16份魚腥草材料抗氧化活性研究

16份魚腥草材料抗氧化活性研究

魚糞草原植物為三白草科的豬尾胡明，屬于衛(wèi)生部確定的兩層植物資源之一。峨眉蕺菜(H.emeiensisZ.Y.ZhuetS.L.Zhang),又叫白魚腥草,發(fā)現(xiàn)于四川峨眉山,該種在當(dāng)?shù)匾沧鳛轸~腥草使用。豐富的多酚是魚腥草發(fā)揮醫(yī)藥和保健作用的重要活性成分之一。植物多酚(包含黃酮),廣泛存在于植物中,既可影響食物的風(fēng)味(多酚味酸、澀),同是也與抗氧化、抗心血管疾病、抗腫瘤等生物活性密切相關(guān)。川渝地區(qū)魚腥草資源豐富,在野生環(huán)境下經(jīng)長期演變形成了遺傳背景不同、化學(xué)成分有差異的生態(tài)類型。本課題組曾對(duì)主要在這一地區(qū)收集的魚腥草資源從細(xì)胞學(xué)、分子標(biāo)記等方面開展過遺傳多樣性研究,進(jìn)行過揮發(fā)油成分以及槲皮素含量分析等。形態(tài)、化學(xué)成分、染色體數(shù)目和分子標(biāo)記研究都揭示了這些材料間的豐富變異,并且研究表明遺傳背景與其化學(xué)組成和含量間存在一定的關(guān)系,但尚未對(duì)這些資源的多酚和黃酮含量及其抗氧化活性進(jìn)行過探討。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)16份綜合農(nóng)藝性狀較好的魚腥草材料的多酚和黃酮含量及其抗氧化活性進(jìn)行比較,以期為選育抗氧化能力強(qiáng)、營養(yǎng)價(jià)值高的魚腥草品種提供一定科學(xué)依據(jù)和參考。1材料和方法1.1材料來源及處理魚腥草材料為16份綜合農(nóng)藝性狀好(通過多年的田間栽培實(shí)驗(yàn),選育的生長旺盛,產(chǎn)量較高,抗病性、抗逆性較強(qiáng)的材料)。的魚腥草材料,含1份峨眉蕺菜,其基源由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與理學(xué)院植物教研室楊瑞武教授鑒定。材料的來源及染色體數(shù)目見表1。自2001年收集后,種植保存于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)科研實(shí)習(xí)場(chǎng),栽培條件一致,常規(guī)水肥管理。2009年10月將根挖出,將每份材料種植于3個(gè)重復(fù)小區(qū)內(nèi),小區(qū)面積為(4×2.5)m2,每個(gè)小區(qū)用種量為3kg根。2010年6月采集,自然陰干,粉碎。Folin-Ciocalteu試劑、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、β-胡蘿卜素、水溶性VE(Trolox)、2,2’-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)均為分析純西隴化工公司;沒食子酸、蘆丁美國Sigma-Aldrich公司。1.2儀器和檢測(cè)方法RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠;7200型分光光度計(jì)尤尼科(上海)食品有限公司;KQ-100B型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;HH-4恒溫水浴鍋國華電器有限公司。1.3方法1.3.1魚腥草提取液的制備分別取陰干的不同魚腥草材料,粉碎,過0.315mm篩。準(zhǔn)確稱取3.00g魚腥草粉末,用50mL體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇超聲提取3次,將3次所得提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干,用95%的乙醇溶解,定容到100mL容量瓶,即得魚腥草提取液(以下簡稱提取液)。1.3.2穩(wěn)定性測(cè)定測(cè)定方法參考文獻(xiàn)。取7個(gè)50.0mL容量瓶,向其中加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1mL的500μg/mL沒食子酸溶液,然后依次加入2.0mL20%碳酸鈉緩沖液和1.5mLFolin-Ciocalteu顯色劑,蒸餾水定容。在55℃保溫1.5h,測(cè)定波長760nm處的吸光度。線性回歸方程為:y=1.7332x-0.0692(R2=0.9987),式中,x為沒食子酸溶液質(zhì)量濃度/(μg/mL),y為A760nm。吸取提取液0.5mL,按標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟反應(yīng)后,測(cè)定吸光度,將結(jié)果單位換算為每克干魚腥草中所含的多酚相當(dāng)于沒食子酸的毫克數(shù)(mg/g)。