中華鱉325溫度下卵巢發(fā)育規(guī)律的研究

中華鱉325溫度下卵巢發(fā)育規(guī)律的研究

中國龜（以下簡稱龜）屬于節(jié)肢動物亞門亞門、爬行綱、龜科和甲科，廣泛分布于中國除新疆、西藏和青海以外的其他省份。它是中國最廣泛的水生百合，具有重要的經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值。關(guān)于爬行動物的胚胎發(fā)育,Kaska、Ackerman對海龜(Cheloniamydas),侯陵、劉筠對鱉,劉國安、譚立軍對烏龜(Chinemysreevesii)有過報(bào)道。關(guān)于鱉性腺發(fā)育的研究,國內(nèi)外僅見章龍珍對出殼稚鱉經(jīng)恒溫(水溫31℃±0.5℃)養(yǎng)殖10個(gè)月鱉性腺發(fā)育、劉筠對15日齡至6冬齡鱉性腺發(fā)育的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對鱉胚胎期性腺的發(fā)生、分化及形態(tài)學(xué)和組織學(xué)特征,以及稚鱉和1齡、2齡、3齡、4齡鱉性腺發(fā)育的形態(tài)學(xué)、組織學(xué)特征進(jìn)行全面、系統(tǒng)的研究,這在國內(nèi)外尚未見報(bào)道,現(xiàn)報(bào)道結(jié)果如下。1材料和方法1.1卵卵魚雌性和雄性1齡、2齡、3齡鱉各4只(均為越冬前的鱉),孵化用卵(受精卵)400枚,均為菏澤黃河甲魚養(yǎng)殖場提供;本實(shí)驗(yàn)室孵化出殼7d的雌、雄稚鱉各4只。1.2質(zhì)、比、濕度取鱉受精卵400枚,恒溫箱內(nèi)孵化,孵化基質(zhì)為粗砂、中砂和細(xì)砂,體積比為1∶4∶1,孵化基質(zhì)溫度為(32±0.5)℃,濕度為7%—8%,相對濕度為75%—80%。1.3小鼠睪丸和雄鱉形態(tài)檢查取孵化16—34d的胚體,每天解剖4只。取出殼7d及1齡、2齡雌、雄鱉各4只,解剖,在MoticSMZ-168生物體視數(shù)碼顯微成像系統(tǒng)下對性腺進(jìn)行測量和拍照;解剖3齡、4齡雌、雄鱉各4只,數(shù)碼相機(jī)對性腺拍照,游標(biāo)卡尺測量性腺的大小和卵徑;性腺及鱉的質(zhì)量用電子天平測量。1.4數(shù)碼顯微成像孵化1—16d的胚胎,17d及以后各期胚胎的性腺,出殼7d及1、2、3、4齡鱉的性腺用Bouins’液固定,梯度酒精脫水,石蠟包埋,切片,H.E染色,MoticDMB5-2231數(shù)碼顯微成像系統(tǒng)對其觀察和拍照。2結(jié)果2.1生殖導(dǎo)管和精巢自卵孵化至第16天起,實(shí)體生物顯微鏡下可觀察到最初的生殖腺,位于腹腔后部脊柱兩旁,腎臟的腹方前外側(cè),腸道的背方,呈短細(xì)管狀,表面光滑,無色膠狀透明。外形上早期的精巢和卵巢無區(qū)別,隨著胚胎的逐步發(fā)育,生殖導(dǎo)管在實(shí)體顯微鏡下清晰可辨,精巢向后由附睪延伸形成的輸精管直接相連,輸卵管在卵巢的外側(cè)呈細(xì)管狀且明顯。第16天(圖版Ⅰ-1)、20d、28d、34d胚胎期生殖腺(每組4只的平均值)的大小分別為0.64mm×0.22mm、0.83mm×0.27mm、1.00mm×0.29mm、1.21mm×0.32mm。2.2motortchmz-126生物學(xué)特點(diǎn)稚鱉的卵巢孵化出殼7d的雌性稚鱉4只,質(zhì)量為(3.62±0.40)g;解剖后卵巢隱約可辨,但在MoticSMZ-168生物體視數(shù)碼顯微鏡下卵巢清晰可見(圖版Ⅰ-2),位于腹腔后部脊柱兩旁,腎臟的腹方前外側(cè),與橘黃色的腎上腺相鄰,呈短細(xì)管狀,一側(cè)卵巢大小為(1.37±0.14)mm×(0.51±0.07)mm,無色透明,表面光滑,靠系膜聯(lián)于體腔背側(cè)。輸卵管在卵巢的外側(cè),明顯可見。