多酸基熒光檢測微球的制備及布魯氏菌檢測方法的研究

多酸基熒光檢測微球的制備及布魯氏菌檢測方法的研究近年來，全球范圍內(nèi)新發(fā)公共傳染病不斷發(fā)生，其病原體75%源自動物或動物源性食品。新發(fā)公共傳染病已越來越多的呈現(xiàn)出“人禽共患”或“人畜共患”的特點。其中由布魯氏菌引起的傳染病在我國尤其是在牧區(qū)發(fā)病率較高，且傳染性較強。布魯氏菌病的高發(fā)和流行不僅造成巨大的經(jīng)濟損失，而且嚴重威脅人群的健康。對布魯氏菌病的預防、監(jiān)督檢查現(xiàn)已引起世界各國的廣泛重視，加強對布魯氏菌的預防和監(jiān)控現(xiàn)已納入世界衛(wèi)生組織和我國衛(wèi)生部傳染病檢測的主要工作內(nèi)容之一。因此，開發(fā)快速、高效、特異的布魯氏菌病檢測技術現(xiàn)已成為公共衛(wèi)生檢測領域研究的重點課題之一。本課題研究主要是設計合成了多酸基熒光免疫探針，利用雙抗體夾心熒光免疫原理，借助液相芯片檢測技術平臺，建立一種安全、準確、特異的布魯氏菌檢測方法。本課題研究分為四個部分：第一部分布魯氏菌多克隆抗體與單克隆抗體的制備及鑒定。①多克隆抗體的制備及鑒定：利用羊種布魯氏菌M5疫苗皮下多點注射免疫新西蘭白兔，每次免疫前耳緣靜脈取血，測定其血清效價，達到所需標準，兔心臟采血并分離血清，用硫酸銨沉淀法結(jié)合ProteinG親和層析法進行抗體純化，Bradford法測定抗體蛋白含量，間接ELISA、SDS凝膠電泳試驗測定效價和純度，并利用生物素進行標記。結(jié)果顯示純化后布魯氏菌多抗純度較高，蛋白含量為8.22mg·L^-1，效價可達到1:64000，每摩爾多克隆抗體蛋白可標記生物素摩爾數(shù)為2.61。②單克隆抗體的制備及鑒定：采用雜交瘤細胞技術，以羊種布魯氏菌M5為抗原免疫BALB/c小鼠，在細胞融合前4d加強免疫。取免疫小鼠脾細胞和SP2/0細胞進行融合。用已建立的間接ELISA進行雜交瘤細胞陽性篩選，采用有限稀釋法進行亞克隆，篩選出能穩(wěn)定分泌M5抗體的陽性雜交瘤細胞。陽性雜交瘤細胞經(jīng)擴大培養(yǎng)后，小鼠體內(nèi)誘生法制備單抗腹水，并對腹水中的單抗用硫酸銨沉淀法結(jié)合ProteinG親和層析法進行純化，Bradford法測定蛋白含量，間接ELISA、SDS凝膠電泳試驗測定效價和純度。結(jié)果顯示經(jīng)過亞克隆篩選出1株能穩(wěn)定分泌M5單克隆抗體的雜交瘤細胞株，抗體亞型為IgG₃型，純化濃縮后的抗體蛋白含量為4.39mg·L^-1，效價可達到1:6400，純度較高，特異性較好。第二部分多酸基熒光發(fā)光材料的合成與表征。①采用有機無機雜化法，設計合成新型多酸熒光N（C₄H₉）₄]₂[V₆O₁₃{（OCH₂）₃CNH-CH₂-C₁₆H₉}₂化合物。利用X-射線單晶衍射、氫核磁、碳核磁、紅外光譜、紫外光譜和熒光光譜對其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進行表征。結(jié)果顯示該化合物呈負電性，紅外光譜特征峰為2958、2929、2870、1482、1378、811、795、718cm^-1，紫外特征吸收峰為244、270、283、389、345nm，激發(fā)峰為262、275、329、345nm，在345nm激發(fā)下的發(fā)射波譜范圍較寬，最高發(fā)射峰在400nm處。