渣油細(xì)菌的篩選及降解能力研究

渣油細(xì)菌的篩選及降解能力研究

據(jù)推測(cè)，世界上約有1.109噸石油及其產(chǎn)品通過各種方式進(jìn)入地下水、地表水和土壤。隨著經(jīng)濟(jì)的快速增長，中國的石油環(huán)境管理任務(wù)變得越來越緊迫。生物修復(fù)技術(shù)用于處理石油污染沒有二次污染，處理成本低，可以完全分解污染物。作者從遼河油田渣油中經(jīng)富集,分離出幾十株石油降解菌,經(jīng)過初篩后,選出8株降解能力強(qiáng)的菌株,進(jìn)一步研究了其對(duì)石油不同組分的降解能力,并對(duì)降解能力強(qiáng)的菌株進(jìn)行了初步的鑒定,以應(yīng)用于石油污染的生物修復(fù).1材料和方法1.1遼河油田渣油分離菌種油,取自遼河油田渣油,塊狀并混有少量泥沙.降解效果用油,遼河油田渣油及用常規(guī)石油分離方法分成的飽和烴、芳香烴、非烴和瀝青質(zhì)4個(gè)成分.1.2培養(yǎng)基1.2.1培養(yǎng)基的制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基;2倍稀釋牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基;10倍稀釋牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,原油量為3g/L;無機(jī)鹽培養(yǎng)基(g/L):K2HPO4·3H2O1,KH2PO41,MgSO4·7H2O0.5,NH4NO31,CaCl20.02,FeCl3痕量,原油3,pH值7.2～7.4.1.2.2表面保存培養(yǎng)基1.2.3液體培養(yǎng)基g.l1.3牛肉膏蛋白的純化無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加1%(w/v)原油樣品,30℃搖床培養(yǎng)7d,取富集液2mL接種相同新鮮培養(yǎng)基,相同條件下培養(yǎng)7d,如此連續(xù)富集培養(yǎng)30d,以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板進(jìn)行分離純化,純化后的菌株保存于牛肉膏蛋白胨斜面.1.4脫脂棉過濾菌液降解將活化的斜面培養(yǎng)物接至裝有30mL液體培養(yǎng)基的100mL三角瓶中培養(yǎng),搖瓶轉(zhuǎn)速180r/min,溫度30℃.培養(yǎng)7d后,以在氯仿中預(yù)先處理過的脫脂棉過濾菌液,蒸餾水多次洗滌,脫脂棉60℃干燥,用氯仿對(duì)原油重新回收,自然干燥后稱取殘重,每一處理重復(fù)3次計(jì)算平均降解率.1.5原油不同成分的降壓試驗(yàn)將活化的斜面培養(yǎng)物接至裝有30mL液體培養(yǎng)基的100mL三角瓶中培養(yǎng)30d,搖瓶轉(zhuǎn)速180r/min,溫度30℃.殘油的回收同上.1.6rtorusb211dd的量表降解率用降解前后油的失重表示,采用sartoriusBP211Dd=0.01mg的分析天平定量;采用色譜法和質(zhì)譜法對(duì)各單組分油降解前后的組成進(jìn)行分析.1.7識(shí)別菌株和其他疾病根據(jù)細(xì)菌分類手冊(cè)的標(biāo)準(zhǔn),對(duì)分離到的部分菌株進(jìn)行了初步的形態(tài)觀察和生理生化試驗(yàn),初步鑒定到屬.2結(jié)果與分析2.1病毒固產(chǎn)分析的結(jié)果經(jīng)富集分離共得到24株細(xì)菌(編號(hào)ptr1～ptr24)和幾株真菌,均具有一定的石油降解能力.2.2降解率的比較及ptr1、ptr5和ptr5的降解情況以原油為唯一碳源接種,對(duì)所分離的菌株進(jìn)行降解能力的初步研究,對(duì)照為不接菌的石油培養(yǎng)液,降解效果見表1.由表1可見,經(jīng)7d降解后不同菌對(duì)原油的降解率明顯不同,對(duì)照降解率為4.6%,菌株降解率最高可達(dá)到41%,而最低只有7.3%,共有10株菌的降解率達(dá)到30%以上,結(jié)合降解過程中的現(xiàn)象觀察,選取ptr1、ptr4、ptr5、ptr10、ptr13、ptr14、ptr15和ptr20菌株作進(jìn)一步的研究.2.3瀝青質(zhì)、ptr15對(duì)芳香烴的降解率不同的石油降解菌對(duì)于石油中不同的烴類具有不同的降解能力,據(jù)報(bào)道,多數(shù)石油降解菌只能利用一種或幾種烴類.石油烴中的中長鏈飽和烴易于被微生物利用,而短鏈烷烴和芳烴等難于降解,甚至對(duì)微生物具有一定的毒性.作者研究了所篩選的8株菌對(duì)原油的不同組分,飽和烴、芳香烴、非烴和瀝青質(zhì)的降解效果,結(jié)果見表2.由表2可見,原油不同組分可被降解的程度不同,芳香烴的降解率較高,可達(dá)80%;瀝青質(zhì)的最大降解率為53%;飽和烴的最大降解率為37%;非烴的最大降解率為30%.