不同環(huán)境條件下羊下丘腦中催產(chǎn)素表達(dá)的變化

不同環(huán)境條件下羊下丘腦中催產(chǎn)素表達(dá)的變化

動(dòng)物的成熟與生殖激素密切相關(guān)。一般認(rèn)為在動(dòng)物性成熟前,下丘腦-垂體-性腺軸的功能被較低濃度的性激素所抑制,因?yàn)榇藭r(shí)下丘腦-垂體對(duì)性腺激素的敏感性較高;而動(dòng)物性成熟時(shí),下丘腦-垂體對(duì)性腺激素的敏感性較低,從而下丘腦-垂體-性腺軸的功能被激活,下丘腦內(nèi)促性腺激素釋放激素(gonadatropinreleasinghormone,GnRH)的分泌增多,垂體內(nèi)促卵泡素(folliclestimulatinghormone,FSH)和促黃體素(luteinizinghormone,LH)分泌也隨之增多,從而促進(jìn)性腺的發(fā)育和性激素的分泌;同時(shí),血漿中雌二醇(estradiol,E2)和睪酮(testosterone,P4)的濃度升高,并刺激各靶器官的發(fā)育。研究表明,下丘腦內(nèi)催產(chǎn)素的分泌增加,也可以提高垂體內(nèi)LH和FSH的峰值,并且催產(chǎn)素增加垂體內(nèi)LH的分泌,LH和FSH的分泌增加,使性腺激素的分泌增加。研究表明,羔羊期、青年期、妊娠中期奶山羊下丘腦中催產(chǎn)素表達(dá)分布廣泛,但性成熟期下丘腦內(nèi)催產(chǎn)素(oxytocin,OT)的分泌比羔羊期是否增加尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)用免疫組化鏈霉素抗生物蛋白-過氧化物酶(streptavidin-peroxidase,SP)法,對(duì)羔羊期和性成熟期的奶山羊下丘腦中OT神經(jīng)元的變化規(guī)律進(jìn)行研究,旨在為進(jìn)一步研究動(dòng)物性成熟期下丘腦內(nèi)OT對(duì)FSH、LH等激素的調(diào)控機(jī)理提供形態(tài)學(xué)資料。1材料和方法1.1sp法檢測(cè)腦電sp法羔羊期(2月齡到3月齡)和性成熟期(6月齡到8月齡,未孕)的健康雌性奶山羊各8只,臨床健康,體重25kg～35kg。山羊頸動(dòng)脈放血致死,向兩側(cè)頸總動(dòng)脈同時(shí)注入37℃生理鹽水800mL沖去殘血。隨后灌注4℃含40mL/L多聚甲醛的0.1mol/L磷酸緩沖液(PB,pH7.4)1000mL。開顱取下丘腦后,浸入上述固定液中后固定12h。而后浸入4℃的200g/L蔗糖PB液,組織塊沉底后即可切片。用冰凍切片機(jī)對(duì)下丘腦做連續(xù)切片,厚度35μm。每只羊下丘腦制得三套切片,一套做Nissl染色進(jìn)行下丘腦核團(tuán)定位,一套作陰性對(duì)照,一套進(jìn)行免疫組化SP法染色?？故骃P超敏試劑盒,福州邁新公司進(jìn)口分裝;鼠抗OT抗體,第四軍醫(yī)大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所提供;葡萄糖氧化酶,美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)。1.2方法1.2.1小鼠抗ot的制備將切片經(jīng)0.01mol/L的PBS緩沖液沖洗3次,每次10min,然后按以下步驟進(jìn)行反應(yīng),各步驟間均用0.01mol/L的PBS緩沖液充分漂洗3次,每次10min。①切片入A液(過氧化物酶阻斷劑),室溫下孵育1h。②入B液(非免疫血清),室溫下孵育40min。③入鼠抗OT抗體(稀釋倍數(shù)為1∶10000),4℃下孵育48h～72h。④入C液(生物素標(biāo)記的二抗),37℃下孵育1.5h。⑤入D液(鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶),37℃下孵育1.5h。⑥經(jīng)葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸鎳胺方法呈色,室溫下呈色15min～20min。然后按常規(guī)脫水、透明、封片。1.2.2比較性染色用0.01mol/L的PBS緩沖液代替鼠抗OT抗體孵育切片,其余步驟同1.2.1,進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn),確定該方法的特異性。1.3陽(yáng)性細(xì)胞的測(cè)定免疫組化染色結(jié)果每組切片中隨機(jī)選取5個(gè)不同部位,Motic數(shù)碼顯微鏡拍照,用江蘇捷達(dá)801形態(tài)分析軟件對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行分析,測(cè)量陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目和灰度值,用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Xˉˉˉ±SD(Xˉ±SD)表示。所有數(shù)據(jù)輸入SPSS軟件進(jìn)行羔羊期和性成熟期的t檢驗(yàn),并取P<0.05為差異顯著。