第六章 藥物安全性檢查技術

酸堿滴定分析法第六章藥物安全性檢查技術公共衛(wèi)生與護理學院魏友利01熱原檢查技術無菌和微生物限度檢查技術02目錄定義熱原是指能引起恒溫動物和人體體溫異常升高的致熱物質(zhì)。廣義上包括細菌性熱原、內(nèi)源性高分子熱原、內(nèi)源性低分子熱原及化學熱原等。藥劑中的“熱原”通常是指細菌性熱原，是微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。熱原→吞噬細胞吞噬→白細胞崩解，釋放內(nèi)源性致熱原→作用于體溫調(diào)節(jié)中樞→產(chǎn)熱增加、散熱減少→體溫上升家兔法熱原檢查鱟（hou）試劑法細菌內(nèi)毒素檢查除另有規(guī)定外，《中國藥典》二部規(guī)定了靜脈用注射劑均需進行熱原或細菌內(nèi)毒素的檢查一熱原的家兔檢查法由于家兔對熱原的反應與人基本相似，家兔法為各國藥典規(guī)定的檢查熱原的法定方法。此法是將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內(nèi)，在規(guī)定時間內(nèi)，觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定。檢查結果的準確性和一致性取決于試驗動物的狀況、試驗室條件和操作的規(guī)范性。一熱原的家兔檢查法健康合格，體重1.7~3.0kg，雌兔應無孕，預測體溫前七日應用同一飼料喂養(yǎng)病無異常；對未使用過的家兔，或供試品判定為符合規(guī)定但組內(nèi)升溫達0.6℃的家兔；或三周內(nèi)未用過的家兔，均應在實驗前3~7日內(nèi)預檢體溫，進行挑選；對用過的家兔，如供試品判為符合規(guī)定，至少休息48小時。如升溫達0.6℃則應休息兩周以上；使用次數(shù)不超過十次。對家兔的要求一熱原的家兔檢查法健康合格，體重1.7~3.0kg，雌兔應無孕，預測體溫前七日應用同一飼料喂養(yǎng)病無異常；對未使用過的家兔，或供試品判定為符合規(guī)定但組內(nèi)升溫達0.6℃的家兔；或三周內(nèi)未用過的家兔，均應在實驗前3~7日內(nèi)預檢體溫，進行挑選；對用過的家兔，如供試品判為符合規(guī)定，至少休息48小時。如升溫達0.6℃則應休息兩周以上；使用次數(shù)不超過十次。對家兔的要求一熱原的家兔檢查法準備工作每批供試品初試用3只，復試5只。在檢查前1~2日，家兔應處于同一溫度環(huán)境中，實驗室應為17~25℃，與飼養(yǎng)室溫度相差不大于3℃，并防止動物躁動和避免噪聲干擾。家兔在實驗前至少一小時開始停止給食，并置于寬松裝置中，直至實驗完畢。測溫裝置精密度應為±0.1℃。一熱原的家兔檢查法準備工作測溫探頭或肛溫計插入肛門的深度和時間各兔應相同，深度一般約6cm，時間不得少于一分半鐘，每隔30分鐘測量一次，一般測兩次，兩次體溫之差不超過0.2℃，以平均值作為該兔正常體溫。當日使用的家兔，正常體溫應在38.0~39.6℃，且同組各兔間正常體溫之差不得超過1℃。試驗用的注射器、針頭及一切和供試品接觸的器皿，應置烘箱中250℃加熱30min，或180℃加熱2h，也可用其他適宜方法除去熱原。一熱原的家兔檢查法檢查法測家兔正常體溫后15min內(nèi)，由耳靜脈緩緩注入規(guī)定劑量并溫熱至38℃的供試品溶液，然后每隔30min測體溫1次，連續(xù)測6次。每只家兔正常體溫與注射供試品溶液后6次測量體溫中最高的體溫之差，即為該兔的升高溫度。如3只家兔中有1只體溫升高0.6℃或以上，或3只家兔體溫升高均低于0.6℃但升高總和達1.4℃或以上，則另取5只家兔復試，方法同上。一熱原的家兔檢查法結果判定1.判為符合規(guī)定：在初試3只家兔中，體溫升高均低于0.6℃并且升高總和低于1.3℃在復試5只家兔中，體溫升高0.6℃或以上的家兔不超過一只，并且初試與復試合并8只家兔的體溫升高總和為3.5℃或以下一熱原的家兔檢查法結果判定2.有下列情況者，復試一次：3只家兔1只體溫升高0.6℃或以上3只家兔升溫均低于0.6℃但升溫總和達1.3℃或以上一熱原的家兔檢查法結果判定3.有下列情況者，判為不符合規(guī)定：在初試3只家兔中，體溫升高0.6℃或以上的超過一只復試的5只家兔中，體溫升高0.6℃或以上的家兔超過一只在初試與復試合并的8只家兔中體溫升高總和超過3.5℃一熱原的家兔檢查法結果判定4.出現(xiàn)負值的規(guī)定如下：當家兔升溫為負值時，均以0℃計。一熱原的家兔檢查法注意事項盡量使用熱原測溫儀測溫，因為其感溫探頭在整個測溫過程中都置于家兔肛門內(nèi)，所測體溫較正確，同時也避免了漏檢現(xiàn)象。熱原耐熱性好，但在180℃3~4h，或200℃60min，或250℃30~45min可徹底破壞熱原。因此耐熱物品如玻璃制品、注射器等均可用此法破壞熱原。熱原實驗室內(nèi)外應保持安靜，避免日光直射。一熱原的家兔檢查法注意事項捉拿家兔時，應一只手抓住頸部，一只手托其臀部，避免其掙扎。整個過程中要避免家兔騷動以保持體溫恒定。注射時，先用75%酒精棉擦耳朵邊緣，再由兔耳靜脈緩緩注入規(guī)定劑量的供試液。注射完畢用手捏住針眼處，以助止血。試驗過程中，要及時填寫兔卡和原始記錄。家兔法熱原檢查鱟（hou）試劑法細菌內(nèi)毒素檢查除另有規(guī)定外，《中國藥典》二部規(guī)定了靜脈用注射劑均需進行熱原或細菌內(nèi)毒素的檢查一細菌內(nèi)毒素的鱟試劑檢查法主要來源主要來自于革蘭氏陰性桿菌，當細菌死亡或自溶后便會釋放出內(nèi)毒素，其化學成分主要是脂多糖，這是一種大分子物質(zhì)，分子量約為106，其粒徑約在1~5納米

