丙泊酚對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力影響的實驗研究

丙泊酚對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力影響的實驗研究第一部分丙泊酚對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響目的:利用Morris水迷宮,研究不同劑量的丙泊酚對于大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響。方法:24只SD大鼠隨機(jī)分為4組,每組6只。Pr010組、Pr030組和Pr075組,分別給予丙泊酚10、30和75mg/kg腹腔注射;Intra組給予與Pr075組等體積的脂肪乳腹腔注射作為溶劑對照。Pro10組、Pr030組和Intra組大鼠在訓(xùn)練前20min接受上述藥物腹腔注射;Pr075組大鼠則在翻正反射恢復(fù)后20min進(jìn)行訓(xùn)練。第1～5天進(jìn)行定位導(dǎo)航實驗。大鼠每天訓(xùn)練一次,每次訓(xùn)練前給予上述藥物。把大鼠從離平臺最遠(yuǎn)的象限,在固定的入水點把大鼠背對平臺投入水中,計時180s。若大鼠找到平臺,讓其在平臺上停留30s,若未能找到平臺,引導(dǎo)其找到平臺,同樣停留30s。記錄大鼠尋找平臺的時間,即潛伏期(若在規(guī)定時間內(nèi)未找到平臺,按照180s計算),記錄尋找平臺的路徑長度和游泳速度。第6天不給予任何藥物進(jìn)行附加實驗,入水點改為平臺所在象限的毗鄰左側(cè)象限,觀察和記錄方法同前。第7天不給予任何藥物測定大鼠的空間探索能力,撤去水中的平臺,入水點與第1～5天訓(xùn)練時的位置相同。記錄60s內(nèi)停留在原平臺所在象限的時間。結(jié)果:(1)定位航行實驗,大鼠尋找平臺的潛伏期,Pr075組明顯較Intra組、Pro10組和Pr030組長(P<0.01)。其中第3、4、5天Pr075組的潛伏期明顯較Intra組長(P<0.01)。大鼠尋找平臺的路徑,Pro75組明顯較Intra組、Pr010組和Pr030組長(P<0.01)。第3、4、5天Pr075組大鼠尋找平臺的路徑較Intra組更長(P<0.01)。各組大鼠尋找平臺的游泳速度沒有差異(P>0.05)。附加實驗,Pr030組和Pr075組大鼠尋找平臺的潛伏去明顯長于Intra組(P<0.01)。Pr075組大鼠尋找平臺的潛伏去明顯長于Intra組、Pro10組和Pr030組(P<0.01)。各組大鼠尋找平臺游泳的速度沒有差異(P>0.05)。(2)空間探索實驗,Intra組、Pr010組、Pr030組和Pr075組大鼠在第Ⅲ象限(原來平臺所在象限)停留時間分別為25.2±6.6s、22.0±1.3s、20.0±6.9s和15.0±3.8s,Pr075組大鼠在第Ⅲ象限停留時間明顯短于Intra組(P<0.01)和Pro10組(P<0.05)。結(jié)論:多次給大鼠腹腔注射丙泊酚實施麻醉可以損害其空間學(xué)習(xí)記憶能力。第二部分丙泊酚對大鼠海馬腦片CA1區(qū)長時程增強(qiáng)的影響及其機(jī)制實驗一不同濃度的丙泊酚對大鼠海馬腦片CA1區(qū)長時程增強(qiáng)的影響目的:以離體海馬腦片作為實驗材料,利用細(xì)胞外記錄技術(shù),觀察不同濃度丙泊酚對于離體海馬腦片CA1區(qū)長時程增強(qiáng)(LTP)的影響。方法:制備大鼠海馬腦片,并用人工腦脊液孵育。將制備的腦片隨機(jī)分為6組,每組6張腦片:Pr0100組、Pr030組、Pro10組和Pr03組分別應(yīng)用終濃度為100、30、10和3μmol/L的丙泊酚,Intra組應(yīng)用脂肪乳作為溶劑對照,Control組不加任何藥物作為空白對照。應(yīng)用上述藥物預(yù)先孵育腦片60min后,再進(jìn)行細(xì)胞外誘發(fā)電位的記錄。用引起群峰電位(PS)最大反應(yīng)50%的強(qiáng)度作為測試刺激,待PS穩(wěn)定后,記錄PS20min,取其平均值作為基準(zhǔn)值。然后施以100Hz、400個脈沖、波寬0.15ms的高頻刺激(HFS),此后繼續(xù)用測試刺激誘發(fā)PS并加以記錄。結(jié)果:Control組、Intra組和Pr03組實施HFS后,PS明顯升高,HFS后40min的PS分別為1.501±0.124、1.436±0.160和1.332±0.077,高于基礎(chǔ)值(P<0.01或P<0.05)。