2結(jié)果2.1羊期和期期陽(yáng)性神經(jīng)元/組織型免疫組化SP法結(jié)合硫酸鎳胺加強(qiáng)的藍(lán)色反應(yīng),在光鏡下OT免疫陽(yáng)性產(chǎn)物呈深藍(lán)色,主要呈顆粒狀、均質(zhì)狀分布于細(xì)胞質(zhì)中;在細(xì)胞外則呈顆粒狀和小點(diǎn)狀。陽(yáng)性細(xì)胞的形態(tài)有圓形、卵圓形、多角形;有的陽(yáng)性細(xì)胞突起明顯。羔羊期和性成熟期催產(chǎn)素免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元共同分布于室旁核、視上核、腹外側(cè)核、乳頭體后核和乳頭體內(nèi)側(cè)核等(圖1,表1)。另外,室周核、前聯(lián)合核、視前內(nèi)側(cè)核、視前外側(cè)核、下丘腦前區(qū)、下丘腦背區(qū)、下丘腦小細(xì)胞核、背內(nèi)側(cè)核在羔羊期可見催產(chǎn)素免疫陽(yáng)性神經(jīng)元分布,但在性成熟期未見分布。2.2評(píng)估小鼠腦周核及細(xì)胞計(jì)數(shù)羔羊期催產(chǎn)素免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元主要分布在室旁核、視上核,而性成熟期催產(chǎn)素免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元?jiǎng)t主要分布在室旁核、視上核、下丘腦外側(cè)區(qū)、腹外側(cè)核、乳頭體后核和乳頭體內(nèi)側(cè)核。除了室周核、視前交叉上核、交叉上核和前聯(lián)合核等核團(tuán),性成熟期時(shí)下丘腦的其他核團(tuán)中催產(chǎn)素免疫陽(yáng)性神經(jīng)元都顯著高于羔羊期(表1)。羔羊期催產(chǎn)素平均灰度值在視上核、室旁核、下丘腦外側(cè)區(qū)等核團(tuán)低于性成熟期(P<0.01),而在視前交叉上核、后穹窿周核等核團(tuán)高于性成熟期,且大部分都差異顯著(P<0.01)。羔羊期下丘腦細(xì)胞總平均數(shù)為891.5,性成熟期為2042,顯著高于羔羊期的平均細(xì)胞數(shù)目。在奶山羊羔羊期室周核、前聯(lián)合核、視前內(nèi)側(cè)核、視前外側(cè)核、下丘腦前區(qū)、下丘腦背區(qū)、下丘腦小細(xì)胞核、背內(nèi)側(cè)核有OT陽(yáng)性表達(dá),在性成熟期無(wú)表達(dá)。3不同生理期ot神經(jīng)元的分布對(duì)于動(dòng)物性成熟機(jī)理,一般認(rèn)為性成熟前,性腺發(fā)育不全,下丘腦-垂體-性腺軸處于抑制狀態(tài),到了性成熟期,下丘腦-垂體-性腺軸的功能被激活,GnRH、FSH和LH分泌升高,FSH和LH促進(jìn)了相應(yīng)性激素的分泌和性腺的發(fā)育成熟。催產(chǎn)素是下丘腦-垂體-性腺軸中一個(gè)重要的生殖激素,研究表明,催產(chǎn)素在發(fā)情周期存在波動(dòng),且下丘腦內(nèi)催產(chǎn)素神經(jīng)元數(shù)目也具有波動(dòng)性。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)羔羊期和性成熟期OT免疫陽(yáng)性神經(jīng)元在室旁核、視上核等下丘腦的大部分核團(tuán)均有分布,這與妊娠中期、青年期下丘腦內(nèi)OT免疫陽(yáng)性神經(jīng)元的分布基本上一致。但是羔羊期OT免疫陽(yáng)性神經(jīng)元在室周核、前聯(lián)合核、視前內(nèi)側(cè)核等少數(shù)核團(tuán)見分布,而性成熟期則無(wú)分布。結(jié)果提示,羔羊期和性成熟期OT在下丘腦分布相當(dāng)廣泛,但不同生理期OT神經(jīng)元的分布存在差異。研究發(fā)現(xiàn),動(dòng)物處在不同的生理周期,其細(xì)微結(jié)構(gòu)會(huì)有所變化,主要表現(xiàn)在神經(jīng)元的位置、數(shù)目、大小、樹突分支的情況、陽(yáng)性神經(jīng)纖維的數(shù)目、細(xì)胞膜內(nèi)在成分和突觸數(shù)方面的變化。母豬從出生后到繁殖早期下丘腦內(nèi)OT神經(jīng)元的大小、體積、數(shù)目均持續(xù)增加。本研究發(fā)現(xiàn)從羔羊期到性成熟期奶山羊下丘腦各核團(tuán)內(nèi)OT神經(jīng)元的數(shù)目基本上都在增加。另外,下丘腦各個(gè)核團(tuán)的催產(chǎn)素的平均灰度值的結(jié)果比較表明,各個(gè)核團(tuán)催產(chǎn)素的分泌在室旁核、視上核等部分核團(tuán)在羔羊期似乎比性成熟期多,但是如果考慮到各個(gè)核團(tuán)的OT神經(jīng)元在性成熟期比羔羊期多1.4倍～8.4倍,就可以認(rèn)為這些核團(tuán)催產(chǎn)素的合成和分泌其實(shí)是性成熟期比羔羊期多,這可能與羔羊期性腺剛發(fā)育有關(guān)。研究報(bào)道催產(chǎn)素可以增加LH和FSH的峰值,并且催產(chǎn)素增加垂體內(nèi)LH的分泌,LH和FSH的分泌增加便促進(jìn)性腺激素的分泌和性腺的發(fā)育。性成熟期下丘腦內(nèi)OT是否也直接促進(jìn)GnRH