家族性高膽固醇血癥患者家系低密度脂蛋白受體基因的克隆與分析

家族性高膽固醇血癥患者家系低密度脂蛋白受體基因的克隆與分析

高脂肪家庭性祖母硬化（fh）是一種常染色體顯性遺傳疾病，是導致動脈硬化（as）和早期冠狀動脈粥樣硬化的重要危險因素。該病的病因是低密度脂質炎（ldl-r）的突變，導致腺體功能異常。在英美等發(fā)達國家,55歲以下的冠心病患者中5%～10%為FH患者。研究LDL-R基因突變對探討LDL-R導致AS機制和防治冠心病具有重要意義。目前在FH患者中已發(fā)現(xiàn)900余種LDL-R基因突變和大量的單核苷酸多態(tài)性。國內外在華人FH患者中已發(fā)現(xiàn)LDL-R基因51種突變,但以國外研究占多數(shù),國內研究相對滯后。本文對1例臨床診斷為FH純合子的先證者及家系成員進行臨床檢查;采用流式細胞儀檢測先證者及其父母外周血淋巴細胞LDL-R表達量和功能;并對LDL-R基因進行PCR結合核苷酸序列分析,以發(fā)現(xiàn)我國LDL-R基因突變的新類型,探討其分子病理機制。1對象和方法1.1血漿置換后1年生fh北京安貞醫(yī)院AS門診收治1例男性患者,18歲,肘、膝、踝關節(jié)多部位皮膚黃色瘤及肌腱黃色瘤逐漸增大,雙眼可見角膜弓,在未服用降脂藥情況下,TC16mmol/L,血漿置換后1年仍未見下降。根據我國臨床診斷FH標準:成人血清TC>7.8mmol/L;16歲以下兒童TC>6.7mmol/L;或成人LDL-C>4.4mmol/L,患者或親屬有腱黃色瘤者診斷為純合子FH,未達純合子標準者診斷為雜合FH。該患者診斷為FH純合子。知情同意后以該患者為先證者收集與其有血緣關系的親屬,共收集到51例,并根據FH診斷標準:TC>6.19mmol/L診斷FH。1.2頸動脈內壓監(jiān)測對先證者及其家系成員進行常規(guī)體格檢查、病史采集,并采用氧化酶法測定血清中TC、LDL-C、TG含量,采用免疫沉淀法測定載脂蛋白AI(ApoAI)和載脂蛋白B100(ApoB100),ELISA法測定Lp(a),根據臨床FH診斷繪制家系圖確定遺傳方式。采用美國飛利浦公司生產的HP4500型、西門子公司Sequioa512彩色超聲診斷儀,探頭頻率為3～11MHz,取頸動脈長軸切面,在距分叉處約1cm范圍內頸總動脈處停幀,測量先證者及其父母頸動脈內膜-中膜厚度(IMT),并采用同樣方法同時檢測其外周血管情況。超聲判斷標準為:IMT>0.10mm為內膜增厚,IMT>0.12mm視為斑塊形成。采用美國ACUSON公司SequoiaC256型彩色多普勒顯像儀,常規(guī)檢測心臟和瓣膜的結構;采用注射泵對先證者靜脈注射腺苷(140μg·kg-1·min-1),應用無創(chuàng)性經胸多普勒結合二次諧波技術,測量注射前后最大冠狀動脈擴張狀態(tài)下的冠狀動脈血流與靜息狀態(tài)下冠脈血流的比值——冠狀動脈血流速度儲備(CFVR),以評價冠狀動脈的生理功能。1.3ladl-r和cd3抗體的流式細胞儀檢測根據我實驗室已建立的流式細胞儀檢測細胞LDL-R表達量和功能的方法,以新鮮外周血經溶血素處理后分別加入FITC標記的抗人LDL-R的抗體和LDL,并加入PE標記的CD3抗體,分別在4℃和37℃條件下孵育,流式細胞儀檢測各標本的平均熒光強度,與正常人比較來評估其細胞表面LDL-R表達量和結合、內化LDL的功能。1.4受影響基因及其突變的分析1.4.1糖凝膠電泳鑒定提取先證者基因組DNA,擴增ApoB100基因3500區(qū)域的片斷309bp。瓊脂糖凝膠電泳鑒定:對鑒定后的PCR產物經正反雙向核苷酸序列分析及與正常序列比對,排除由ApoB100基因3500附近位點突變導致的家族性ApoB100缺陷癥(familialdefectiveapolipoproteinB-100,FDB)。1.4.2核苷酸序列分析參照我實驗室已建立的降落式PCR方法擴增先證者LDL-R基因啟動子和全部18個外顯子,瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產物并送交北京三博測序公司進行核苷酸序列分析,分析結果經BLAST分析后,如發(fā)現(xiàn)錯義突變點將其父母的該片段同樣進行核苷酸序列分析。2結果2.1家系及外周血管檢測結果先證者雙眼可見角膜弓,肘、膝、踝關節(jié)多部位皮膚黃色瘤及肌腱黃色瘤且逐漸增大(圖1),其他家系成員未見類似體征。先證者血清TC、LDL-C水平明顯增高,而TG水平正常范圍;其父母TC水平雖較先證者低,但也明顯高于正常值,分別為12.1mmol/L、9.5mmol/L,符合FH雜合子臨床診斷(表1)。家系成員中共有14人符合FH診斷標準(表2)。根據先證者及其家系成員臨床FH診斷繪制家系圖(圖2),符合顯性遺傳方式。