Pro10組、Pr030組和Pr0100組實施高頻刺激后,其PS未明顯增高,HFS后40min其PS分別為1.118±0.072、1.031±0.112和0.981±0.047,與基礎(chǔ)值相比沒有差異(P>0.05)。HFS后40min時,Pr03組PS與Control組和Intra組相比沒有差異(P>0.05)。HFS后40min時,Pro10組PS則顯著低于Control組和Intra組(P<0.01)和Pr03組(P<0.05)。HFS后40min時,Pr030組PS也顯著低于Control組、Intra組、Pr03組(P<0.01)以及Prol0組(P<0.05)。HFS后40min時,Pr0100組PS也顯著低于Control組、Intra組、Pr03組和Pr010組(P<0.01);與Pr030組相比無顯著差異(P>0.05)。結(jié)論:丙泊酚可以抑制大鼠海馬腦片CAl區(qū)LTP的形成。實驗二丙泊酚抑制大鼠海馬腦片CAl區(qū)長時程增強(qiáng)的機(jī)制目的:以離體海馬腦片作為實驗材料,采用細(xì)胞外記錄技術(shù),觀察γ-氨基丁酸(GABA)A受體在丙泊酚對大鼠海馬腦片CA1區(qū)LTP抑制中的作用。方法:將制備的腦片隨機(jī)分為4組,每組6張腦片:AP-5組應(yīng)用終濃度為50μmol/L的AP-5;Pr030組應(yīng)用終濃度為30μmol/L的丙泊酚;Pr030+PTX組應(yīng)用終濃度為30gmol/L的丙泊酚和50gmol/L的印防己毒素;Intra組應(yīng)用脂肪乳作為溶劑對照。應(yīng)用上述藥物預(yù)先孵育腦片60min后,再進(jìn)行細(xì)胞外誘發(fā)電位的記錄。用引起PS最大反應(yīng)50%的強(qiáng)度作為測試刺激,待PS穩(wěn)定后,記錄PS20min,取其平均值作為基準(zhǔn)值。然后施以高頻刺激(HFS),此后繼續(xù)用測試刺激誘發(fā)PS并加以記錄。結(jié)果:Intra組實施HFS后PS升高,HFS后40min時的PS為1.436±0.160,顯著高于實施高頻刺激前(P<0.01)。AP-5組實施HFS后40min時的PS為1.001±0.089,與實施HFS前的PS相比沒有差異(P>0.05),但是明顯低于Intra組(P<0.01)。Pr030組實施HFS后PS未見升高,HFS后40min時的PS為1.031±0.112,與高頻刺激前比較沒有差異(P>0.05),但是明顯低于Intra組(P<0.01)。Pr030+PTX組實施HFS后PS升高,HFS后40min時,Pr030+PTX組的群峰電位明顯高于Pr030組(P<0.01),但與Intra組相比沒有差異(P>0.05)。結(jié)論:GABAA受體參與了丙泊酚對于大鼠海馬腦片CA1區(qū)LTP的抑制。實驗三丙泊酚復(fù)合皮質(zhì)酮對大鼠海馬腦片CA1區(qū)長時程增強(qiáng)的影響目的:以離體海馬腦片作為實驗材料,采用細(xì)胞外記錄技術(shù),觀察不同濃度的皮質(zhì)酮復(fù)合應(yīng)用丙泊酚對于海馬腦片CA1區(qū)LTP的影響。方法:將制備的腦片隨機(jī)分為7組,每組6張,各組應(yīng)用下列終濃度的藥物:Pro3組應(yīng)用3μmol/L丙泊酚,Cort0.1組應(yīng)用0.1μmol/L皮質(zhì)酮,Con10組應(yīng)用10μmol/L皮質(zhì)酮,Pro3+Cort0.1組復(fù)合應(yīng)用3μmol/L丙泊酚和0.1μmol/L皮質(zhì)酮,Pro3+Cort10組復(fù)合應(yīng)用3μmol/L丙泊酚和10μmol/L皮質(zhì)酮,脂肪乳組加入脂肪乳作為溶劑對照,對照組不加入上述任何藥物。應(yīng)用上述藥物預(yù)先孵育腦片60min后,再進(jìn)行細(xì)胞外誘發(fā)電位的記錄。調(diào)整刺激器使刺激強(qiáng)度達(dá)到誘發(fā)最大PS的50%為宜用,待PS穩(wěn)定后,記錄PS20min,取其平均值作為基準(zhǔn)值。然后施以高頻刺激(HFS),此后繼續(xù)用測試刺激誘發(fā)PS并加以記錄。結(jié)果:Control組和Intra組實施HFS后,PS明顯升高,HFS后40min的PS分別為1.501±0.124和1.436±0.160,明顯高于基礎(chǔ)值(P<0.01)。Pro3組、Con0.1組和Pro3+Cort0.1組實施高頻刺激后PS升高,HFS后40min時PS分別為1.332±0.077、1.385±0.095和1.342±0.031,明顯高于基礎(chǔ)值(P<0.05),但是與Intra組相比沒有顯著差異(P>0.05)。