②采用常規(guī)的多酸化學合成方法，合成Na₉EuW₁₀O₃₆，利用紅外光譜、紫外光譜和熒光光譜對所合成的化合物結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進行表征。結(jié)果顯示，該化合物紅外光譜特征峰為543、705、785、843、945nm，紫外特征吸收峰為208和258nm，在278nm激發(fā)下的發(fā)射峰位于579、592、619、651、692、700nm。第三部分功能化多酸基熒光檢測微球的制備與表征。①功能化多酸熒光染料[N（C₄H₉）₄]₂[V₆O₁₃{（OCH₂）₃CNH-CH₂-C₁₆H₉}₂]標記聚苯乙烯微球的制備與表征：采用分散聚合法合成聚苯乙烯微球，微球粒徑約為2.8μm，選用聚電解質(zhì)PDADMAC、PAA、PAH對微球進行活化，采用層接層靜電自組裝法將所制備的多酸熒光染料[N（C₄H₉）₄]₂[V₆O₁₃{（OCH₂）₃CNH-CH₂-C₁₆H₉}₂]包覆在微球表面，通過聚電解質(zhì)進一步修飾，使微球表面帶有羧基官能團。利用Zeta電位、熒光光譜和激光共聚焦顯微鏡對所制備的微球進行表征，結(jié)果顯示多酸熒光染料和聚苯乙烯微球可以較好的偶聯(lián)，且具有良好的熒光發(fā)光特性。②功能化多酸熒光染料[N（C₄H₉）₄]₂[V₆O₁₃{（OCH₂）₃CNH-CH₂-C₁₆H₉}₂]標記二氧化硅微球的制備與表征：采用種子聚合法合成二氧化硅微球，微球粒徑約為1μm，選用聚電解質(zhì)PEI和PAA對微球進行活化，采用層接層靜電自組裝法將所制備的多酸熒光染料[N（C₄H₉）₄]₂[V₆O₁₃{（OCH₂）₃CNH-CH₂-C₁₆H₉}₂]包覆在微球表面，通過聚電解質(zhì)進一步修飾，使微球表面帶有羧基官能團。利用Zeta電位、熒光光譜和流式細胞儀對所制備的微球進行表征。結(jié)果顯示多酸熒光染料和二氧化硅微球可以較好的偶聯(lián)，且具有良好的熒光發(fā)光特性。③功能化多酸熒光染料Na₉EuW₁₀O₃₆標記聚苯乙烯微球的制備與表征：采用細乳液聚合法將Na₉EuW₁₀O₃₆雜化引入聚苯乙烯微球中，通過聚電解質(zhì)進一步修飾，使微球表面帶有羧基官能團。利用紫外光譜、熒光光譜、Zeta電位和透射電鏡對所制備的微球進行表征。結(jié)果顯示Na₉EuW₁₀O₃₆與聚苯乙烯微球可以較好的雜化，且具有良好的熒光發(fā)光特性。第四部分布魯氏菌液相芯片檢測方法的建立及評價。①布魯氏菌液相芯片檢測方法的建立：利用雙抗體夾心熒光免疫分析原理，采用液相芯片檢測技術平臺，通過對反應條件的優(yōu)化，建立一種布魯氏菌液相芯片檢測方法，并對該方法的檢測效果進行驗證。結(jié)果顯示，本課題所建立的檢測方法最佳反應條件為：單抗最佳偶聯(lián)濃度8.3125μg·mL^-1，生物素標記的多克隆抗體工作濃度為432μg·mL^-1，SA-PE的工作濃度為8μg·mL^-1。該方法檢測的特異性和重復性較好，利用該方法檢測羊布魯氏菌M5最低檢出限為1.0×10<sup>6</sup