外周血管超聲顯示:先證者雙側頸動脈輕度狹窄(直徑狹窄35%～45%),左頸IMT為0.21cm;右側頸總動脈可見小斑塊形成;左側股總動脈內膜略增厚;雙側椎動脈、鎖骨下動脈、腹主動脈,雙側腎動脈、髂動脈、腘動脈均未見明顯內膜增厚,管腔無明顯狹窄(圖3),其父母外周血管均未見異常變化。先證者的冠狀動脈血流儲備值為2.7(正常參考值為3.0),余心臟結果和功能大致正常。2.2受體內化功能先證者及其父母LDL-R細胞表達量、4℃時受體結合功能都比正常人明顯下降,37℃時受體內化功能未見較正常人異常;但父母的LDL-R功能水平介于先證者和正常人功能之間(表3、圖4)。2.3apo100缺陷癥患者的先證及其缺失基因①先證者ApoB100基因3500區(qū)域:經核苷酸序列分析未發(fā)現(xiàn)ApoB1003500附近位點突變,提示,可排除由于患ApoB100缺陷癥導致臨床表現(xiàn)的可能性。②先證者LDL-R基因:對啟動子及18個外顯子片段的進行核苷酸序列分析,發(fā)現(xiàn)第13外顯子第1864位堿基T取代了G,導致第601位氨基酸由脯氨酸取代了天冬氨酸,為D601Y純合錯義突變(圖5)。③其父母LDL-R基因:在第13外顯子發(fā)現(xiàn)同樣的D601Y雜合突變,提示父母分別將LDL-R突變的等位基因遺傳給先證者。3r基因d601y基因突變FH是一種最為常見且最為嚴重的常染色體顯性遺傳性疾病,其病理基礎是LDL-R基因突變引起細胞膜表面LDL-R缺陷或功能異常,進而體內LDL代謝紊亂,特征為血清TC尤其是LDL-C濃度明顯增高、多部位皮膚、肌腱黃色瘤、脂性角膜弓和早發(fā)AS。本研究收集了1例臨床診斷為FH純合子的家系,對該家系共43例成員進行病史采集、血脂檢測,先證者及其父母進行外周血管超聲、心臟超聲等臨床檢查。先證者肘、膝、踝關節(jié)多部位皮膚黃色瘤及肌腱黃色瘤逐漸增大,雙眼可見角膜弓,TC高達16mmol/L,血漿置換術后1年TC仍未見下降,符合臨床FH純合子診斷標準。超聲顯示先證者雙頸動脈IMT增加,右頸動脈已見小斑塊形成,提示AS進程已經開始;其父母雖TC水平中度升高,但未出現(xiàn)皮膚黃色瘤,外周血管超聲未見內膜增厚。通過家系成員的血脂檢查發(fā)現(xiàn)多例TC增高的患者,該家系是顯性遺傳。,但在我國未見相關報道,提示該LDL-R基因D601Y突變有可能是我國FH人群一種新的突變類型。根據LDL-R代謝途徑,LDL-R基因突變分為合成缺陷、轉運缺陷、結合缺陷、內移缺陷和再循環(huán)缺陷5種類型。該患者攜帶的D601Y突變發(fā)生在第13外顯子,位于LDL-R的表皮生長因子(EGF)前體同源域,此結構為受體與配體在細胞質的內吞體中酸依賴性解離所必需,可能影響LDL-R的再次循環(huán)利用屬再循環(huán)缺陷。本文先證者父親和母親是FH雜合子,其LDL-R基因1個等位基因存在突變,因此僅產生半數(shù)具有正常結構和功能的受體,血漿TC、LDL-C水平中度升高,LDL-R細胞表面表達量和結合LDL的功能較正常人低。純合子為2個等位基因同時存在功能性突變,因此不能表達LDL-R蛋白僅表達有功能缺陷的LDL-R蛋白,因此肝對LDL-C的代謝功能較雜合子更差,血漿LDL-C水平可達正常人的6倍以上,通常于兒童期發(fā)生AS甚至心腦血管意外。本文先證者為FH純合子,外周血管檢查結果證實AS嚴重,TC極度升高可達16mmol/L,LDL-R細胞表面表達量和結合LDL的功能分別僅為正常人的13.6%和21.1%,但內化功能未見下降,與基因突變影響的結構域有關。純合與雜合這種基因劑量效應作用解釋了本研究中先證者及其父母間血脂水平、臨床表現(xiàn)、細胞LDL-R功能諸多方面存在差異。FH純合患者發(fā)病率僅為百萬分之一,但癥狀典型易于被發(fā)現(xiàn);而雜合患者發(fā)病率較高為1/500,我國大約有26000000例潛在患者,男性患者通常在40～50歲出現(xiàn)冠心病癥狀,而女性患者推遲10年。大量流行病學研究證實:超過60%的男性FH雜合患者60歲之前可能患冠心病,女性則多于30%。相應冠心病癥狀男性一般開始于40歲,女性在50歲左右。若按照目前的診斷標準僅能預測出大約1/4的FH病例;大多數(shù)患者直到中年才能得到確診,失去早期治療機會。他汀類、膽固醇吸收抑制劑和正在進行臨床試驗的ISIS301012等藥物能夠有效地降低FH患者的血清TC水平,防治AS進展,并且越早治療患者受益越大,因此早期把FH雜合患者從人群中鑒別出來,將有助于預測其AS危險性,并早期進行干預,延緩并發(fā)癥發(fā)生。本研究對純合子患者的家系成員通過基因診斷的方法可以把FH雜合患者從人群中鑒別出來,并早期進行生活方式和藥物治療,延緩AS的發(fā)生,預防早發(fā)冠心病。綜上所述,本文對1例臨床確診FH純