纖維蛋白原基因鏈啟動子區(qū)域-45ga與胃癌發(fā)生的相關性研究

纖維蛋白原基因鏈啟動子區(qū)域-45ga與胃癌發(fā)生的相關性研究

癌癥是人類健康中的主要疾病之一。每年有約40萬新患者死亡。研究發(fā)現(xiàn)胃癌是一種基因病,其發(fā)生發(fā)展是一個多因素與多階段的過程,亦是多種基因改變逐漸累積的結果,不同的基因可能在胃癌不同的階段發(fā)揮作用。纖維蛋白原(fibrinogen,Fg)是參與凝血的主要成分之一,研究發(fā)現(xiàn)Fg含量不僅與凝血功能密切相關,而且參與惡性腫瘤形成和轉移的生物學過程,Fg升高,腫瘤患者體內血液呈高凝狀態(tài),促進腫瘤浸潤、轉移和復發(fā)。Fg水平受遺傳、肥胖、妊娠、絕經、組織損傷、炎癥和感染等因素影響,1987年Humphries首次報道Fg基因多態(tài)性與血漿Fg水平存在相關性,自此,腫瘤遺傳因素越來越受關注,而Fgβ鏈位點的基因多態(tài)性特征是決定Fg合成的主要限速因素,因此編碼鏈的編碼被認為是影響血漿Fg水平的主要基因。目前已經發(fā)現(xiàn)的Fg基因多態(tài)性達10余種,其中Fgβ-455位點基因多態(tài)性是研究最多的位點,為此,本研究采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法對Fg-455位點基因型研究,探討其基因多態(tài)性與胃癌的相關性。1對象和方法1.1病例選擇及一般資料2012年-2013年胃癌患者100例為觀察組,所有病例均經臨床資料和組織病理學檢查確診,男56例、女44例,28~80歲,平均62歲;所有患者采血時均未行放療和化療,診斷和分期標準參照1986年全國胃癌病理研究協(xié)作組制定的標準。對照組100例為正常體檢者,男58例,女42例,30~82歲,平均59歲。1.2引物合成和藥物TaqDNA聚合酶、dNTP、10×緩沖液購自上海Sangon生物工程公司,瓊脂糖、重蒸酚、氯仿、異戊醇購自北京鼎國生物技術發(fā)展中心,EB、加樣緩沖液、EDTA、三烴甲基氨基甲烷(TRIS)和十二烷基硫酸鈉(SDS)購自美國Sigma公司。上、下游引物序列由上海捷瑞試劑公司合成,限制性內切酶HaeⅢ由MBIFermentas公司生產,2×HotstartTaqPCRMasterMix購自北京天根生化科技有限公司。加樣器(中國Gilson公司)、紫外分光光度計(中國Beckman公司)2400型PCR儀(中國PE公司)、3000xi型電泳儀(中國Bio-RAD公司)、DYY-Ⅲ型電泳儀、水平式電泳槽(北京六一儀器廠)、圖像分析系統(tǒng)(美國Kodak公司)及低溫高速離心機(中國Heaerus公司)。1.3方法1.3.1提取的dna取外周靜脈血2mL,分離白細胞層采用酚-氯仿法提取基因組DNA,-20℃保存?zhèn)溆谩?.3.2aa型ga型應用PCR-RFLP技術對Fgβ-455位點進行基因分型,Fgβ-455基因多態(tài)性呈G-A兩態(tài),G等位基因含HaeⅢ酶切位點,當G突變?yōu)锳時,A等位基因缺乏HaeⅢ酶切位點,Fgβ-455位點GG型表現(xiàn)為488bp和181bp兩個片段,GA型表現(xiàn)為669bp、488bp和181bp三個片段AA型,表現(xiàn)為一個669bp片段。Fgβ-455的上、下游引物序列由上海捷瑞試劑公司合成。50μLPCR反應體系:DNA模板2μL,上游引物2μL,下游引物2μL,2×HotstartTaqPCRMasterMix30μL,補14μLddH2O至50μL。PCR反應條件:95℃預變性5min,95℃50s,57℃60s,72℃70s,擴增35個循環(huán),最后72℃再延伸5min。PCR產物10μL,Buffer緩沖液2μL,HindⅢ2μL,補ddH2O16μL至20μL,混勻,瞬時離心,置37℃恒溫水浴箱水浴16h,酶切產物10μL進行2%瓊脂糖凝膠電泳.EB染色,在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并記錄實驗結果。1.4觀察指標計算胃癌組與對照組受檢者基因型及等位基因頻率,分析不同基因型與胃癌的相關性。1.5不同分布的研究人群,h-w分布應用Hardy-Weinberg(H-W)平衡軟件計算胃癌患者基因型的分布,P>0.05,表明研究人群符合H-W平衡;采用χ2檢驗分析胃癌患者基因型和等位基因頻率的分布,采用非條件logistic回歸法計算表示相對危險度的比值比(OddsRatio,OR)及95%CI。