第十三章臨床微生物標本細菌學檢測

第十三章臨床微生物標本細菌學檢測第一節(jié)血液及骨髓標本細菌學檢測一、采集指征1．懷疑菌血癥、真菌菌血癥、敗血癥、腦膜炎、骨髓炎、關節(jié)炎、肺炎、感染性心內膜炎及不明病原發(fā)熱等情況下均應在未進行系統(tǒng)性抗菌藥物治療前，及時進行血液培養(yǎng)，患者出現(xiàn)以下癥狀、體征時可作為采集血培養(yǎng)的重要指征。寒戰(zhàn)伴發(fā)熱(≥38℃)或低溫(≤36白細胞增多(＞10×109/L)，特別有“核左移”未成熟的或帶狀的白細胞增多；粒細胞減少(成熟的多核白細胞＜1×109/L)；血小板減少，皮膚黏膜出血；昏迷，多器官功能衰竭；或同時具備上述幾種體征時應采血培養(yǎng)。2．新生兒懷疑菌血癥時，還須同時做尿液和腦脊液培養(yǎng)。3．老年菌血癥患者可能不發(fā)熱或不低溫，如伴有身體不適、肌痛或中風，可能是感染性心內膜炎，也應進行血培養(yǎng)。4．骨髓培養(yǎng)與血液培養(yǎng)的送檢指征是基本一致的，臨床常規(guī)血液感染有指征時以抽取血培養(yǎng)為主。但當骨髓炎時或長期使用抗菌藥物患者，抽取骨髓培養(yǎng)陽性率會遠高于血培養(yǎng)。5．各種無菌體液標本，如胸腹水、漿膜腔積液及各種穿刺液等亦可注入血培養(yǎng)瓶以提高培養(yǎng)的陽性率。二、血培養(yǎng)次數(shù)和采血時間(一)總的采血原則采血培養(yǎng)應該盡量在使用抗菌藥物之前進行(心內膜炎除外)，在24小時內采集2～3份血培養(yǎng)(一次靜脈采血注入多個培養(yǎng)瓶中應視為單份血培養(yǎng))。如有可能最好同時做厭氧菌培養(yǎng)。對間歇性寒戰(zhàn)或發(fā)熱的患者，應在寒戰(zhàn)或體溫高峰到來之前0.5～1小時采集血液，或于寒戰(zhàn)或發(fā)熱后1小時采集，因為發(fā)熱時血液中可能沒有細菌。在采集血培養(yǎng)后的2～5天內不需要再重復采血培養(yǎng)(除外心內膜炎和導管相關性敗血癥)，因為進行治療后的2～5天血液中的感染細菌不會馬上消失。(二)特殊的全身性和局部感染患者采血培養(yǎng)的建議1．可疑急性原發(fā)性菌血癥、真菌菌血癥、急性腦膜炎、骨髓炎、關節(jié)炎、細菌性肺炎、腎盂腎炎發(fā)熱患者，應在不同部位(如兩臂)采集2～3份血標本(應在抗生素治療前完成)。2．不明原因發(fā)熱，如隱性膿腫，傷寒熱和波浪熱，第1天內相隔1小時在不同部位連續(xù)采集2～3份血標本，當培養(yǎng)24～48小時后若為陰性，應再采集2～3份血培養(yǎng)。3．可疑菌血癥或真菌菌血癥，但血培養(yǎng)持續(xù)陰性，應改變血培養(yǎng)方法，以獲得罕見的或苛養(yǎng)的微生物。4．可疑細菌性心內膜炎：急性病例，在抗生素治療或改變前1～2小時內從不同部位采集3份血標本；亞急性病例，第1天24小時內相隔1小時連續(xù)采集3次血標本，若24～48小時全部陰性，再采集2～3次血標本；若已經(jīng)抗生素治療患者，連續(xù)3天，每天取2次血標本，可選用能中和或吸附抗菌藥物的培養(yǎng)基。三、采集部位及血量以無菌方法從患者肘靜脈或股動脈采血。采血量以培養(yǎng)基的1/10為宜，成人采血量8～10ml，兒童3～5ml，嬰幼兒為1～2ml。四、采血操作流程和要求1．先準備好采血用具(手套、止血帶、注射器、血培養(yǎng)瓶、消毒劑、棉簽等)并將貼有條形碼的血培養(yǎng)瓶準備好。2．戴好帽子、口罩進行操作，采血前應先洗手。3．皮膚消毒前，先檢查血培養(yǎng)瓶有無損壞或超過保質期，用75％酒精消毒血培養(yǎng)瓶橡皮塞，待干燥60秒。4．系上止血帶，用沾有0.2％碘醇消毒劑的棉簽，以穿刺點為圓心，以約5cm直徑畫圈進行皮膚消毒，作用時間至少30秒，待干燥后穿刺采血。注意消毒過的地方不能重復涂抹，在涂抹的過程中棉簽必須也要同時旋轉。如果患者手臂皮膚不夠干凈，則需重新5．用注射器穿刺取血后，排盡針頭內空氣，勿換針頭，(如果行第2次穿刺，應換針頭)，直接注入消毒后的血培養(yǎng)瓶中，輕輕混勻以防止血液凝固。五、標本運送1．采集后血培養(yǎng)瓶應立即送到微生物實驗室，一般不得超過2小時。2．如因某種原因不能及時送檢，應將已采集好的血液培養(yǎng)瓶放在室溫，切勿放入冰箱內冷藏或冷凍。六、注意事項1．標本采集過程中必須嚴格無菌操作，以免將污染菌誤以為病原菌。2．要保證足夠的標本量，以提高血液或骨髓培養(yǎng)的陽性率。3．待乙醇完全干燥后再采血，以防消毒劑被帶入。4．對已用抗菌藥物輸液不能中止的患者，應在下次用藥之前采集標本，最好進行連續(xù)性動態(tài)血培養(yǎng)觀察。5．對已用抗菌藥物治療的患者可以使用含中和劑的樹脂血瓶，對高度懷疑厭氧菌和真菌感染的患者，可以使用厭氧血瓶和真菌血瓶，對血液患者及小兒可以使用專用血瓶進行血培養(yǎng)。七、檢驗方法一般血液或骨髓培養(yǎng)推薦同時送檢需氧及厭氧血培養(yǎng)，因厭氧菌血液感染約占菌血癥病原菌的5％～15％。(一)傳統(tǒng)手工血培養(yǎng)檢驗方法1．培養(yǎng)及轉種：將血液或骨髓標本注入培養(yǎng)瓶(培養(yǎng)瓶系實驗室自行配制或成品血培養(yǎng)瓶)。