Cort10組、Pro3+Cort10組實施HFS后PS未見明顯升高,HFS后40min時群峰電位分別為1.180±0.089和0.989±0.030,與其基礎(chǔ)值相比無差異(P>0.05),但是低于InCa組和Pro3組(P<0.05),并且Pro3+Cort10組PS明顯低于Con10組和Pro3+Cort0.1組(P<0.05)。結(jié)論:低濃度丙泊酚(3μgmol/L)抑制大鼠海馬腦片CA1區(qū)LTP,而低濃度丙泊酚(31μmol/L)復(fù)合高濃度皮質(zhì)酮(10μmol/L)可以抑制大鼠海馬腦片CA1區(qū)LTP,并且其抑制作用較單獨(dú)應(yīng)用高濃度皮質(zhì)酮(10μmol/L)更強(qiáng)。第三部分丙泊酚對大鼠海馬突觸體釋放谷氨酸和γ-氨基丁酸的影響實驗一丙泊酚對大鼠海馬突觸體Ca2+依賴性和非Ca2+依賴性釋放谷氨酸和γ-氨基丁酸的影響目的:利用大鼠海馬突觸體模型,觀察丙泊酚對其谷氨酸和γ-氨基丁酸(GABA)的Ca2+依賴性釋放和非Ca2+依賴性釋放的影響。方法:應(yīng)用SD大鼠,制備海馬突觸體,用人工腦脊液孵育(aCSF)。把突觸體隨機(jī)分為7組,分別加入不同濃度的丙泊酚,使其終濃度分別為3、10、30、100、300μmol/L,依次為Pro3組、Pro10組、Pro30組、Pro100組、Pro300組,溶劑對照組(Intra組)加入脂肪乳,空白對照組(Control組)不加入上述藥物。在37℃條件下水浴15-20min后加入20μmol/L藜蘆定或30mmol/LKCl誘發(fā)遞質(zhì)釋放。5min后,迅速加入終濃度為10mmol/L乙二醇雙(α-氨基乙基)醚四乙酸(EGTA),并迅速放入冰水浴中,然后12000×g離心20min,收集上清液,存放在-70℃低溫冰箱待測。觀察Ca2+依賴性釋放時,向aCSF中加入哌啶酸(GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑)和DHK(谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑);觀察非Ca2+依賴性釋放時,aCSF中不加入哌啶酸和DHK和Ca2+。觀察30mmol/LKCl誘發(fā)遞質(zhì)釋放時,應(yīng)用NaCl濃度為98.9mmol/L的aCSF。應(yīng)用反相高效液相色譜法測定各突觸體反應(yīng)液中谷氨酸和GABA的濃度。結(jié)果:10、30、100和300μmol/L的丙泊酚可以抑制黎蘆定誘發(fā)的Ca2+依賴性谷氨酸釋放。Pro30、Pro100和Pr0300組的谷氨酸釋放量均明顯低于Pro3組(P<0.01);Pro100和Pro300組的谷氨酸釋放量均明顯低于Pro10組(P<0.01);Pro300組的谷氨酸釋放量低于Pro30組(P<0.05)。丙泊酚抑制谷氨酸釋放的IC50為17.2μmol/L。30、100和300μmol/L的丙泊酚可以抑制黎蘆定誘發(fā)的Ca2+依賴性GABA釋放,Pro30、Pro100和Pr0300組的GABA釋放量均明顯低于Pr03組(P<0.01)和低于Pro10組(P<0.05或P<0.01)。丙泊酚抑制GABA釋放的IC50為20.1μmol/L。應(yīng)用KCl誘發(fā)突觸體Ca2+依賴性釋放谷氨酸和GABA,其釋放量無差異(P>0.05)。應(yīng)用藜蘆定和KCl誘發(fā)非Ca2+依賴性谷氨酸和GABA,其釋放量無差異(P>0.05)。結(jié)論:丙泊酚可以抑制黎蘆定誘發(fā)突觸體Ca2+依賴性釋放谷氨酸和GABA;而對高濃度KCl誘發(fā)的Ca2+依賴性釋放谷氨酸和GABA。丙泊酚不影響黎蘆定和KCl誘發(fā)的非Ca2+依賴性釋放谷氨酸和GABA。實驗二突觸前膜GABAA受體在丙泊酚抑制谷氨酸和γ-氨基丁酸Ca2+依賴性釋放中的作用目的:利用大鼠海馬突觸體模型,探討突觸前膜GABAA受體在丙泊酚抑制谷氨酸和GABA的Ca2+依賴性釋放中的作用。方法:制備大鼠海馬突觸體,隨機(jī)分為5組:PTX組加入印防己毒素(PTX)使其終濃度為50μmol/L,Pro30+PTX組加入終濃度為30μmol/L的丙泊酚和50μmol/L的PTX,Pro30組加入終濃度為30μmol/L的丙泊酚,溶劑對照組(Intra組)加入脂肪乳,空白對照組(Control組)不加入上述藥物。誘發(fā)谷氨酸和G