1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作測(cè)定方法參照參考文獻(xiàn)。分別加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0mg/mL的75%乙醇溶液)0、1、2、3、4、5mL于6支15mL刻度試管中,然后加入0.3mL0.5%的NaNO2,靜置6min。加入0.3mL10%Al(NO3)3,再靜置6min。加入4mLNaOH,最后用蒸餾水定容到10mL,在室溫條件下反應(yīng)15min后,于510nm波長處測(cè)定吸光度。最后根據(jù)反應(yīng)液中蘆丁的質(zhì)量濃度(x,mg/mL)與吸光度A510nm制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=1.0332x+0.014,R2=0.999)。吸取1mL魚腥草提取液,按上述步驟反應(yīng)后,測(cè)定吸光度。將結(jié)果單位換算為每克干魚腥草中所含的多酚相當(dāng)于沒食子酸的毫克數(shù)(mg/g)。1.3.4線性范圍的考察參照參考文獻(xiàn)測(cè)定。將總提取液稀釋10倍,取0.1mL稀釋液加入10mL的試管中,加入3.9mLDPPH反應(yīng)液。用相同體積的95%的乙醇作空白對(duì)照。在暗處反應(yīng)30min后測(cè)定在波長為515nm處測(cè)定吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:取濃度為0、200、400、600、800、1000μmol/L的Trolox標(biāo)準(zhǔn)液(精密稱取0.0626g的Trolox標(biāo)準(zhǔn)品用無水乙醇定容到50mL,濃度為5mmol/L,制成母液。使用前再用蒸餾水稀釋)加入10mL試管中,加入3.9mLDPPH反應(yīng)液(12.5mgDPPH溶解到甲醇溶液中,定容到100mL,使用時(shí)再稀釋到25mg/mL,并現(xiàn)配現(xiàn)用)。用相同體積的95%的乙醇作空白對(duì)照。在暗處反應(yīng)30min后測(cè)定在波長為515nm處測(cè)定吸光度。得到線性回歸方程:y=-0.0004x+0.634(R2=0.9986),式中:x為Trolox標(biāo)準(zhǔn)液濃度/(μmol/L),y為A515nm。最后按制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線將魚腥草的抗氧化能力值表示為每克魚腥草(干質(zhì)量)所具有的抗氧化能力相對(duì)于多少微摩爾Trolox即為μmol/g。1.3.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參照參考文獻(xiàn)測(cè)定。將0.1mL魚腥草提取液的稀釋液(體積比1:10)加入10mL的試管中,加入ABTS反應(yīng)溶液(5mL7mmol/LABTS溶液和88μL140mmol/L的過硫酸鉀溶液避光反應(yīng)12h,用時(shí)用乙醇稀釋到在波長732nm處吸光度為(0.70±0.02))1mL,反應(yīng)30min后,測(cè)定在波長為734nm處的吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:取0、200、400、600、800、1000μmol/L按上述反應(yīng)并測(cè)定吸光度。按Trolox濃度(x,μmol/L)和吸光度(y,A734nm)繪成標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=-0.0007x+0.7081(R2=0.9994)。最后按制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線將魚腥草的抗氧化能力值表示為每克魚腥草(干質(zhì)量)所具有的抗氧化能力相對(duì)于多少微摩爾Trolox,即為μmol/g。1.4處理數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;并將材料進(jìn)行系統(tǒng)聚類,數(shù)據(jù)不轉(zhuǎn)換,聚類距離采用歐氏距離,聚類方法選擇類平均法。2結(jié)果與分析2.1活性物質(zhì)含量與表面活性劑之間的關(guān)系2.1.1不同材料總酚含量本實(shí)驗(yàn)所測(cè)定的各魚腥草資源材料葉片中,多酚含量差異很大。由表2可見,最小值出現(xiàn)在峨眉蕺菜W01-86為7.01mg/g,最大值為蕺菜W01-52,為15.0mg/g。參試的16份材料中,共有8份材料多酚含量達(dá)到10mg/g。還可以看出,峨眉蕺菜總酚含量與其他材料有一定差異。但峨眉蕺菜總酚含量與W01-5、W01-16、W01-34、W01-39、W01-45、W01-46、W01-92未達(dá)到極顯著差異。