1解剖位置不同4只幼鱉的質(zhì)量及相應(yīng)同側(cè)卵巢的質(zhì)量和大小分別為(36.17±5.92)g、(0.058±0.005)g和(7.60±0.95)mm×(2.94±0.45)mm;卵巢的解剖位置同稚鱉;但卵巢肉眼可辨;解剖鏡下可觀察到無色、膠狀、透明的卵泡。2g、2.c.c.320.320.320.320.320.320.320.320.320.323.323.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.325.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.324.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.3254只幼鱉的質(zhì)量,相應(yīng)同側(cè)卵巢的質(zhì)量和大小分別為(165.75±7.72)g、(2.78±0.38)g和(45.9±4.08)mm×(4.10±0.47)mm;肉眼觀察可見卵泡,圓形、無色、膠狀、透明,少數(shù)卵泡開始變成淡黃色。3性卵炎4只雌幼鱉的質(zhì)量為(331.75±39.37)g;解剖,可見卵巢內(nèi)大、中、小三種發(fā)育不等的卵泡,少數(shù)卵母細(xì)胞進(jìn)入成熟期,最大卵泡的直徑達(dá)7.57mm,卵泡呈黃色,成熟的卵泡從卵巢表面隆出,形成卵泡囊,卵泡囊表面布滿毛細(xì)血管。4成熟性卵胞4只成鱉的質(zhì)量分別為(589.25±111.55)g;解剖可見,卵巢發(fā)育至成熟期,卵泡充滿卵巢(圖版Ⅰ-3),成熟卵泡黃色位于卵泡囊內(nèi),卵泡囊表面密布毛細(xì)血管;卵泡直徑大小不等,小的1.00mm,最大達(dá)14.40mm,1對卵巢內(nèi)卵徑大于5mm的卵泡有的多達(dá)70個(gè)。2.3黑鱉精巢的制備精巢位置同卵巢;解剖出殼7d稚鱉,實(shí)體顯微鏡下稚鱉、1齡幼鱉的精巢呈短管狀,光滑,膠狀,無色透明,輸精管聯(lián)于精巢的后方(圖版Ⅰ-4);2齡、3齡和4齡鱉的精巢均呈長橢圓形,乳白色,大小有別,切開3齡末和4齡精巢可見白色的精液流出。各期鱉精巢的質(zhì)量、大小見表1(因稚鱉的精巢較小,難以解剖,故未能稱重)。2.4離子束卵原細(xì)胞稚鱉的卵泡卵巢內(nèi)由結(jié)締組織纖維、毛細(xì)血管和生殖上皮形成的卵巢膜和基質(zhì)組成,并把卵巢分成一個(gè)個(gè)小室,是原始卵泡在此生長、發(fā)育的場所。在卵巢腔內(nèi),可見卵原細(xì)胞和由卵原細(xì)胞向初級卵泡過渡的卵泡。卵原細(xì)胞直徑約14μm,中央有1個(gè)大的細(xì)胞核,細(xì)胞質(zhì)少,外周無濾泡細(xì)胞;早期的初級卵泡,直徑約76—94μm,外有一層濾泡細(xì)胞,無空泡出現(xiàn),卵核大呈紡錘形(圖版Ⅰ-5)。1空泡性卵母細(xì)胞的發(fā)育1齡幼鱉卵巢的發(fā)育處于初級卵泡期,卵巢內(nèi)有發(fā)育的初級卵泡。卵泡內(nèi)的初級卵母細(xì)胞圓形或稍橢圓形,體積較大,卵徑約166—210μm,外被一層濾泡細(xì)胞和一層營養(yǎng)細(xì)胞;卵核大而圓形,染色質(zhì)開始分散呈空泡狀,核仁大而明顯4—6個(gè),初級卵母細(xì)胞內(nèi)由于空泡的出現(xiàn),卵核受擠壓遠(yuǎn)離中央偏向卵膜(圖版Ⅱ-1)。濾泡細(xì)胞近立方形,排列緊密,核大呈紡錘形。2無卵黃顆粒的形成機(jī)制2齡幼鱉的卵巢處于生長卵泡期的小生長期。生長期的卵泡體積不斷增大,直徑350—420μm,內(nèi)部的空泡逐漸破散成許多小泡,隨著大空泡的逐漸消失,擠壓卵核的壓力逐漸減小直至消除,卵核重新回到卵母細(xì)胞的中央,卵核上清晰可見多個(gè)核仁;無卵黃顆粒形成;濾泡細(xì)胞由單層變?yōu)殡p層,營養(yǎng)細(xì)胞也增至2—3層,營養(yǎng)細(xì)胞層上形成許多小囊(圖版Ⅱ-2)。