)0.75Uul-10.95.4RNaseII(2Uul-1)0.1Uul-10.31.8總體積—63619、 37C孵育15min；20、 TdT失活：70C，10min；21、 離心7500g，4C,30s，然后馬上轉(zhuǎn)移到冰上1min。此步后，第一鏈cDNAs3'末端加入了poly（A）尾；五、第二鏈合成（1h）22、準備76ulPCRmix1，組分如下表:組分終濃度1X體積(ul)80ul體積10XExTaqbuffer(withMgCl2)1X7.68.0dNTPmix(2.5mMeach)0.25mM7.68.0UP2primer(100um)1um0.760.80Nuclease-freewater—59.2862.40TakaraExTaqHS(5UuH)0.05Uul-10.760.80總體積—768023、 將poly（dA）tailedRT產(chǎn)物分到四個空的0.2ml薄壁PCR管中（3ul每管）;24、 每管中加入19ulPCRmix1；25、 PCR擴增：95°C,3min；50°C,2min；72°C,10min；26、 冰浴1min；27、 離心7500g,4C,30s,然后馬上轉(zhuǎn)移到冰上。此步后，第二條鏈cDNAs為5’-UP2-（T）-UP1-3’；n六、PCR擴增28、準備76ulPCRmix2,組分如下表:組分終濃度1X體積(ul)80ul體積10XExTaqbuffer(withMgCl2)1X7.68.0dNTPmix(2.5mMeach)0.25mM7.68.0100umUP1primer1um0.760.80Nuclease-freewater—59.2862.40TakaraExTaqHS(5UuH)0.05Uul-10.760.80總體積—768029、 每管中加入19ulPCRmix2；30、 PCR擴增：首先95C,3min；然后二十個循環(huán)：95C,30s；67C,1min；72C,6min（每一個循環(huán)增加6s）；4C,保存。此步后，所有的cDNAs已經(jīng)得到擴增。將PCR產(chǎn)物儲存在-80C（可保存6個月）；或者轉(zhuǎn)移到冰上，如果立刻繼續(xù)進行第31^步。七、DNA純化31、 混勻每一管中的PCR產(chǎn)物；32、 取10ul混勻后的PCR產(chǎn)物，加入90ulnuclease-freewater，以稀釋10倍。取1ul或2ul這些稀釋后的PCR產(chǎn)物作為模