置于35℃恒溫箱內，每日觀察并記錄培養(yǎng)瓶的變化，包括肉湯混濁度、沉淀、菌膜、溶血、色素等，雙相培養(yǎng)瓶肉湯如有異常，或瓊脂斜面上有菌苔、菌落出現(xiàn)，應及時涂片、革蘭染色鏡檢，并根據(jù)涂片的細菌形態(tài)與染色性選擇相應的分離培養(yǎng)基進行轉種。轉種培養(yǎng)基分別為血平板、巧克力平板、麥康凱、沙保弱、高滲平板等。通常肉湯培養(yǎng)72．如為厭氧培養(yǎng)瓶：則瓶內含85％N2、10％CO2、5％H2，厭氧瓶為密閉型，需逐日觀察瓶內肉湯的變化，若需氧瓶無變化，厭氧瓶肉湯有變化，即可考慮有厭氧菌生長，應進行涂片及轉種厭氧血平板后置厭氧環(huán)境進行分離培養(yǎng)，應注意避免氧氣進入培養(yǎng)瓶。3．適當運用盲轉法可提高陽性率：血培養(yǎng)12小時后如無明顯變化，可盲轉1次，同時涂片革蘭染色鏡檢，可提高陽性率。4．血培養(yǎng)的三級報告方式。(1)一級報告：血及骨髓培養(yǎng)當觀察到疑有細菌生長時，應以無菌操作方式挑取培養(yǎng)液進行涂片，革蘭染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)有菌生長并排除污染菌時，應立即將肉湯轉種血平板和巧克力平板；厭氧菌轉種厭氧血平板，進行需氧和厭氧培養(yǎng)及藥敏試驗，并將鏡檢結果、細菌形態(tài)及染色性報告臨床醫(yī)師，以供初步選擇使用抗菌藥物。(2)二級報告：轉種平板培養(yǎng)結果于8～12小時，或獲初步鑒定和藥物敏感試驗報告，應立即通知臨床醫(yī)師，此為二級報告。(3)三級報告：將分離菌最終鑒定和藥敏試驗結果與初級報告比對，作出最終正式報告，通知臨床以檢查用藥正確與否或更改治療方案。(4)不同目的菌的報告時間：一般細菌培養(yǎng)7天無菌生長可發(fā)出報告；厭氧菌應培養(yǎng)2周發(fā)出報告；亞急性細菌性心內膜炎、布魯菌、真菌血培養(yǎng)及鉤端螺旋體如7天為陰性可繼續(xù)培養(yǎng)，延至4周發(fā)出報告。(二)自動血培養(yǎng)系統(tǒng)的培養(yǎng)方法1．將血液或骨髓標本注入商品血培養(yǎng)瓶中，置于自動血培養(yǎng)儀進行培養(yǎng)，不同培養(yǎng)儀通過不同原理可監(jiān)測出培養(yǎng)液的變化，隨時發(fā)出警鈴告示。2．用無菌注射器將報警之培養(yǎng)液抽出并轉種血瓊脂平板和巧克力平板或厭氧血平板，35℃孵育，同時作涂片鏡檢和直接藥敏試驗，再按三級報告程序進行，厭氧培養(yǎng)按厭氧3．若在預定期限未出現(xiàn)陽性結果，可發(fā)出陰性結果報告。(三)特殊細菌培養(yǎng)方法1．分支桿菌血培養(yǎng)：可用特殊培養(yǎng)基接種血標本、BACTEC13A培養(yǎng)基為分離血液中分支桿菌的專用培養(yǎng)基，采血量為5ml；此外，使用裂解一離心技術、BACTEC12B、Bact/A-1ert(r)MP2．L型細菌血培養(yǎng)：將血液標本注入高滲培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，可分離出細胞壁缺陷病原菌(即L型細菌)。3．真菌血培養(yǎng)：使用需氧血培養(yǎng)瓶、雙相培養(yǎng)基、裂解一離心技術或腦心浸液肉湯均可分離到血液中的真菌，一般念珠菌培養(yǎng)5～7天即可生長，陰性結果應于22～30℃孵育44．苛養(yǎng)菌培養(yǎng)：對疑為某些營養(yǎng)要求苛刻、生長速度遲緩的革蘭陰性桿菌(如嗜沫嗜血桿菌、伴放線桿菌、金氏桿菌、軍團菌、布魯菌等)引起的心內膜炎血培養(yǎng)標本，主張延長培養(yǎng)時間至2～4周，并轉種特殊營養(yǎng)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。5．營養(yǎng)變異鏈球菌：該菌需在含有巰醇復合物和維生素B6。培養(yǎng)基中生長，因此傳代培養(yǎng)中宜補充0.001％鹽酸一吡哆醛和0.05％～0.1％L型半胱氨酸促進生長；也可將培養(yǎng)物轉種于血瓊脂平板上，然后交叉畫線接種金黃色葡萄球菌ATCC25923(因其為室內質控標準株，易于獲得且較穩(wěn)定)，在金黃色葡萄周圍可見營養(yǎng)變異鏈球菌衛(wèi)星樣生長菌落。八、臨床意義正常人血液和骨髓是無菌的，血液與骨髓培養(yǎng)對血液感染的診斷具有非常重要的意義，被稱為金標準。由于現(xiàn)代醫(yī)學的飛速發(fā)展，各種高效廣譜抗生素的廣泛應用、耐藥菌株不斷產(chǎn)生和播散、醫(yī)院感染率不斷上升，血培養(yǎng)分離菌的種類及數(shù)量不斷增加，條件致病菌和非致病菌也可引起免疫功能低下者嚴重的血液感染，除需氧菌、厭氧菌、真菌菌血癥外，有6％～15％的菌血癥為復數(shù)菌感染，長期使用抗生素者還會出現(xiàn)L型細菌感染，因此，臨床微生物工作者應熟知感染菌變遷的動向，準確、快速地培養(yǎng)和鑒定出血液感染菌，并與臨床醫(yī)師經(jīng)常溝通，共同研討最佳抗感染化療方案，提高臨床治療水平。一般在排除外界污染，標準的無菌操作下，血液和骨髓培養(yǎng)分離菌應為血液感染病原菌，可根據(jù)藥物敏感試驗結果選擇敏感抗生素進行治療，選藥原則為選用敏感性高、價格合理、副作用小的藥物治療。九、血液感染常見病原菌血液與骨髓培養(yǎng)常見病原菌分為革蘭陽性菌和革蘭陰性菌兩大類型。