不同菌對(duì)各組分的降解能力也不同.ptr15對(duì)飽和烴和非烴的降解率最高,分別為37%和30%;ptr13對(duì)芳香烴的降解率最高,為80%;ptr20對(duì)芳香烴的降解率為69%;ptr10和ptr20對(duì)瀝青質(zhì)的降解率均為53%,ptr5降解率為50%.由表2還可看出,所篩選的菌株都對(duì)芳香烴和瀝青質(zhì)具有高的降解率,這與芳香烴和瀝青質(zhì)在結(jié)構(gòu)上的相似性是吻合的.PotterThomasL等人對(duì)CerroNegro的瀝青質(zhì)降解試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在37℃,添加碳氮源的情況下好氧培養(yǎng)60d,瀝青質(zhì)的最高降解率為40%,而作者所篩菌株對(duì)瀝青質(zhì)的降解率比其提高13%,且降解時(shí)間由60d縮短一半,具有良好的應(yīng)用前景.2.4在石油中不同成分的骨折前后分析綜合考慮了芳香烴和飽和烴的降解結(jié)果,選取飽和烴和芳香烴降解程度都比較高的ptr15和ptr20的降解產(chǎn)物作色譜分析.2.4.1gc-ms分析對(duì)飽和烴進(jìn)行色譜分析發(fā)現(xiàn),未經(jīng)降解的對(duì)照樣品中缺失正構(gòu)烷烴系列,而甾烷和萜烷豐度較高,表明所用樣品已在自然條件下被部分降解,增加了進(jìn)一步降解的難度.降解后,短鏈烷烴峰消失,表明所用菌株都對(duì)短鏈烷烴具有強(qiáng)的降解能力,但是,從色譜圖上無法分辨各菌株降解能力的差異,故進(jìn)行了GC-MS圖譜分析.圖1是菌株ptr15和ptr20的M/z82的GC-MS圖譜.由圖1可見,與對(duì)照相比,烷基環(huán)己烷發(fā)生明顯降解,ptr20的降解能力優(yōu)于ptr15.結(jié)合M/z92、M/z123質(zhì)量色譜圖變化規(guī)律表明,烷基環(huán)己烷、長鏈烷基苯和二環(huán)烷系列都能有效被微生物降解,且ptr20的降解能力要高于ptr15,這與總離子流圖所反映的變化相吻合.2.4.2菲、甲基菲的降解圖2是菌株ptr15和ptr20的M/z178、M/z192的GC-MS圖譜,即三環(huán)的菲和蒽以及甲基菲的碎片特征離子,M/Z192即M/Z(178+14)(1個(gè)甲基-1個(gè)氫原子),將2種離子放在一起,主要是為了查看菲與甲基菲的分布特征.從芳烴總離子流圖上看(圖未列出),降解前芳烴的組成以輕質(zhì)組分為主,ptr15或ptr20菌降解后輕質(zhì)組分均缺失.并且在總離子流圖上較后的位置出現(xiàn)了明顯的“鼓包(UCM)”降解前后m/z128、m/z142、m/z156和m/z170質(zhì)量色譜圖分布特征表明(圖未列出),原始樣品中含有完整的萘、甲基萘和C2、C3取代的萘系列,但降解后樣品中只殘存極微量的萘,烷基萘系列幾乎消耗殆盡.對(duì)比降解前后m/z178、m/z192和m/z252質(zhì)量色譜圖特征發(fā)現(xiàn),所選菌株對(duì)三環(huán)的菲和甲基菲以及五環(huán)的苯并芘在現(xiàn)有降解條件下降解作用不明顯.不同菌株對(duì)芳烴中不同組分的降解能力無明顯差異.2.5菌株鑒定結(jié)果根據(jù)降解能力及降解過程中的現(xiàn)象觀察結(jié)果,對(duì)所篩選的8株菌中的5株進(jìn)行了菌體形態(tài)特征及生理生化試驗(yàn),結(jié)果見表3.根據(jù)常用細(xì)菌鑒定方法,初步確定ptr10為假單胞菌屬,ptr13為棒狀桿菌屬,ptr14為假單胞菌屬,ptr15為芽孢桿菌屬,ptr20為微桿菌屬.3不同成分的芳香烴降解石油是由上千種化學(xué)性質(zhì)不同的化合物組成的復(fù)雜混合物,主要由烴類和非烴類組成,其中烴類占95%～99.5%.烴類主要有烷烴、芳香烴、環(huán)烷烴、稠環(huán)和雜環(huán)化合物,還有少量瀝青質(zhì)和其他有機(jī)物.不同微生物對(duì)石油各組分的降解率是不同的,其中飽和烴的降解率最高,其次是低分子量的芳香烴類化合物,而高分子量的芳香烴類化合物、樹脂和瀝青質(zhì)則極難降解.石油組成成分的差異也影響其生物降解率.低硫、高飽和烴的粗油最易降解,高硫、高芳香烴類化合物的純油最難降解,所以目前對(duì)烴類化合物降解的研究主要集中在毒性較強(qiáng)的芳香族化合物.除飽和烴的降解不符合此規(guī)律外,芳香烴的降解率最高,可達(dá)80%;其次是瀝青質(zhì);而非烴的降解率最低,只有30%.飽和烴的降解速率最快,48h已經(jīng)部分乳化,推測(cè)降解產(chǎn)物可能是一些小分子的、非水溶性短鏈烴.通過GC-MS圖譜分析發(fā)現(xiàn),樣品已在自然條件下被部分降解,而烷基環(huán)己烷、長鏈烷基苯和二環(huán)烷系列能有效被微生物降解,這與推測(cè)基本相符.4芽孢桿菌屬bacl4.1分離篩選出8株降解能力強(qiáng)的菌株,對(duì)其中的部分菌株初步鑒定到屬,分別屬于假單胞菌屬(Pseudomonas);棒狀桿菌屬(Corynebacterium);芽孢桿菌屬(Bacillus);微桿菌屬(Corynebacterium).4.2石油中不同組分可被微生物降解的