3早、中、晚期卵核和卵黃顆粒分布3齡幼鱉的卵母細(xì)胞處于大生長期,少數(shù)進(jìn)入成熟期。卵巢內(nèi)三種發(fā)育不等的卵泡中,小的發(fā)育至初級卵泡,直徑446—486μm;中等的發(fā)育至大生長期的早、中、晚期,早期的卵核偏向動物極,直徑502—546μm,卵黃顆粒在卵的周圍開始積累(圖版Ⅱ-3),呈圓形,著色較深,并逐步向卵的中央擴(kuò)展(圖版Ⅱ-5);晚期的卵核偏至動物極(圖版Ⅱ-4),核仁明顯,且數(shù)量增多,卵徑大于1.00mm。中期、晚期,濾泡外的營養(yǎng)細(xì)胞層發(fā)達(dá),小囊增大。4發(fā)酵泡菜、生長泡菜、成熟性泡菜4齡鱉的卵巢內(nèi)同時(shí)存在卵原細(xì)胞、初級卵泡、生長卵泡和成熟卵泡。成熟卵泡位于卵泡囊內(nèi),充滿整個(gè)卵巢,卵泡囊壁密布毛細(xì)血管,其間散布著卵徑不等的生長卵泡。2.5精原細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)胚胎期和稚鱉的精巢切片觀察,自孵化的第72h開始,原始生殖細(xì)胞形成并移向中腸附近的內(nèi)胚層,至第5天生殖嵴逐漸形成;第11天生殖腺接近形成,起初生殖嵴與胚胎腎聯(lián)系緊密,隨后界限逐漸明顯(圖版Ⅱ-6);第13天性腺分化出皮部和髓部(圖版Ⅱ-7)。第16天,原始生殖細(xì)胞開始分化,第22天生殖腺分化結(jié)束,形成精巢或卵巢,第34天孵化出殼的稚鱉尚未出現(xiàn)典型的精巢結(jié)構(gòu),精小葉和精小管尚未形成,但可見到精原細(xì)胞。出殼7d的稚鱉,精巢內(nèi)部精小管結(jié)構(gòu)已初步形成,但管腔不明顯,數(shù)目較少,半徑處于167—175μm之間,排列不夠規(guī)則。精巢處于增殖期,精原細(xì)胞數(shù)量較少(圖版Ⅱ-8)。1—4齡鱉的精巢1齡鱉的精巢,曲細(xì)精管內(nèi)只有精原細(xì)胞組成,且分布較散,曲細(xì)精管的半徑在310—590μm之間(圖版Ⅱ-9);2齡精巢,曲細(xì)精管的生精上皮除有精原細(xì)胞外,初級精母細(xì)胞也已出現(xiàn);3齡末,鱉的曲細(xì)精管的半徑在750—870μm之間(圖版Ⅱ-10),緊靠基膜處,有精原細(xì)胞2—3層,向內(nèi)是2—3層初級精母細(xì)胞,精細(xì)胞和少量的精子(圖版Ⅱ-11);4齡鱉精巢的曲細(xì)精管的半徑在520—910μm之間(圖版Ⅱ-11,12),除靠近基膜的精原細(xì)胞和初級精母細(xì)胞之外,還有大量通向管腔的精細(xì)胞和精子。2.6生精細(xì)胞的發(fā)育在油鏡下觀察,性成熟鱉的曲細(xì)精管,同哺乳動物的曲細(xì)精管發(fā)育一樣,由基膜向管腔依次可見精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞、精細(xì)胞、精子(圖版Ⅱ-11)。精原細(xì)胞核明顯,呈圓形或橢圓形,體積最大,半徑為29—36μm。根據(jù)精原細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)可將精原細(xì)胞分為A型和B型。A型按核的著色深淺不同又分為A型暗核精原細(xì)胞(Ad型)和A型亮核精原細(xì)胞(Ap型),其中Ad型精原細(xì)胞核染色深,Ap精原細(xì)胞型核染色淺,染色質(zhì)都細(xì)小。Ad型精原細(xì)胞型中一部分分化為Ap型精原細(xì)胞,Ap型精原細(xì)胞再進(jìn)一步分化為B型。B型核內(nèi)染色質(zhì)呈塊狀,核仁位于中央,它最后分化為初級精母細(xì)胞(圖版Ⅱ-11,12)。初級精母細(xì)胞由精原細(xì)胞分裂而來,體積略小。細(xì)胞核圓形,半徑為21—28μm。由于分裂歷時(shí)較長,在切片上,可見到初級精母細(xì)胞的不同發(fā)育階段。