(一)革蘭陽性菌1．革蘭陽性球菌：金黃色葡萄球菌(多為甲氧西林耐藥菌株)、凝固酶陰性葡萄球菌(多為甲氧西林耐藥菌株)、腸球菌、A群鏈球菌、B群鏈球菌、草綠色鏈球菌、肺炎鏈球菌等。2．革蘭陽性桿菌：產(chǎn)單核李斯特菌、分支桿菌(包括非典型結核桿菌)、炭疽芽孢桿菌等。(二)革蘭陰性菌1．革蘭陰性球菌：腦膜炎奈瑟菌、卡他莫拉菌等。2．革蘭陰性桿菌：傷寒沙門菌、非傷寒沙門菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌、氣單胞菌、沙雷菌等。銅綠假單胞菌、不動桿菌屬、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌、流感嗜血桿菌等。(三)真菌白色念珠菌、其他念珠菌、曲霉菌、毛霉菌等。(四)厭氧菌擬桿菌屬、具核梭桿菌、丙酸桿菌、消化球菌、韋榮球菌等。第二節(jié)痰標本細菌學檢測一、采集指征有下列體征之一，應進行痰培養(yǎng)：1．咳嗽、咳痰、痰液為膿性、血性、鐵銹色或紅棕色膠凍樣痰。2．咯血：包括泡沫血痰、鮮血和痰中帶血等。3．呼吸困難、呼吸急促或哮喘，常伴有胸痛。4．發(fā)熱伴白細胞增高尤其是中性粒細胞或CRP明顯增高。5．胸部影像學檢查提示有感染可能。二、采集方法1．自然咳痰法：患者清晨起床后，用清水反復漱口后用力自氣管咳出第一口痰于無菌容器內，立即送檢。痰液較深不易咳出時，可在咳痰前扣背協(xié)助排痰。對于痰量少或無痰的患者可采用霧化吸入加溫至45℃的10％NaC12．小兒取痰法：用彎壓舌板向后壓舌，將無菌棉拭子伸人咽部，小兒經(jīng)壓舌刺激咳嗽時，可噴出肺部或氣管分泌物粘在拭子上。對咳痰量少的幼兒，可輕輕壓迫胸骨上部的氣管，使其咳嗽。3．支氣管鏡采集法：用支氣管鏡在肺內病灶附近用導管吸引或用支氣管刷直接取得標本。4．氣管切開者取痰法：消毒氣管套管口，以無菌吸痰管插入氣管抽吸痰液，注入無菌試管立即送檢。具體操作方法：①打開一次性吸痰管，接好負壓吸引器；②用左手拇指將接頭外折曲堵住并持吸痰管，右手持無菌鑷夾持吸痰管；③將吸痰管送到氣管最深處，刺激患者咳嗽，開放負壓吸引；④左手拇指松開吸引，見痰液吸入吸痰容器中時，左手拇指迅速將接頭折曲堵住；⑤拔出吸痰管，脫開吸引器接頭；⑥將痰液容器上與吸痰管連接的蓋子取下，將底部的蓋子蓋上；⑦在容器上注明患者姓名和科室后，立即送檢。三、標本運送痰標本采集后應立即送檢，常規(guī)培養(yǎng)不超過2小時，送實驗室后立即接種。四、注意事項1．采集標本以清晨為佳，為減少口腔正常菌群污染標本，采集前應先用漱口液充分漱口。2．在應用抗菌藥物之前采集標本。3．做結核分支桿菌和真菌培養(yǎng)的標本不能及時送檢的，可放4℃4．肺部感染的患者有25％～50％可能發(fā)生菌血癥，應同時做血培養(yǎng)。5．采集標本時應戴口罩和手套，避免交叉感染。五、檢驗方法．(一)細菌形態(tài)學檢查將痰標本涂片后待干、固定、染色，或直接濕片鏡檢，對病原學早期、初步診斷有價值。濕片直接鏡檢以相差顯微鏡觀察效果好，對于一些特定的病原菌如軍團菌、結核分支桿菌則用熒光顯微鏡檢測為佳。一般認為合格的痰標本應是含白細胞、膿細胞和支氣管柱狀上皮細胞較多，而受污染的痰標本則是來自頰黏膜的扁平鱗狀上皮細胞較多。以白細胞＞25個/低倍鏡視野，而鱗狀上皮細胞＜10個/低倍鏡視野為合格標本。采集合格標本對細菌的診斷尤為重要。1．一般細菌涂片檢查：進行革蘭染色鏡檢，根據(jù)著色、形態(tài)及排列大致可以初步推斷菌屬(或種)，如見到革蘭陽性球菌、呈堆(葡萄狀)排列，疑似葡萄球菌；如見到瓜子形態(tài)、矛頭狀、尖端相背的成雙排列、可有莢膜的革蘭陽性球菌疑似肺炎鏈球菌等，可發(fā)出初步報告。2．結核桿菌涂片檢查：抗酸染色后，根據(jù)所見結果報告找到(或未找到)抗酸桿菌。3．放線菌以及奴卡菌涂片檢查：將痰液用生理鹽水反復洗滌數(shù)次，如含血液則加蒸餾水溶解紅細胞，挑取黃色顆粒(硫磺顆粒)或不透明的著色斑點，置玻片上加壓并覆以蓋玻片，高倍鏡下觀察其結構，如見中央為交織的菌絲，其末端粗桿形呈放線狀排列時揭去蓋玻片，干后做革蘭及抗酸染色鏡檢。如查見中央部分菌絲為革蘭陽性，而四周放射的末梢菌絲為革蘭陰性，抗酸染色為非結核性者，可報告找到疑似放線菌。如查見革蘭染色反應與放線菌相同，但抗酸染色為弱抗酸性，可報告找到疑似奴卡菌。4．厭氧菌涂片檢查：涂片染色同一般細菌，鏡檢時注意有芽孢的革蘭陽性桿菌可能是梭狀芽孢桿菌屬；如見芽孢部位菌體不膨大，排列呈竹節(jié)狀，要注意炭疽芽孢桿菌；兩端尖的革蘭陽性桿菌可能為梭狀芽孢桿菌；如為革蘭陰性無芽孢桿菌，伴痰有惡臭，可能有擬桿菌?？傊鶕?jù)細菌的著色、形態(tài)、排列做出初步診斷。(二)細菌分離培養(yǎng)與鑒定1．一般要求：下呼吸道感染培養(yǎng)的細菌濃度應≥107cfu/ml，可視為病原菌，＜104cfu/ml可視為污染菌。若介于兩者之間如105～106cfu/ml時，要連續(xù)分離培養(yǎng)兩次以上仍為105～106cfu/ml時，也認為是病原菌。2．痰培養(yǎng)標本的前處理：一般是用無菌生理鹽水將痰洗滌3次，主要是洗去痰中的常居菌，然后向痰液中加入等量的(pH值7.6)1％胰酶溶液，放置37℃90分鐘，即可使痰3．普通細菌培養(yǎng)：將處理后的膿痰接種于血瓊脂、中國藍瓊脂平板、巧克力瓊脂平板上，分別放入普通和5％～10％CO2環(huán)境，35％18～24小時后觀察菌落特征并涂片行革蘭染色，根據(jù)菌體的形態(tài)、特點做出初步鑒定。