。細菌內(nèi)毒素廣泛存在于自然界中。如自來水中含內(nèi)毒素的量為1至100EU/ml。一細菌內(nèi)毒素的鱟試劑檢查法熱源=內(nèi)毒素？

熱原指微生物產(chǎn)生的某些多糖蛋白復合物等使人體發(fā)熱的物質(zhì)，不僅僅是細菌內(nèi)毒素。但在藥檢的范疇，細菌內(nèi)毒素是主要的熱原物質(zhì)，可以說無內(nèi)毒素就無熱原，控制內(nèi)毒素就是控制熱原。一細菌內(nèi)毒素的鱟試劑檢查法與熱源對比內(nèi)毒素檢查法優(yōu)勢方便、快捷、經(jīng)濟；重現(xiàn)性好、靈敏度高；避免抗原的產(chǎn)生，克服生物測定的誤差；

近年來已經(jīng)普遍采用細菌內(nèi)毒素檢查法，逐漸替代了熱原法一細菌內(nèi)毒素的鱟試劑檢查法與熱源對比內(nèi)毒素檢查法優(yōu)勢方便、快捷、經(jīng)濟；重現(xiàn)性好、靈敏度高；避免抗原的產(chǎn)生，克服生物測定的誤差；

近年來已經(jīng)普遍采用細菌內(nèi)毒素檢查法，逐漸替代了熱原法一細菌內(nèi)毒素的鱟試劑檢查法在藥檢中的應用

細菌內(nèi)毒素檢查作為控制藥品質(zhì)量的一種方法，已經(jīng)廣泛的被世界各國藥典收載。成品檢查——藥品安全性檢查之一

半成品（生產(chǎn)過程）檢查——事前質(zhì)控手段，避免造成藥品成批報廢一細菌內(nèi)毒素的鱟試劑檢查法鱟的圖片鱟的長相既像蝦又像蟹，人稱之為“馬蹄蟹”,是一類與三葉蟲(現(xiàn)在只有化石)一樣古老的動物。鱟的血液中含有銅離子，它的血液是藍色的。這種藍色血液的提取物——“鱟試劑”，可以準確、快速地檢測人體內(nèi)部組織是否因細菌感染而致?。辉谥扑幒褪称饭I(yè)中，可用它對毒素污染進行監(jiān)測。

一細菌內(nèi)毒素的鱟試劑檢查法《中國藥典》批準使用方法：供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進行試驗。但當測定結果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠法結果為準。本節(jié)將著重介紹凝膠法法的操作與有關原理。測定