次級精母細(xì)胞由初級精母細(xì)胞完成第1次成熟分裂形成,體積更小。細(xì)胞核圓形,半徑為20—24μm。由于次級精母細(xì)胞存在的時(shí)間很短,故在切片中較少見。精細(xì)胞因次級精母細(xì)胞存在的時(shí)間較短,很快就進(jìn)行第2次成熟分裂形成精細(xì)胞。這一過程是連續(xù)而復(fù)雜的。鱉的精細(xì)胞核呈飽滿的圓球形,位于細(xì)胞中央,著色淡,半徑為18—19μm。精子在油鏡下觀察,鱉的精子呈細(xì)長的蚯蚓狀,略有彎曲,總長約79μm。精子結(jié)構(gòu)由頭部、連接段、中段、主段和末段組成。3討論3.1溫度對鱉胚發(fā)育的影響鱉屬變溫動物,實(shí)驗(yàn)證實(shí),適于鱉胚胎發(fā)育的溫度范圍是(22—36)℃,最適宜的溫度范圍是(31—33)℃,低于22℃胚胎發(fā)育停止,高于34℃孵化率降低,37℃為致死溫度,在適于鱉胚發(fā)育的溫度范圍內(nèi),隨孵化溫度的升高發(fā)育速度加快,孵化周期縮短。本實(shí)驗(yàn)表明:在(32±0.5)℃溫度下孵化鱉卵,自孵化開始,至最初的原始生殖細(xì)胞開始遷移、生殖嵴形成、性腺開始分化、精巢或卵巢形成,分別需要孵化至第3、5、16和22天。3.2黑鱉精巢的發(fā)育情況胚胎期、7d稚鱉和1齡幼鱉的精巢與卵巢,外形上難以區(qū)別,均呈短細(xì)管狀,只有從生殖導(dǎo)管與生殖腺的位置關(guān)系,才能區(qū)分精巢和卵巢;隨著鱉齡的增加,精巢與卵巢的大小及質(zhì)量均呈增加趨勢;2齡、3齡、4齡鱉的卵巢內(nèi)發(fā)育的卵泡,隨著鱉齡的增加,也逐漸增大,肉眼可見卵泡直徑的范圍在1.00—14.40mm,顏色由無色透明到淺淡黃色再到黃色,卵巢的體積逐漸增大,由幾個(gè)毫米發(fā)育到幾個(gè)厘米,4齡以后占據(jù)整個(gè)體腔的2/3以上;2齡、3齡、4齡鱉的精巢均呈長橢圓形,乳白色,大小不同,同齡鱉的精巢因個(gè)體大小的差異質(zhì)量也不相等。隨著雄鱉的性成熟,精巢的發(fā)育速度迅速增長。1齡、2齡、3齡、4齡鱉精巢的鮮重占體重百分比(生殖腺指數(shù))的平均值約為0.31%、0.36%、0.51%、1.00%,顯然4齡成鱉的生殖腺指數(shù)比3齡幼鱉的高出近一倍。作者僅對第一個(gè)性周期內(nèi)精巢的變化進(jìn)行報(bào)道,未對4齡以后精巢的周期性變化進(jìn)行研究,Lofts和Tsui報(bào)道我國南方鱉雄性的性周期,發(fā)現(xiàn)精子發(fā)生從5月份開始,6、7、8月份精子繼續(xù)產(chǎn)生,9月份精子形成旺盛,精巢在10—11月達(dá)最大重量,11月至翌年2月份,精子釋放后,精巢質(zhì)量迅速下降。3.3不同樹齡鱉的卵巢發(fā)育情況鱉卵巢的發(fā)育先后經(jīng)過卵原細(xì)胞期、初級卵泡期、生長卵泡期、成熟卵泡期,這一結(jié)果與其他高等脊椎動物的卵巢發(fā)育分期相一致。胚胎期的卵巢內(nèi)開始出現(xiàn)零散的卵原細(xì)胞,孵化出殼7d的稚鱉,其卵巢發(fā)育至卵原細(xì)胞期;1齡鱉的卵巢發(fā)育至初級卵泡期,卵原細(xì)胞的周圍包被濾泡細(xì)胞,內(nèi)有空泡,卵核被擠壓至細(xì)胞邊緣;2齡、3齡鱉的卵巢處于生長卵泡期,卵核重返細(xì)胞中央,核仁多個(gè),出現(xiàn)燈刷染色體,卵黃自卵周開始沉積并逐漸向中央發(fā)展,3齡末的卵巢內(nèi)可見成熟卵泡;4齡鱉的卵巢發(fā)育至成熟卵泡期,卵核定位于動物極,內(nèi)有大量的成熟卵泡。研究表明,卵原細(xì)胞外無濾泡細(xì)胞,這一結(jié)果與劉筠等的結(jié)論相一致,與陳發(fā)揚(yáng)等的卵原細(xì)胞外周有濾泡細(xì)胞包圍的結(jié)論相違;初級卵母細(xì)胞外有一層濾泡細(xì)胞和一層營養(yǎng)細(xì)胞包圍,與陳發(fā)揚(yáng)