4．結核分支桿菌培養(yǎng)：培養(yǎng)前先對痰中的雜菌進行處理后。將其接種于改良羅氏培養(yǎng)基，置35℃培養(yǎng)，一般第一周觀察2次，以后每周1次，觀察菌落出現(xiàn)的時間、形態(tài)，陽性結果隨時發(fā)出報告，陰性者65．嗜肺軍團菌培養(yǎng)：將均質化的標本接種于血瓊脂、巧克力瓊脂和BCYE瓊脂平板上，置35℃5％CO2環(huán)境中培養(yǎng)。若在上述培養(yǎng)基中24小時內有細菌生長，此菌則不是軍團菌。如在BCYE平板上486．厭氧菌培養(yǎng)：將采集的厭氧菌標本接種于厭氧培養(yǎng)基，生長后將細菌進行鑒定，發(fā)出報告。六、臨床意義痰及下呼吸道標本的細菌學檢驗對于某些疾病的診斷具有很重要的意義。1．細菌性肺炎為下呼吸道感染最常見的類型，近年調查表明，原來由肺炎鏈球菌所致肺炎仍為常見，由流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、MRSA和革蘭陰性桿菌所致肺炎比例明顯上升，軍團菌肺炎也引起了人們的重視。在醫(yī)院感染中，革蘭陰性桿菌占50％以上而成為主要病原體，一些條件致病菌和耐藥菌成為醫(yī)院內肺炎的主要致病菌。2．真菌性肺炎是致病性真菌和條件致病性真菌所引起。目前以條件致病性真菌感染致病為主，并呈上升趨勢，常見菌以白色假絲酵母菌為主，毛霉菌、曲霉菌和隱球菌也常見。真菌性肺炎常合并其他多種細菌感染，患者常由于使用大量抗生素而發(fā)生雙重感染，病情嚴重，給治療帶來困難。七、呼吸道感染常見病原菌呼吸系統(tǒng)感染的患者，檢出病原菌機會相當高，但是必須區(qū)分是病原菌還是上呼吸道的正常菌群，因為當機體抵抗力降低時，弱毒菌均可成為呼吸系統(tǒng)感染的重要病原菌，因此條件致病菌分離時尤應注意。結核桿菌如從痰中檢出，即可認為有臨床意義。關于病原菌的確定，一般認為，經(jīng)過洗凈法處理的痰培養(yǎng)，結果比較可靠。此外，亦可反復幾次檢查，分析比較，如多次分離到同一致病性比較弱的細菌也應考慮為病原菌。呼吸道常見病原菌如下。1．革蘭陽性菌：肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、厭氧鏈球菌、結核分支桿菌、放線菌、奴卡菌、白喉棒狀桿菌、炭疽桿菌。2．革蘭陰性菌：卡他莫拉菌、腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌、肺炎克雷伯菌、其他腸桿菌科細菌、假單胞菌屬細菌、嗜肺軍團菌、百日咳鮑特菌、擬桿菌。3．其他。肺炎支原體、奮森螺旋體、肺炎衣原體、假絲酵母菌。第三節(jié)尿液標本細菌學檢測一、采集指征有典型的尿路感染癥狀；肉眼膿尿或血尿；尿常規(guī)檢查表現(xiàn)為白細胞或亞硝酸鹽陽性；不明原因的發(fā)熱，無其他局部癥狀；留置導尿管的患者出現(xiàn)發(fā)熱；膀胱排空功能受損；泌尿系統(tǒng)疾病手術前。二、采集方法1．中段尿采集法：留取早晨清潔中段尿標本。女性：采樣前用肥皂水清洗外陰部，再用0.1％高錳酸鉀溶液沖洗外陰部尿道口，滅菌紗布擦拭，用手指將陰唇分開排尿，棄去前段尿，留取中段尿10ml于無菌容器中，加蓋立即送檢。男性：翻轉包皮，用肥皂水清洗尿道口，后用清水沖洗，棄取前段尿，留取中段尿約5～10ml于無菌容器中，加蓋立即送檢。2．恥骨上膀胱穿刺：先對穿刺部位進行皮膚消毒，然后使用無菌注射器直接從恥骨上穿人膀胱吸取尿液，主要用于厭氧菌培養(yǎng)或留取標本困難的嬰兒尿標本的采集。3．直接導尿法：按常規(guī)方法對會陰部進行消毒后，用導尿管直接經(jīng)尿道插入膀胱，先讓尿流棄15ml再留取培養(yǎng)標本。4．留置導尿管收集尿液：用75％的酒精消毒導管接口，用注射器穿刺導尿管抽取5～10ml尿液，置于無菌容器中送檢；或拔去閉式引流的集尿袋，75％的酒精消毒接口后棄去導尿管前段尿液，留無污染的膀胱內尿液送檢。三、標本運送標本采集后，應立即送檢。膀胱穿刺做厭氧培養(yǎng)時，應避免接觸空氣，針頭插上滅菌橡皮塞，立即送檢。尿液如不能立即送檢者，則必須保存于4℃冰箱，時間不超過6四、注意事項1．采集尿液標本應在使用抗菌藥物之前進行，防止藥物對細菌的抑菌作用。2．應取清晨第一次尿液送檢。3．尿液采集應嚴格進行無菌操作，防止污染。4．采集時應注意不要讓外陰消毒劑混入標本，引起抑菌后果。5．對留置導尿者，不可從集尿袋的下端管口留取標本。五、檢驗方法(一)涂片法1．一般細菌涂片：以無菌操作取尿液10ml左右放入無菌試管中，經(jīng)3000r/min離心15分鐘，棄去上清液，取沉渣涂片，進行革蘭染色，如發(fā)現(xiàn)革蘭陽性或革蘭陰性菌，可根據(jù)細菌的染色性和形態(tài)，作出初步報告。2．假絲酵母菌檢查：取尿液離心沉淀物置于清潔玻片上，加蓋玻片后用高倍鏡觀察，若沉渣太多，可滴加10％的NaOH，使沉渣溶解后再鏡檢，或制成涂片革蘭染色油鏡檢查，如發(fā)現(xiàn)革蘭陽性卵圓形芽生孢子或假菌絲，即可作出初步報告。3．淋病奈瑟菌檢查：取尿液沉淀物置于清潔玻片上，制成涂片，革蘭染色，油鏡檢查，如發(fā)現(xiàn)革蘭陰性雙球菌，呈腎型，存在于細胞內或細胞外，即可作出初步報告。4．