方法

凝膠法

光度測定法

濁度法

顯色基質(zhì)法

一細菌內(nèi)毒素的鱟試劑檢查法凝膠法基本原理

內(nèi)毒素（LPS）

激活

凝固蛋白原凝固蛋白（溶解狀態(tài)）

（凝膠狀態(tài)）凝固酶原凝固酶一細菌內(nèi)毒素的鱟試劑檢查法凝膠法名詞解釋—國家標準品及工作標準品國家標準品：（單位：EU/ml）自大腸埃希菌提取精制而成，用于標定、復核、仲裁鱟試劑靈敏度和標定細菌內(nèi)毒素工作標準品的效價；工作標準品：

經(jīng)國家標準品稀釋用于試驗中鱟試劑靈敏度符復核、干擾試驗及各種陽性對照；一細菌內(nèi)毒素的鱟試劑檢查法名詞解釋—鱟試劑

鱟（hòu）是一種海洋節(jié)肢動物，其血液中含有一種有核變形細胞，這種細胞的胞漿中含有凝固酶原和凝固蛋白原。將此物質(zhì)進行提取，經(jīng)低溫冷凍干燥而成的生物試劑即為鱟試劑，專用于細菌內(nèi)毒素檢測。一細菌內(nèi)毒素的鱟試劑檢查法基本概念1—細菌內(nèi)毒素限值（L）

指人對藥品中細菌內(nèi)毒素所能耐受的不致引起熱原反應的某定量限值（L）；計算公式：L=K/M

K：每公斤體重每小時最大可接受內(nèi)毒素劑量，注射劑K=5EU//(kg.h)M:每公斤體重每小時的最大供試品劑量；以胸腺素α1計算限值為例：

L=5EU/(kg.h)

÷(1.6mg÷60kg)=185.19EU/mg

藥典規(guī)定標準：小于10EU/ml一細菌內(nèi)毒素的鱟試劑檢查法基本概念2—確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）

指供試品溶液被允許稀釋的最大倍數(shù)，在不超過此稀釋倍數(shù)的濃度下進行內(nèi)毒素限值的檢測；

計算公式：MVD=cL/λL：供試品的細菌內(nèi)毒素限值

c：供試品溶液的濃度λ：鱟試劑靈敏度

以胸腺素α1計算最大稀釋倍數(shù)為例：

MVD=10EU/mg×1.6mg/ml÷0.25EU/ml=64（倍）一細菌內(nèi)毒素的鱟試劑檢查法方法步驟

1.鱟試劑靈敏度復核試驗3.凝膠適量試驗2.干擾實驗目的：檢查當所使用的鱟試劑靈敏度是否與標示靈敏度有差異，是否影響檢驗結果目的：檢查鱟試劑、供試品配方、檢查用的水等試驗條件是否影響實驗結果目的：檢查供試品內(nèi)毒素是否合格一細菌內(nèi)毒素的鱟試劑檢查法1.鱟試劑靈敏度復核試驗（1）根據(jù)鱟試劑靈敏度的標示值（λ），將細菌內(nèi)毒素國家標準品或細菌內(nèi)毒素工作標準品用細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ共4個濃度的內(nèi)毒素標準溶液。標示值（λ）：購買的鱟試劑所標示的標示靈敏度。也就是該鱟試劑按照規(guī)定方法能檢測到樣品中內(nèi)毒素的濃度，單位：EU/ml舉例-注射用硫酸鏈霉素中細菌內(nèi)毒素的檢查一、試劑和樣品鱟試劑（批號：040317靈敏度λ：0.25EU/ml；規(guī)格均為0.1ml/支；湛江海洋生物制品廠生產(chǎn)）細菌內(nèi)毒素檢查用水（批號：031229規(guī)格：2ml/支；湛江海洋生物制品廠生產(chǎn)）細菌內(nèi)毒素工作標準品（內(nèi)毒素工作標準品2004-2，160EU/支，中國藥品生物制品檢定所提供）注射用硫酸鏈霉素（規(guī)格：1.0g/1.0ml

批號：20020523生產(chǎn)廠家：大連美羅大藥廠）0.1ml/支規(guī)格鱟試劑原安瓿18支

0.1ml內(nèi)毒素檢查用水4支4支4支4支2支2.0λ內(nèi)毒素溶液1.0λ內(nèi)毒素溶液0.5λ內(nèi)毒素溶液0.25λ內(nèi)毒素溶液內(nèi)毒素檢查用水0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml內(nèi)毒素工作標準品或國家標準品內(nèi)毒素檢查用水溶解15min稀釋37±1℃保溫1h呈陽性呈陰性

復溶細菌內(nèi)毒素檢查法——凝膠法試驗結果（陰、陽性）判定：0.1ml/支規(guī)格鱟試劑原安瓿18支

0.1ml內(nèi)毒素檢查用水4支4支4支4支2支2.0λ內(nèi)毒素溶液1.0λ內(nèi)毒素溶液0.5λ內(nèi)毒素溶液0.25λ內(nèi)毒素溶液內(nèi)毒素檢查用水0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml內(nèi)毒素工作標準品或國家標準品內(nèi)毒素檢查用水溶解15min稀釋37±1℃保溫1h呈陽性呈陰性結果有效計算鱟試劑靈敏度