2結果2.1ga型和aa型Fgβ-455位點GG型表現(xiàn)為488bp和181bp兩個片段,GA型表現(xiàn)為669bp、488bp和181bp三個片段,AA型表現(xiàn)為一個669bp片段見圖1。2.2dy-期平衡胃癌組及對照組人群基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡,胃癌組χ2=0.621,P=0.733;對照組χ2=0.275,P=0.560。見表1。2.3基因頻率與統(tǒng)計學相比較胃癌組和對照組兩組Fgβ-455三種基因型比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=5.31;P>0.05),基因頻率相比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.88;P<0.05)。見表2。2.4g/a基因多態(tài)性與肺癌的關系進行單變量logistic回歸分析,探討Fgβ-455G/A基因多態(tài)性與胃癌的關系,結果顯示,突變純合子AA型與胃癌的發(fā)病有關聯(lián)(OR為0.842,95%CI為0.362~9.323,P=0.034)。見表3。3基因多態(tài)性與肺癌的關系研究顯示,惡性腫瘤患者Fg水平均有不同程度的增高,而Fg的基因多態(tài)性是造成其水平差異的重要因素之一。Fg是由兩個相同的、含有Aα、Bβ、γ三條多肽鏈的亞單位組成的六聚體,3條多肽鏈分別由FGA、FGB、FGG基因編碼,這3條多肽鏈中任何一個基因缺陷均可導致Fg的含量或(和)功能異常。目前對人Fgβ-455位點基因多態(tài)性與HIE、高血壓和冠心病、狼瘡性腎炎、肺栓塞和深靜脈血栓、反復呼吸道感染、大腸癌等諸多疾病的相關性已有報道,與腫瘤的相關性研究較少。為此,本研究采用PCR-RFLP的方法研究Fg基因多態(tài)性與胃癌的關系,為揭示胃癌的發(fā)病機制提供理論依據(jù)。Fgβ-455G/A是Fg的B基因多態(tài)性中發(fā)現(xiàn)最早、研究最多的位點,DeMast等發(fā)現(xiàn)AA基因型患者冠狀動脈粥樣硬化的進展很快,證實A基因與其疾病的發(fā)生發(fā)展相關;Cook等檢測居住于倫敦的白種人、黑種人及印度人的基因多態(tài)性,發(fā)現(xiàn)有不同種族的人群在等位基因頻率和連鎖不平衡上存在差異,并由此引起血漿Fg水平的變化,提示基因多態(tài)性和疾病易感性因人種不同而存在差異;Liu等和Li等的研究結果表明,Fb-455G/A基因多態(tài)性與中國人缺血性腦卒中相關聯(lián);Zhai等的研究顯示肺動脈栓塞癥(pulmonarythromboembolism,PET)患者Figβ-455位點A基因的頻率高于對照組,提示A等位基因可能是PTE發(fā)病的遺傳危險因素。王振華等研究顯示血漿Fgβ-455位點的A基因與小兒川畸病發(fā)病有關,崔國方等研究顯示Fgβ-455位點G基因型突變?yōu)锳基因降低了過敏性紫癜的發(fā)病風險;汪麗等研究顯示Fgβ-455位點的A與是子癇前期及子癇患者發(fā)病的高危基因,楊芳等研究顯示Fgβ-45位點G/A基因多態(tài)性與大腸癌的發(fā)病有一定的相關性。這些結果提示,基因多態(tài)性存在地區(qū)及種族的差異,所以研究結果不一致。本研究結果顯示,Fgβ-455位點GG純合子在胃癌中的發(fā)生頻率為69%,高于正常對照人群57%,Fgβ-455位點AA純合子在胃癌中的發(fā)生頻率(2%)低于正常對照人群(8%);而Fgβ-455位點GA雜合子在胃癌中的發(fā)生頻率29%,顯著低于正常對照人群的35%;胃癌組Fg中Fgβ-455位點基因型GG、GA、AA比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=5.31;P>0.05),但基因頻率相比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.88;P<0.05)。由此推測,Fg中Fgβ-455位點單個堿基的突變可能與胃癌的發(fā)生有關。進行單變量logistic