結核分支桿菌檢查：取尿液10ml左右經(jīng)3000r/min離心30分鐘，取沉渣涂片，進行萋一納及潘本漢染色，若兩種涂片均查見紅色桿菌，即報告“找到結核分支桿菌”，如萋一納染色找到紅色桿菌，而潘本漢染色中未發(fā)現(xiàn)紅色桿菌，則為恥垢分支桿菌，也可用金胺“0”熒光法進行染色后(二)培養(yǎng)檢查1．一般細菌培養(yǎng)：用無菌接種環(huán)取尿液接種于血瓊脂平板和麥康凱Macc(或中國藍EMB)平板上，35℃培養(yǎng)18～24小時，觀察結果，根據(jù)菌落形態(tài)特征及涂片鏡檢結果，選擇相應方法作進一步鑒定，如培養(yǎng)482．特殊細菌培養(yǎng)。(1)淋病奈瑟菌培養(yǎng)：尿標本收到后立即接種于預溫35℃的巧克力瓊脂平板，置35℃5％～10％CO(2)結核分支桿菌培養(yǎng)：將尿液接種于血瓊脂平板上，35℃培養(yǎng)18～24小時后無細菌生長，可將尿液3000r/min離心30分鐘后取沉淀物0.1ml(3)假絲酵母菌培養(yǎng)：將尿液接種沙保弱瓊脂平板上，25～30℃(4)厭氧菌培養(yǎng)：用穿刺尿進行培養(yǎng)，接種厭氧血瓊脂平板，厭氧環(huán)境中培養(yǎng)。(三)定量培養(yǎng)1．平板接種法：用定量加樣器取5ml尿液滴注在瓊脂平板上，用接種環(huán)涂抹均勻，35℃培養(yǎng)24小時，生長的菌落數(shù)乘以200，即為每ml2．定量接種環(huán)法：用定量接種環(huán)蘸取尿液標本(10μl)在血瓊脂平板上作均勻畫線接種，置35℃培養(yǎng)24小時，計數(shù)生長的菌落數(shù)乘以100，即為每ml尿中細菌數(shù)，若平板上菌落數(shù)超過1000個，則報告：菌落數(shù)＞105cfu/ml3．傾注平板法：取被檢尿液0.1ml，加入9.9ml無菌生理鹽水中充分混勻，取此液1ml放入直徑為9cm的無菌平皿內，同時加入已融化并冷卻至50℃的瓊脂培養(yǎng)基與尿液混勻，凝固后置35℃培養(yǎng)24小時，計數(shù)生長菌落乘以100六、臨床意義尿液細菌學檢驗對腎臟、輸尿管、膀胱、尿道、前列腺等處的炎癥變化具有診斷價值，隨著抗生素的應用，可通過藥敏試驗幫助臨床醫(yī)師合理選擇抗菌藥物，減少因用藥不當而造成的耐藥菌株的增加。目前一般認為采取清潔中段尿，診斷泌尿道感染的細菌數(shù)標準是：菌落數(shù)＞105cfu/ml。但由于某些原因的影響：如使用過抗菌藥物、使用過利尿劑或尿頻、采尿時外陰消毒液混入尿中或病原菌生長營養(yǎng)要求較高，使細菌繁殖受抑制等原因，菌落數(shù)在105cfu/ml以下，也不能完全排除尿路感染。七、尿道感染常見病原菌引起尿道感染的常見病原菌如下。1．革蘭陰性菌：大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、腸桿菌、沙雷菌、變形桿菌、普羅威登斯菌屬等的菌種、陰道加德納菌、銅綠假單胞菌、不動桿菌屬、淋病奈瑟菌。沙門菌、志賀菌較少見。2．革蘭陽性菌：金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、腸球菌、β-溶血鏈球菌(通常為B群、A群、D群)、厭氧鏈球菌、結核桿菌。3．其他細菌：假絲酵母菌。第四節(jié)膿液標本細菌學檢測一、采集指征1．軟組織的急性化膿性炎癥：當局部有紅、腫、熱、痛和功能障礙等典型癥狀時，可能存在化膿性感染，但局部癥狀隨病程的遲早、病變范圍、位置深淺而不同。如癤、癰、急性蜂窩織炎、丹毒等。2．化膿性疾?。喝缂诇涎住⒒撔躁P節(jié)炎、化膿性骨髓炎、氣性壞疽、細菌性結膜炎、鼻竇炎、化膿性扁桃體炎、急性化膿性中耳炎、急性化膿性乳突炎、急性乳房炎、急性膽囊炎、急性梗阻性化膿性膽管炎、心包炎、結核性腹膜炎等。3．膿腫：扁桃體膿腫、咽部膿腫、咽旁膿腫、腦膿腫、肺膿腫、肝膿腫、膿胸、腹腔膿腫、腎皮質化膿性感染、腎周圍炎和腎周膿腫、直腸肛管周圍膿腫。4．創(chuàng)傷感染：術后切口感染、導管感染、臍帶殘端感染。二、標本采集1．開放性感染和已潰破的化膿灶：外傷性感染、癌腫潰破感染、臍帶殘端、外耳道分泌物等感染部位與體腔或外界相通，標本采集前先用無菌生理鹽水沖洗表面污染菌，用無菌拭子采取膿液及病灶深部的分泌物，置無菌試管內送檢。注意盡量取化膿組織與正常組織交界處的膿汁，因為膿汁中心的細菌大部分已死亡，交接處的活菌較多，會提高陽性率。開放病灶不能做厭氧培養(yǎng)。2．閉鎖膿腫：一般采用穿刺或手術引流的方法采取。采集前先用1％活力碘和75％的酒精消毒周圍皮膚后，用無菌注射器抽取膿液送檢；也可于切開排膿時用無菌注射器或棉拭子采樣。盛于無菌容器內或厭氧運送系統(tǒng)送檢。3．抽取液體：包括胸腔積液、腹腔積液、盆腔積液、關節(jié)腔積液、膽汁、心包積液等，首先消毒皮膚，然后在手術引流時或經(jīng)穿刺術抽取標本，注入血培養(yǎng)瓶或無菌容器或厭氧運送系統(tǒng)送檢。三、標本運送標本盛于無菌容器內或厭氧運送系統(tǒng)，室溫下15分鐘內送檢，最長不超過2小時送達實驗室。四、注意事項1．盡可能在用藥前采集標本。如患者在采集標本前已用藥，請在檢驗申請單上注明，檢驗人員可在培養(yǎng)基內加入相應拮抗物，以利于提高陽性檢出率。2．采集標本時應注意膿汁及分泌物的性狀、顏色及氣味，為分離鑒定致病菌提供依據(jù)。3．