一文掌握“小鼠葡萄糖代謝”相關試驗要點

一文掌握“小鼠葡萄糖代謝”相關試驗要點肥胖是造成代謝紊亂如「胰島素抵抗」的常見危險因素，對于肥胖的研究，最常見的動物模型就是60%高脂飲食誘導C57BL/6J小鼠肥胖，此模型與臨床肥胖癥的病理相似，穩(wěn)定性好，10周左右就可以看到明顯的表型。表型出現后，除了測量體重之外，更需要衡量的就是體內胰島素抵抗水平和葡萄糖耐量，通俗來說就是機體對葡萄糖分解代謝的能力，這個時候我們可以外源性地給小鼠葡萄糖后來監(jiān)測一定時間段內的血糖情況，也就是葡萄糖耐量檢測，如果是通過口服給予葡萄糖，就是口服糖耐量試驗(「oralglucosetolerancetestj)簡稱為：「OGTT」；如果是通過腹腔注射來給予葡萄糖，就是經腹腔注射葡萄糖耐量檢測(fintraperitonealglucosetolerancetestj)簡稱為「IPGTTJ如果葡萄糖耐量降低，機體消耗葡萄糖的能力下降，在外源給予葡萄糖之后，血糖相對迅速上升而下降緩慢。在臨床上，這個實驗也十分普遍，當然，臨床中是通過口服葡萄糖來實現的，這個試驗也是臨床診斷糖尿病的金標準。相反地，如果外源給予胰島素，檢測特定時間段內的血糖水平，就是胰島素耐量實驗(「insulintolerancetest,insulin-inducedhypoglycemiatestj)簡稱為「ITTJ,而外源性胰島素的給予方式，是通過腹腔注射來實現的；如果出現了胰島素不敏感，在注射胰島素之后，血糖相對下降緩慢而上升較快。總之，OGTT和ITT是兩個評價代謝狀態(tài)的經典實驗，兩者分別評估了葡萄糖耐量和胰島素抵抗的情況，如果葡萄糖是經過腹腔給予的，那么就是IPGTT試驗，本質上和OGTT是一樣的。理清了OGTT和ITT的基本概念之后，我們分別看看兩者是具體怎么實現的首先我們來了解一下OGTT試驗如何實施。大體上來講，小鼠的OGTT試驗就是在小鼠空腹12-16小時后給予適量水平的葡萄糖后，選擇6個常規(guī)時間點監(jiān)測血糖的過程。小鼠血糖如何測量？給予葡萄糖的量是多少？6個時間點如何選擇？多只小鼠同時進行如何協(xié)調？都是我們需要注意的問題。小鼠準備我們取血的途徑是從小鼠尾部獲得，在正式進行OGTT試驗前的一周，可以進行小鼠「掐尾適應訓練」，這樣小鼠在正式實驗時能夠從容面對，從而避免應激性的高血糖。在正式試驗的前一天，給小鼠換上干凈的墊料，饑餓14小時（比如前一天晚上的18:00正式開始饑餓，次日早上8:00開始實驗）。葡萄糖的準備準備10毫升左右的20%的葡萄糖，一定要注意是試劑級別的葡萄糖以及溶解葡萄糖的雙蒸水是無菌的。小鼠稱體重根據體重計算葡萄糖溶液的用量，常用劑量是1g/kg，如果一只小鼠重30g,那么需要給它準備150ul的葡萄糖了。同時保證小鼠標號清楚，同時進行多只小鼠的OGTT實驗，時間的管理就尤為重要，不要在識別小鼠上面浪費時間。小鼠取血和基礎血糖檢側尾尖剪去1-2mm，棄掉第一滴，用第二滴檢測血糖；動作輕柔，避免應激性的高血糖，同時也可以用小刀劃口子取血，血糖的檢測只需要3ul，如果利用毛細管引流，可以收集到30ul,可以用于其他指標的測量。圖片來源：參考文獻給予葡萄糖根據計算的葡萄糖的體積，通過灌胃或腹腔注射給小鼠相應劑量的葡萄糖，在灌胃的過程中一旦遇到任何阻力，不要強行灌注，極有可能誤入了氣管，此時應該退出灌胃針，重新進針。當第一只小鼠灌胃成功后，按下計時器倒計時15分鐘，在此期間應保證所有小鼠都灌胃成功，如果按照一只小鼠1分鐘操作時間計算得話，同一批次進行實驗的小鼠不要超過15只。保證在計時器響起得那一刻，第一只被灌胃的小鼠可以進行第一個時間點也就是15分鐘的血糖測量。圖片來源：參考文獻其余時間點得血糖監(jiān)測重復上面的步驟，在30,60,90,120min的時間點分別監(jiān)測血糖，時間點可以自己設置，如果選擇180min或者更長的時間點監(jiān)測，那么，應該保證小鼠在此期間有足夠的飲水；實驗吉束小鼠放回籠子，保證充足的飲水和食物，小鼠的OGTT實驗對與它的消耗是很大的，所以，如果要再次進行OGTT或者進行ITT試驗得話，應該保證至少一周的間隔時間。其次我們再來了解一下小鼠的ITT試驗基本要點和OGTT實驗相似，不同的是，胰島素是通過腹腔注射給予的，并且饑餓時間應該縮短至2-5h，因為長時間的饑餓容易發(fā)生小鼠在實驗過程中的低血糖休克，所以為了避免這樣的情況發(fā)生，掌握好胰島素的劑量就顯得非常重要，常用劑量為0.75U/Kg，同時提前準備好20%的葡萄糖，一旦發(fā)生低血糖休克，立即灌胃葡萄糖進行搶救。圖片來源：參考文獻時間點的選擇上，推薦15,30,60,90,120min,再長時間點得檢測是沒有意義的，因為胰島素的半衰期只有10分鐘，超出2小時后血糖水平與胰島素就沒有關系了。最后，我們應該對實驗數據進行整理，并進行繪圖呈現出來，典型的結果如下圖，分別是OGTT（左）和ITT（右）的結果圖，分別是高脂飲食組（60%脂肪）HFD和低脂飲食組（10%脂肪）LFD組，每組30只;左圖是在在過夜禁食之后，灌胃給予葡萄糖（1g/Kg）后的15,30,45,60分鐘后檢測血糖水平，我們可以看到高脂飲食組血糖迅速上升且幅度較大，而下降相對緩慢，說明出現了葡萄糖耐量減退；右圖是空腹狀態(tài)的小鼠給予腹腔注射胰島素（0.75U/Kg）后的15,30,45,60分鐘的血糖水平，可以看出高脂飲食組血糖下降減慢而且幅度較低，說明出現了胰島素抵抗。圖片來源：參考文獻OGTT和ITT是衡量代謝的經典實驗，值得我們學習和掌握。參考文獻：StudyofInVivoGlucoseMetabolisminHigh-fatDie