大豆Gm2-MMP啟動子分離及Gm2-MMP互作蛋白篩選

大豆Gm2-MMP啟動子分離及Gm2-MMP互作蛋白篩選大豆[Glycinemax(L.)Merr.]是世界上重要的糧食作物,是植物蛋白的主要來源。南方春大豆區(qū)是我國大豆的主產(chǎn)區(qū)之一,該地區(qū)大豆在種子生理成熟期(R6期-R7期)常會遭遇高溫高濕的天氣,種子極易發(fā)生田間劣變,導致種子活力下降?；|金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)屬于金屬內(nèi)肽酶中的MA簇M10家族,EC3.4.24亞類,是一類鋅鈣依賴型的蛋白酶。廣泛分布于動物、植物體內(nèi),能降解細胞外基質的所有成分。植物MMPs可能參與發(fā)育調(diào)控、免疫應答及非生物逆境脅迫響應等多個方面。本課題組前期的差異蛋白質組學研究結果表明高溫高濕脅迫后田間劣變抗性品種湘豆3號中MMPs蛋白呈上調(diào)表達。本研究在此基礎上,以種子田間劣變抗性品種湘豆3號和不抗品種寧鎮(zhèn)1號為材料開展以下研究:(1)Gm2-MMP啟動子的分離,并對其順式作用元件進行分析;(2)Gm2-MMP互作蛋白的篩選與鑒定;(3)Gm-PM31的生物信息學分析及亞細胞定位;(4)Gm-M31的組織表達特異性分析及高溫高濕脅迫下Gm-PM31的表達特性分析。以期為進一步研究MMP在參與大豆生長發(fā)育和響應逆境脅迫等方面的生物學功能提供幫助。主要研究結果如下:1.在Gm2-MMP基因5’上游1596bp內(nèi)分離到了該基因的啟動子序列,其序列中存在熱激響應(CCAATBOX1)、脫水黃化誘導(ACGTATERD1)、干旱響應(ABRELATERD1)和光調(diào)控(IBOXCORE)等順式作用元件;通過對Gm2-MMP基因啟動子5’端不同缺失片段驅動的GUS基因在煙草葉片中的瞬時表達分析發(fā)現(xiàn),-359bp～-223bp對該啟動子的高溫高濕誘導活性是必須的。2.以Gm2-MMP蛋白為誘餌對高溫高濕脅迫下抗種子田間劣變春大豆種子膜蛋白酵母雙雜交文庫進行篩選,初步獲得39個可能與Gm2-MMP互作的蛋白,分別為:球蛋白、油體蛋白、種子成熟蛋白、白蛋白、胰蛋白酶抑制劑、蔗糖結合蛋白、水通道蛋白、富甘氦酸類蛋白、轉運蛋白、MYB轉錄因子、60S核糖體蛋白、鈣連接蛋白、脫水素蛋白、Ca2+結合EF手型蛋白以及未知功能蛋白。3.Gm-PM31生物信息學分析表明,Gm-PM31與豆科相關蛋白親緣關系較近,且具典型的ACD-ScHsp26-like和IbpA結構域。對Gm-PM31編碼的蛋白進行亞細胞定位結果表明,其定位于高爾基體。通過酵母雙雜交和BiFC實驗對Gm2-MMP與Gm-PM31在體內(nèi)的互作進行了驗證。4.qRT-PCR結果表明,Gm-PM31在寧鎮(zhèn)1號和湘豆3號中均表現(xiàn)為在成熟種子中表達量最高,在成熟葉片、老葉及幼莢中有少量表達,其他組織中表達量很低甚至不表達;在大豆種子發(fā)育過程中Gm-PM31的表達量呈先上升后下降的趨勢,并在開花后第45天表達量達到最大值。在種子生理成熟期進行高溫高濕脅迫后,在寧鎮(zhèn)1號種子中,與對照相比,Gm-PM31在脅