疑有某種細菌感染，若該細菌對干燥敏感，用無菌棉拭子采集標本后，應立即放入液體培養(yǎng)基內；或采標本前先將無菌棉拭子沾少許肉湯以保持標本濕度。4．不能立即送檢的標本，應放4℃5．深部膿腫常由包括厭氧菌在內的混合細菌感染所致，采集標本應遵守厭氧菌感染標本的采集原則。五、檢驗方法(一)涂片檢查1．革蘭染色檢查：分泌物或膿液涂片可以為單一菌種，也可為混合菌種，應注意是否有厭氧菌?？蓤蟾妗罢业礁锾m陰(陽)性菌，形態(tài)可能為××菌”。2．抗酸染色檢查：有些感染可能是結核桿菌引起的，直接抗酸染色有助于初步診斷，此外有利于發(fā)現(xiàn)奴卡菌和放線菌。(二)細菌培養(yǎng)1．普通細菌培養(yǎng)：取膿汁棉拭子或膿汁接種血平板上畫線分離，置35℃培養(yǎng)18～24小時，觀察結果，如有菌落生長，根據(jù)涂片染色特點和菌落特征初步判斷細菌的類屬，然后再按其生物學特性進行鑒定。如培養(yǎng)48～722．厭氧菌培養(yǎng)：取膿汁棉拭子或膿汁接種厭氧血瓊脂平板，厭氧環(huán)境中培養(yǎng)。3．苛氧菌培養(yǎng)：取膿汁棉拭子或膿汁接種沙保弱瓊脂平板上，25～30℃4．結核分支桿菌培養(yǎng)：取膿汁棉拭子或膿汁接種于血瓊脂平板上，35％培養(yǎng)18～24小時后無細菌生長，再將沉淀物接種在羅氏培養(yǎng)基上。5．真菌培養(yǎng)：取膿汁棉拭子或膿汁接種沙保弱瓊脂平板上，25～30℃6．以色列放線菌和星型奴卡菌培養(yǎng)：采取“硫磺樣顆?！被蚰撃[液接種于硫乙醇酸鈉肉湯或深層葡萄糖肉湯瓊脂培養(yǎng)基，置35℃厭氧培養(yǎng)，同時接種沙保弱葡萄糖瓊脂斜面，置22～28℃培養(yǎng)。經(jīng)過4天培養(yǎng)后，若在厭氧培養(yǎng)的葡萄糖肉湯瓊脂平板上有白色、粗糙、或結節(jié)狀的菌落，黏附于培養(yǎng)基上不易用接種環(huán)取下，且在鹽水中不易乳化，而在需氧培養(yǎng)的平板上無類似菌落生長時，可疑為以色列放線菌。如有奴卡菌生長，則在需氧培養(yǎng)的沙保弱培養(yǎng)基上出現(xiàn)光滑、不規(guī)則折疊或顆粒狀的菌落，具有黃色至橙黃色的顏色，取菌落作濕片鏡檢，如發(fā)現(xiàn)精細分支狀菌絲，革蘭染色陽性，抗酸染色弱陽性的菌絲，可報告“有奴卡菌生長六、臨床意義所有創(chuàng)傷均可有細菌污染，但不一定發(fā)生感染，細菌學檢查局部細菌的控制是有價值的。同時對導致傷口感染、膿腫形成的病原學診斷有重要意義。確定常居菌是否為創(chuàng)傷感染的病原菌時，要注意該菌是否在數(shù)量上占優(yōu)勢。目前臨床上區(qū)分創(chuàng)傷感染或污染，主要看細菌向活組織深部侵入程度及每克組織含細菌量是否達到定閾值。一般認為每克組織內細菌數(shù)量在105～106個以上時即可造成傷口感染。淺部軟組織膿腫多由表皮葡萄球菌感染，而大的和嚴重的膿腫多由金黃色葡萄球菌感染引起，大腸埃希菌及乙型溶血性鏈球菌也可引起化膿性感染。由外傷性、血源性或鄰近組織病灶直接蔓延所致的急性化膿性骨關節(jié)炎常由金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、淋病奈瑟菌、肺炎鏈球菌或傷寒沙門菌感染所致。慢性化膿性骨關節(jié)炎可由與急性期相同的病原菌引起，也可由結核分支桿菌引起，以結核分支桿菌引起的感染較常見?？赏ㄟ^涂片抗酸染色和分支桿菌培養(yǎng)確定病原學診斷，由金黃色葡萄球菌感染的骨髓炎的致病菌占80％～90％，乙型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、厭氧菌、大腸埃希菌和沙門菌的感染也有報道。由外傷性創(chuàng)傷引起的化膿性膽囊炎，幾乎都有細菌污染的可能，同時大多數(shù)會發(fā)生不同程度的感染，以葡萄球菌和鏈球菌多見。深部外傷和骨折，由于有塵?；虍愇镂廴荆瑯O易發(fā)生破傷風和氣性壞疽等厭氧菌感染。通過穿刺或手術采集膿液進行細菌學檢查可作出病原學診斷，也有利于臨床治療措施的制定。七、膿腫、傷口感染常見病原菌引起傷口、軟組織感染的常見病原菌。1．革蘭陰性菌：大腸埃希菌、克雷伯菌、腸桿菌、變形桿菌、假單胞菌屬、沙雷菌等陰性桿菌及卡他莫拉菌、淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌等陰性球菌。2．革蘭陽性菌：破傷風芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌、腸球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、類白喉棒狀桿菌、結核分支桿菌等陽性桿菌及金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、肺炎鏈球菌、四聯(lián)球菌、消化球菌、消化鏈球菌等陽性球菌。3．其他細菌：假絲酵母菌、以色列放線菌、星型奴卡菌等。第五節(jié)糞便標本細菌學檢測一、采集指征當腹瀉患者出現(xiàn)以下任何一種情況時建議采集糞便標本，進行細菌培養(yǎng)：糞便涂片鏡檢白細胞≥5個/HP；重癥腹瀉；T＞38.二、標本采集(一)標本采集時間在發(fā)病早期和使用抗菌藥物治療前，不同時間采集2～3個標本可以提高致病菌的檢出率。沙門菌感染，腸熱癥在2周以后；胃腸炎患者在急性期，早期采集新鮮糞便。