式中：X為反應終點濃度的對數(shù)值(lg)。反應終點濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個呈陽性結果的濃度。當λc在0.5λ～2.0λ時，方可用于內(nèi)毒素檢查，并以λC為該批鱟試劑靈敏度復溶舉例-注射用硫酸鏈霉素中細菌內(nèi)毒素的檢查2.0λ內(nèi)毒素溶液1.0λ內(nèi)毒素溶液0.5λ內(nèi)毒素溶液0.25λ內(nèi)毒素溶液內(nèi)毒素檢查用水+++++++－++－－

－－－－－－－－陽性λc=0.354EU/ml二細菌內(nèi)毒素的鱟試劑檢查法方法步驟

1.鱟試劑靈敏度復核試驗3.凝膠適量試驗2.干擾實驗目的：檢查當所使用的鱟試劑靈敏度是否與標示靈敏度有差異，是否影響檢驗結果目的：檢查供試品配方、檢查用的水等試驗條件是否影響實驗結果目的：檢查供試品內(nèi)毒素是否合格二細菌內(nèi)毒素的鱟試劑檢查法2.干擾實驗編號內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液———2B2λ/供試品溶液供試品溶液12482λ1λ0.5λ0.25λ4444C2λ/檢查用水檢查用水12482λ1λ0.5λ0.25λ4444D無/檢查用水———2舉例-注射用硫酸鏈霉素中細菌內(nèi)毒素的檢查根據(jù)《臨床用藥須知》和《化學藥品說明書匯編》表明：人體每千克體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量為：5.0EU；硫酸鏈霉素在人均體重60kg，注射時間1小時最大供試品劑量為1.2g；細菌內(nèi)毒素限值：L=K÷M=5.0EU/(kg·h)÷1200mg/(60kg·h)=0.25EU/mg舉例-注射用硫酸鏈霉素中細菌內(nèi)毒素的檢查確定最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)：MVD=CLλ=1000mg/ml×0.25EU/mg0.25EU/mg=1000倍二細菌內(nèi)毒素的鱟試劑檢查法2.干擾實驗按表制備溶液A、B、C和D，使用的供試品溶液應為未檢驗出內(nèi)毒素且不超過最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的溶液，按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。二細菌內(nèi)毒素的鱟試劑檢查法2.干擾實驗編號內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液———2B2λ/供試品溶液供試品溶液12482λ1λ0.5λ0.25λ4444C2λ/檢查用水檢查用水12482λ1λ0.5λ0.25λ4444D無/檢查用水———2二細菌內(nèi)毒素的鱟試劑檢查法2.干擾實驗前提：A和D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的結果在鱟試劑靈敏度復核范圍內(nèi)時，試驗方為有效。按下列計算系列溶液C和B的反應終點濃度的幾何平均值（Es和Et）。

Es=lg-1（ΣXs/4)

Et=lg-1（ΣXt/4)式中

Es、Et分別為系列溶液C和溶液B反應終點濃度的對數(shù)值(lg)。二細菌內(nèi)毒素的鱟試劑檢查法2.干擾實驗當Es在0.5λ~2λ(包括0.5λ和2λ）及0.5Es~2Es（包括0.5Es和2Es）時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。若供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數(shù)下對試驗有干擾，應將供試品溶液進行不超過MVD的進一步稀釋，再重復干擾試驗。注：A為供試品溶液；B為干擾試驗系列；C為鱟試劑標示靈敏度的對照系列；D為陰性對照。二細菌內(nèi)毒素的鱟試劑檢查法方法步驟

1.鱟試劑靈敏度復核試驗3.凝膠適量試驗2.干擾實驗目的：檢查當所使用的鱟試劑靈敏度是否與標示靈敏度有差異，是否影響檢驗結果目的：檢查供試品配方、檢查用的水等試驗條件是否影響實驗結果目的：檢查供試品內(nèi)毒素是否合格二細菌內(nèi)毒素的鱟試劑檢查法3.凝膠適量試驗編號內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A無/供試品溶液2B2λ/供試品溶液2C2λ/檢查用水2D無/檢查用水2二細菌內(nèi)毒素的鱟試劑檢查法3.凝膠適量試驗結果的判斷及處理：1.若陰性對照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對照B的平行管均為陽性，陰性對照溶液C的平行管均為陽性，試驗有效；二細菌內(nèi)毒素的鱟試劑檢查法3.凝膠適量試驗結果判定