DB22-T 3473-2023 牛呼吸道合胞體病病原學(xué)診斷技術(shù)

41DB22 22/T

3473—2023牛呼吸道合胞體病病原學(xué)診斷技術(shù)

respiratory

syncytial

disease2023

2023

吉林省市場(chǎng)監(jiān)督管理廳

DB22/T

2023前言本文件按照

GB/T

1.1—2020

《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則

部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的DB22/T

2023牛呼吸道合胞體病病原學(xué)診斷技術(shù)

范圍

規(guī)范性引用文件

NY/T

541-2016

術(shù)語(yǔ)和定義

縮略語(yǔ)

臨床診斷5.1

流行病學(xué)該病發(fā)生。牛、羊易感，犢牛最易感。

主要傳染源是病畜和帶毒畜。直接接觸和飛沫經(jīng)呼吸道傳播是5.2

臨床癥狀

5.3

剖檢變化DB22/T

20235.4

結(jié)果判定

實(shí)驗(yàn)室診斷6.1

儀器與設(shè)備

低溫冰箱，

-20

℃。

II

6.1.10

6.1.11

微量移液器，0.5

L～10

L，2

L，20

L～1

L。6.2 試劑與材料

GB/T

濾芯吸頭，10

L，200

L，1

管，0.5

管，0.2

mL。

含青、鏈霉素

PBS

A.3。6.2.10 6.2.116.2.12DEPC

水。6.2.136.2.14

200

bp～2000

bp。6.2.15

6.2.16BRSV

BRSV

6.2.17 BRSV

6.3

樣品采集

DB22/T

2023將滅菌的棉拭子蘸取牛鼻腔分泌物放入含青、鏈霉素PBS溶液

mL

的采樣管中，加蓋密封保存。肺部組織按照

NY/T

541-2016

中的

6.2.2

6.4

樣品處理6.4.1

鼻腔分泌物將樣品置于旋渦振蕩器上振蕩混勻，5

000

15

6.4.2

組織樣品取組織樣品約

PBS

000

r/min、4

離心

15

RT-PCR

方法

引物

1。表1

RT-PCR

病毒

在樣品制備區(qū)將經(jīng)

6.4.1

病毒

-20

冰箱備用。6.5.3

RT-PCR

制反應(yīng)體系。在樣品制備區(qū)，依次將待檢樣品的模板

RNA、BRSV

陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照加入配置好的反表2RT-PCR

RT-PCR

DB22/T

2023在核酸擴(kuò)增區(qū)將

PCR

PCR

a) 45

min；b) 98

min；c)98

變性

30

s，55

退火

30

，72

35

72

延伸10

min。

電泳在產(chǎn)物分析區(qū)將

L的

6×上樣緩沖液加入到

RT-PCR

產(chǎn)物中，混勻后取

加入到使用

×TAE

1%

1%

000

marker

作為電泳參照物。調(diào)節(jié)電壓

V/cm，電泳時(shí)間約

25

min。電泳結(jié)束后，用凝膠成像儀6.5.6

結(jié)果判定

660

BRSV

方法6.6.1

引物與探針實(shí)時(shí)熒光

RT-PCR

3。表3

實(shí)時(shí)熒光

RT-PCR

病毒

6.5.2。

版RNA

Real-time

反應(yīng)體系。在樣品制備區(qū)，依次將待檢樣品的模板RNA、BRSV

陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照表4

反應(yīng)體系

DB22/T

2023

4（續(xù)）

a) 50

min；b)95

min；c) 95

變性

15

s，60

退火

40

40

個(gè)循環(huán)。在每一個(gè)循環(huán)的

60

時(shí)收集熒光信6.6.5

結(jié)果判定

實(shí)驗(yàn)成立條件：BRSV

Ct

被檢樣品

Ct

BRSV

被檢樣品無(wú)

Ct

值或

Ct

BRSV

被檢樣品

35

Ct

40

檢測(cè)，仍為疑似，判定為

BRSV

綜合判定符合

5.4

且符合

6.5

6.6

判為牛呼吸道合胞體??；未出現(xiàn)

5.4

結(jié)果，但符合

6.5

6.6結(jié)DB22/T

2023 A.1

pH7.4

8.00

0.20

磷酸氫二鈉（Na24

磷酸二氫鉀(KH2PO4

加至

000

mL將上述成分依次溶解，用

HCl

pH

至7.4，分裝，121

min

高壓滅菌。室溫或

A.2

青、鏈霉素貯存溶液取青霉素

000IU、鏈霉素

g，用滅菌去離子水配成

10

mL

的上述兩種抗生素

mL、鏈霉素100

g/

mL）。分裝小瓶，-20

保存。A.3

含青、鏈霉素

PBS

溶液

，加入

青、鏈霉素貯存溶液，調(diào)溶液

pH

18.61

80

mL

pH

8