(二)采集方法1．自然排便采集法：自然排便后，挑取有膿血、黏液部分的糞便1～3g，液狀糞便則取絮狀物1～3ml盛于無菌容器內送檢。2．直腸拭子法：如不易獲得糞便時或排便困難的患者及幼兒，可用肥皂水將肛門周圍洗凈，用蘸有無菌生理鹽水的棉拭子插入肛門，成人約4～5cm，兒童約2～3三、標本運送1．糞便標本應盡快送檢，室溫下不能超過2小時。2．直腸拭子采集的標本必須放入送檢培養(yǎng)基或GN肉湯中送檢，轉運時間不超過2小時。3．霍亂弧菌感染高度可疑標本的運送必須符合特殊標本的安全要求。4．直腸活檢標本容器內盛少量無菌生理鹽水以防沉淀。四、注意事項1．雖糞便含有多種雜菌，但應盡量采用無菌容器。2．為提高檢出率，要采集新鮮糞便作培養(yǎng)。3．腹瀉患者應盡量在急性期采集標本(3天)以內，以提高陽性率。4．標本最好在使用抗菌藥物前采集。5．用于厭氧培養(yǎng)的標本應盡量避免與空氣接觸，最好在床邊接種。五、檢驗方法(一)直接涂片檢查糞便標本因各種正常菌群含量甚多，僅從細菌的染色性和形態(tài)無法分辨是否為病原菌，只有少數(shù)細菌，如霍亂弧菌、結核分支桿菌、難辨梭菌、葡萄球菌以及假絲酵母菌才做直接涂片檢查。1．霍亂弧菌涂片檢查。(1)染色檢查：糞便通常為米泔樣，取新鮮標本涂片2張，用乙醇或甲醇固定，分別作革蘭染色及1∶10稀釋的苯酚復紅染色，用油鏡檢查，觀察有無革蘭陰性，呈魚群樣排列的桿狀或弧形菌。(2)懸滴(壓滴)檢查：取糞便制成懸滴(壓滴)標本，檢查細菌的動力，霍亂弧菌古典生物型和El-Tor生物型均呈穿梭狀運動。在懸滴涂片中加入O1群或O139群霍亂弧菌診斷血清后，在顯微鏡下觀察，若原運動活潑的現(xiàn)象停止，為制動試驗陽性?？沙醪綀蟾鏋椤耙伤芆1群霍亂弧菌”。申報上級衛(wèi)生機構作出處理，并做好患者消毒隔離工作。2．葡萄球菌涂片檢查：疑似葡萄球菌偽膜性腸炎患者，取水樣便或腸黏膜樣物涂片，革蘭染色后鏡檢，可見革蘭陰性桿菌明顯減少，有大量革蘭陽性球菌散在或成堆(葡萄狀)排列。3．難辨梭菌涂片檢查：取新鮮糞便涂片，革蘭染色后鏡檢可見革蘭陽性粗大桿菌，無莢膜，大多能形成卵圓形芽孢位于菌體一端，可初步報告為“找到革蘭陽性芽孢桿菌，疑似難辨梭菌”。4．結核分支桿菌涂片檢查：取蠶豆大小糞便與飽和生理鹽水10～15ml混合，靜置1～2小時，取浮面液體涂片作抗酸染色，若找到紅色桿菌可報告“找到抗酸桿菌”。5．空腸彎曲菌涂片檢查：將糞便涂片作革蘭染色，可見細小、長而彎曲的革蘭陰性弧形、S形、螺旋形、成海鷗狀的細菌，可作初步報告疑似彎曲菌。6．假絲酵母菌涂片檢查：將糞便制成壓滴標本，高倍鏡觀察可發(fā)現(xiàn)光亮的卵圓形孢子或假菌絲。涂片革蘭染色可見革蘭陽性瓜子形狀的孢子或假菌絲。若僅見到孢子則報告找到革蘭陽性卵圓形芽生真菌孢子，同時還有假菌絲則可報告檢出假絲酵母菌。(二)培養(yǎng)檢查1．一般細菌培養(yǎng)：取糞便接種于血瓊脂平板，EMB(或MACC)瓊脂平板，經(jīng)35℃培養(yǎng)18～242．特殊細菌培養(yǎng)。(1)霍亂弧菌。1)直接分離培養(yǎng)：將疑似霍亂弧菌感染的標本除增菌外，同時接種慶大霉素平板(或TCBS平板)35℃培養(yǎng)16～18小時(增菌管6～82)增菌后分離培養(yǎng)：一般情況下將標本直接接種堿性胨水增菌，于35℃培養(yǎng)6～8小時轉種慶大平板進行分離鑒定，必要時可作2(2)副溶血弧菌：將標本接種于副溶血弧菌增菌液中，同時接種血平板和TCBS平板，35℃培養(yǎng)18～24(3)小腸結腸炎耶爾森菌：將標本接種于小腸結腸炎耶爾森菌培養(yǎng)基(NYE)中，22～25qC培養(yǎng)48小時。(4)艱難梭菌：將標本立即接種CCFA(環(huán)絲氨酸一甲氧頭孢菌素一果糖瓊脂)平板上，或將標本作10-6～10-2稀釋后定量分離培養(yǎng)，厭氧環(huán)境30～37℃培養(yǎng)48(5)空腸彎曲菌：接種于彎曲菌選擇培養(yǎng)基(camy-BA血瓊脂)；或接種CEM增菌液(經(jīng)42℃微需氧培養(yǎng)24～48小時后，再接種上述選擇培養(yǎng)基上)，在微需氧條件下培養(yǎng)，最好采用混合氣體(85％N2、10％CO2、5％O2)的方法，培養(yǎng)24～48(6)結核分支桿菌：將糞便標本首先進行培養(yǎng)前處理，然后接種羅氏培養(yǎng)基，置35℃培養(yǎng)6～8(7)假絲酵母菌：將標本接種于含氯霉素的沙保弱瓊脂和血瓊脂平板上置25～30℃和35℃培養(yǎng)24～3．菌群失調及菌群交替癥細菌培養(yǎng)：正常菌群失調培養(yǎng)，應根據(jù)臨床提示選用多種培養(yǎng)基，包括強選擇和弱選擇性腸道菌培養(yǎng)基、需氧及厭氧血瓊脂平板、甘露醇食鹽瓊脂平板、Camp-BA平板、沙氏瓊脂平板等，將標本接種上述各平板，分別孵育，22％、35℃、42六、臨床意義腸道病原菌能引起人類感染性腹瀉，致病菌能夠破壞宿主的防御系統(tǒng)，侵襲人體組織，其產(chǎn)生的毒素能引起食物中毒。長期應用抗菌藥物能導致菌群紊亂而引起嚴重腹瀉，因此，糞便培養(yǎng)能為臨床及早作出診斷提供依據(jù)。七、腸道感染常見病原菌人類腸道中細菌繁多，種類亦多。在健康人腸道內經(jīng)常寄居著大量的厭氧菌和小部分的兼性厭氧菌。