2.1.2lg/g標(biāo)準(zhǔn)溶液供試的16份魚腥草資源材料黃酮含量在3.56~11.0mg/g之間。以W01-100和W01-98中含量最高;峨眉蕺菜W01-86含量最低。2.1.3抗氧化能力分析16份魚腥草材料的DPPH實(shí)驗(yàn)抗氧化值差異很大。其中有W1-94、W01-98和W01-100的DPPH法抗氧化能力超過200μmol/g,分別為202、248、242μmol/g。3份材料DPPH法抗氧化能力小于100,分別是W01-16為95.9μmol/g,W01-34為91.1μmol/g,W01-92為84.7μmol/g。其余10個(gè)居群的DPPH法抗氧化能力在100~200μmol/g之間。2.1.4綜合評(píng)價(jià)法測(cè)定的抗逆性結(jié)果供試材料ABTS法抗氧化能力在78.4~218μmol/g之間。其中最高為W01-94,最低為W01-86。2.2dpph法與總酚及總酮含量的相關(guān)性由表3可知,魚腥草染色體數(shù)目與總酚含量相關(guān)性系數(shù)為0.4468,未達(dá)顯著水平;總酚與黃酮的相關(guān)系數(shù)為0.7886,達(dá)到極顯著水平,即總酚含量高的魚腥草材料,黃酮含量往往也較高;DPPH法與魚腥草居群的染色體數(shù)目相關(guān)性不顯著(r=0.3983),與總酚和黃酮含量間相關(guān)性極顯著,相關(guān)系數(shù)分別為0.7200和0.9718;ABTS法與魚腥草染色體數(shù)目相關(guān)性不顯著,與總酚、黃酮和DPPH等反映酚類成分和抗氧化活性的指標(biāo)間呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.9133、0.8325和0.7941。2.3樣品類及體外抗氧化能力的研究以16份魚腥草材料總酚含量、黃酮含量、DPPH法和ABTS法抗氧化能力為指標(biāo),進(jìn)行聚類分析,其聚類結(jié)果如圖1所示。以歐氏距離大于70,可以將16份材料劃為兩類,Ⅰ類包括W01-4、W01-37、W01-46、W01-5、W01-16、W01-34、W01-92、W01-86、W01-39、W01-71和W01-45等11個(gè)居群,該類下各居群總酚、黃酮、DPPH法和ABTS法抗氧化能力均較低;Ⅱ類包括W01-52、W01-99、W01-94、W01-98和W01-100等5個(gè)居群,該類下總酚含量、黃酮含量、DPPH法和ABTS法抗氧化能力均較高。陳黎等按魚腥草揮發(fā)油的成分將魚腥草分為癸醛型(D型)和月桂烯型(M)型魚腥草,并且M型相對(duì)于D型具有更高含量的單萜類和倍半萜類化合物。本研究中,Ⅱ類5份材料全是M型,并且染色體數(shù)目都超過80;Ⅰ類則包含D型和M型。此結(jié)果說明,在選育總酚和體外抗氧化活性高的魚腥草品種時(shí),可重點(diǎn)在M型且染色體數(shù)目大于80的材料中進(jìn)行篩選。3魚腥草居群間的遺傳多樣性本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),供試的綜合農(nóng)藝性狀好的16份魚腥草材料中總酚(含黃酮)及體外抗氧化活性變異均較大。其中,清除自由基能力最強(qiáng)的為W01-98和W01-94;最低的為W01-86,即峨眉蕺菜。通過聚類分析得到了5種總酚含量高并且具有較強(qiáng)的抗氧化活性的材料,分別為W01-98、W01-100、W01-99、W01-94、W01-52,由于魚腥草為可食用的藥用植物,所以其抗氧化物質(zhì)是天然的、無毒副作用。這5份材料總酚含量均大于10mg/g,高于豆乳(2.51mg/g)和石榴皮(0.245mg/mL)中總酚含量,其中4份材料也高于Shizuo曾報(bào)道的魚腥草總酚含量(11.4±0.2)mg/g,可作為高多酚含量的食物,也可加工成天然抗氧化劑,極具有開發(fā)利用價(jià)值。研究表明,不同來源地魚腥草在形態(tài)、生物產(chǎn)量、化學(xué)成分及抗病性指標(biāo)上存在顯著差異,并且將各地收集來的魚腥草在同樣環(huán)境下栽種,結(jié)果差異仍然存在,造成這種差異的原因推測(cè)主要在于魚腥草的遺傳背景。盡管學(xué)者們對(duì)魚腥草染色體基數(shù)的看法不盡一致,如吳衛(wèi)等推測(cè)魚腥草染色體基數(shù)為9,Oginuma等認(rèn)為n=8,而袁藝等發(fā)現(xiàn)魚腥草染色體基數(shù)n=12或n=11,但這些研究恰好也為魚腥草居群間的遺傳多樣性提供了充分的證據(jù)。ISSR、ITS、RAPD和RFLP等分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)一步地揭示了不同居群魚腥草間遺傳背景的差異性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,供試