腸道中細菌種類受食物的影響，除人乳喂養(yǎng)的嬰兒腸道內以革蘭陽性菌為主外，其余的人腸道內均以革蘭陰性菌占優(yōu)勢。這些細菌一般不引起疾病，一旦腸道發(fā)生病理改變時，就可能侵入病變部位引起疾病。常見病原菌如下。1．革蘭陰性菌：沙門菌、志賀菌、致病性大腸埃希菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌、氣單胞菌、鄰單胞菌、小腸結腸炎耶爾森菌、空腸彎曲菌、銅綠假單胞菌、遲緩愛德華菌。2．革蘭陽性菌：金黃色葡萄球菌、難辨梭菌、腸球菌、厭氧鏈球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌。3．其他細菌：假絲酵母菌、結核分支桿菌。第六節(jié)腦脊液標本細菌學檢測一、采集指征1．成人：發(fā)熱、頭痛、惡心、嘔吐、頸強直和反射增強等癥狀，懷疑為腦膜炎的患者。2．兒童：因兒童和新生兒的臨床表現(xiàn)不明確和無特異性，因此對于嬰兒不明原因發(fā)熱，應懷疑為腦膜炎，采集腦脊液。3．具有下列實驗室檢查之一。(1)腦脊液的白細胞增加，蛋白質升高，葡萄糖減少。(2)腦脊液革蘭染色發(fā)現(xiàn)微生物。(3)血培養(yǎng)陽性。(4)腦脊液、血液、尿液標本對某種病原體抗原反應呈陽性。(5)血清抗體滴度有意義的增加。二、采集方法用腰穿方法采集腦脊液3～5ml。患者應先禁食，由醫(yī)師以無菌操作在患者第3和第4腰椎間隙或稍低處穿刺取得，小兒則于第4和第5腰椎間隙穿刺，裝入無菌試管，立即送檢。如果用于檢測細菌或病毒，腦脊液量應≥1ml，如果用于檢測真菌或抗酸桿菌，腦脊液量應≥2ml。三、標本運送1．如果用于檢測細菌，收集腦脊液后，在常溫下15分鐘內送到實驗室。腦脊液標本不可置冰箱保存，否則會使病原菌死亡，尤其是腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌。2．如果用于檢測病毒，腦脊液標本應放置冰塊，在4℃15分鐘內送到實驗室。用于檢測病毒的腦脊液，在4℃可保存四、注意事項1．最好在使用抗生素之前采集標本。2．如果只采集到一管腦脊液而要做不同檢查，應首先送到微生物室。3．采集腦脊液的試管不需要加入防腐劑。4．進行腰穿過程中，嚴格無菌操作，避免污染。五、檢驗方法(一)涂片法因腦脊液是無菌的，只要檢出細菌即可診斷感染的類型，所以直接涂片很重要。1．革蘭染色：肉眼觀察，混濁或膿性腦脊液可直接涂片。無色透明的腦脊液，首先3000r/min離心10～15分鐘，用沉淀物涂片，革蘭染色，根據(jù)細菌形態(tài)，可初步提示感染細菌的種類。(1)檢查到革蘭陰性，凹面相對的球菌，細菌有時位于細胞內，有時位于細胞外。此時可報告臨床“找到革蘭陰性雙球菌，位于細胞內(外)，形似腦膜炎奈瑟菌”。(2)檢查到革蘭陽性，菌體周圍有明顯莢膜雙球菌，可報告“找到革蘭陽性雙球菌，形似肺炎鏈球菌”。(3)檢查到革蘭陰性，多形態(tài)、菌體大小不一，有桿狀或聳狀的細菌，可報告“找到革蘭陰性桿菌，形似流感嗜血桿菌”。(4)檢查到小的、規(guī)則的革蘭陽性桿菌，單獨或呈V形排列，出現(xiàn)于大量單核細胞之間者，可報告“找到革蘭陽性桿菌，形似產(chǎn)單核李斯特菌”。(5)檢查到革蘭陽性孢子或菌絲，可報告“找到真菌孢子或菌絲”。(6)檢查到上述以外的其他細菌，可報告“找到革蘭陽(陰)性球(桿)菌”。2．抗酸染色：4000r/min離心腦脊液30分鐘，取沉淀物作涂片，干燥、固定后，用萋納染色或金胺“0”3．墨汁染色：腦脊液離心3000r/min，10～15分鐘后，取沉淀物進行墨汁染色，顯微鏡下可在黑色背景中，見到菌體周圍有透明莢膜，似一暈輪，有時出芽，可報告“找到新型隱球菌”。(二)PCR方法1．由于嬰幼兒較難采到腦脊液，對腦膜炎的診斷有較大困難，用PCR技術檢測外周血，對腦膜炎奈瑟菌感染者的陽性率為100％，且不受抗生素藥物治療的影響。2．由于結核桿菌在腦脊液中數(shù)量較少，因此抗酸染色和培養(yǎng)的陽性率很低，且培養(yǎng)時間長，用PCR技術檢測結核桿菌DNA，檢出率高且快速，但要排除假陽性。(三)培養(yǎng)檢查1．一般細菌培養(yǎng)：將腦脊液離心后的沉淀物接種于血瓊脂平板(BA)、巧克力平板(CA)、巰基乙酸肉湯，CA置5％～10％CO2環(huán)境中，35℃培養(yǎng)18～24小時，觀察有無細菌生長。如果無細菌生長，再轉種肉湯，繼續(xù)培養(yǎng)至722．特殊細菌培養(yǎng)。(1)結核分支桿菌培養(yǎng)：將腦脊液離心后的沉淀物接種于血瓊脂平板上，35℃培養(yǎng)18～24(2)假絲酵母菌培養(yǎng)：將腦脊液離心后的沉淀物接種沙保弱瓊脂平板上，25～30℃(3)厭氧菌培養(yǎng)：將腦脊液離心后的沉淀物接種厭氧血瓊脂平板和其他相應的選擇性培養(yǎng)基，置厭氧環(huán)境中培養(yǎng)。六、臨床意義正常人的腦脊液是無菌的。故在腦脊液中檢出細菌(排除標本污染)，都應看作是致病菌。由于引起腦膜炎的細菌種類不同，而治療、處理和預后均不相同，因此，必須經(jīng)涂片和培養(yǎng)檢查，以確定細菌的種別。此外，新型隱球菌和結核桿菌所致的腦膜炎，在臨床上常難以鑒別，更需經(jīng)細菌檢查加以區(qū)分。故腦脊液的細菌學檢查在臨床上具有十分重要的意義。七、腦脊液感染常見病原菌引起腦脊液感染的常見病原菌如下。1．革蘭陰性菌：腦膜炎奈瑟菌、卡他布蘭漢菌、大腸埃希菌、克雷