鵝低溫?fù)p傷內(nèi)嗅覺皮質(zhì)對應(yīng)激大鼠下丘腦室旁核c-fos表達(dá)的影響

鵝低溫?fù)p傷內(nèi)嗅覺皮質(zhì)對應(yīng)激大鼠下丘腦室旁核c-fos表達(dá)的影響

1應(yīng)激與快反應(yīng)基因“激勵主義”一詞由h.seile（1907.1982）提出。它指的是當(dāng)身體受到各種外部環(huán)境因素的刺激時，身體另一種非特異性全身反應(yīng)。在末梢主要表現(xiàn)為血中促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotrophichormone,ACTH)、兒茶酚胺等的升高。個體的應(yīng)激反應(yīng)主要是通過下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸而起作用,腦主要通過神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)參與對應(yīng)激的調(diào)節(jié)。在應(yīng)激的腦調(diào)節(jié)研究領(lǐng)域中,近年來,快反應(yīng)基因(immediateearlygene,IEG)中的c-Fos,由于其在腦內(nèi)的基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)量很少,但在各種應(yīng)激狀態(tài)時能被快速而且一過性地誘導(dǎo),所以作為神經(jīng)元的活動和示蹤標(biāo)志,在腦內(nèi)信號傳導(dǎo),神經(jīng)核的定位研究中被廣泛應(yīng)用。研究證明位于下丘腦的室旁核(hypothalamicparaventricularnucleus,PVN)由于是ACTH釋放因子的主要分泌部位,所以在應(yīng)激狀態(tài)的腦內(nèi)信號傳遞中起著重要的作用。下丘腦PVN的c-Fos誘導(dǎo)和末梢血中ACTH濃度的升高作為急性應(yīng)激時的兩大特征性指標(biāo)在應(yīng)激研究中常被應(yīng)用。在下丘腦以上高位中樞中,已明確邊緣系統(tǒng)與應(yīng)激有關(guān)。我們曾經(jīng)報道過海馬在應(yīng)激中的作用,刺激海馬的膽堿能神經(jīng)能引起類似于急性應(yīng)激的反應(yīng),表現(xiàn)為外周血ACTH濃度的升高和下丘腦PVNc-Fos表達(dá)的增強(qiáng)。我們以往的研究發(fā)現(xiàn),損毀大鼠雙側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì),能抑制由束縛應(yīng)激誘導(dǎo)的血漿ACTH含量的上升。但損毀大鼠雙側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)對由束縛應(yīng)激誘導(dǎo)的下丘腦PVNc-Fos表達(dá)的影響并不明確。本研究利用已建立的大鼠急性束縛應(yīng)激動物模型,用鵝羔氨酸損毀大鼠雙側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)來建立內(nèi)嗅皮質(zhì)損傷模型,觀察束縛應(yīng)激1小時后下丘腦PVNc-Fos表達(dá)情況以及應(yīng)激后血漿ACTH含量的動態(tài)變化,并與對照組相比較,旨在結(jié)合中樞和末梢兩方面的觀察指標(biāo),探討內(nèi)嗅皮質(zhì)在束縛應(yīng)激反應(yīng)中的作用。2材料和方法2.1大鼠照明系統(tǒng)28只雄性Wistar大鼠,清潔級,鼠齡3個月左右,體重280±20g,購于日本SLC公司(JapanSLC,Inc)。每只大鼠單籠喂養(yǎng),控制室溫(25℃±2℃)和光暗周期(12小時照明/12小時黑暗,每天早上7時開始照明)。適應(yīng)期間所有動物自由飲食和水。2.2抗鼠多克隆抗體au鵝羔氨酸(ibotenicacid)和臺盼藍(lán)(trypanblau):美國Sigma公司。兔抗鼠多克隆c-Fos抗體:美國SantaCruzBiochenology公司。ABC試劑盒和DAB底物試劑盒:美國VECTOR公司。其余化學(xué)試劑:日本関東化學(xué)公司。2.3實驗程序2.3.1雙側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)和雙側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)+束縛應(yīng)激組es所有動物在飼養(yǎng)7天后隨機(jī)分為4組:正常對照組(C)、束縛應(yīng)激組(I)、生理鹽水注射雙側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)+束縛應(yīng)激組(EC)和鵝羔氨酸損毀雙側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)+束縛應(yīng)激組(ES)。每組8只。2.3.2不銹鋼注射針注射對EC、ES組大鼠,用戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉后,將其固定在鼠腦立體定位儀(Narishige,日本)上,充分暴露顱骨后,參照大鼠腦圖譜,分別在雙側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)處(以前鹵為零點,AP=-6.04mm,ML=±6.50mm,DV=-7.00mm)注射0.2%臺盼藍(lán)生理鹽水(EC)或鵝羔氨酸(15μg/μl0.2%臺盼藍(lán)生理鹽水,ES)。不銹鋼注射針被固定在立體定位儀上,其外口直徑為28μm,一端對向注射部位,另一端通過一根長為30cm的硅橡膠管連接著一個1.0μl的注射器。針、導(dǎo)管和注射器內(nèi)充滿著注射液,在確定注射通暢后調(diào)節(jié)立體定位儀讓注射針進(jìn)入腦組織。注射量為0.1μl,速度為0.1μl·min-1,注射完畢后留針5min。手術(shù)后的大鼠回原籠恢復(fù)14天后進(jìn)行束縛應(yīng)激造模。2.3.3頸靜脈右心房插管對各組大鼠于應(yīng)激造模前一天進(jìn)行頸靜脈插管。在乙醚麻醉下暴露右側(cè)頸靜脈,留置經(jīng)頸靜脈右心房插管。硅橡膠插管內(nèi)充滿肝素生理鹽水(10U/ml),進(jìn)入靜脈內(nèi)2.5cm,以保證其一端進(jìn)入右心房,另一端打結(jié)封閉后固定于頭頸背部。插管后的大鼠放回原籠照常喂養(yǎng)。2.3.4大鼠激素的提取在實驗的當(dāng)天上午8時,把所有大鼠隨其原籠搬到實驗室。對I、EC、ES組大鼠,采用繩子捆綁大鼠四肢,使其俯臥固定在木板上,應(yīng)激1小時后松綁放回原籠。為縮小生理周期對激素分泌的影響,全部實驗都控制在10∶00~13∶00之內(nèi)完成。對C組大鼠只是把大鼠搬到實驗室里放置,不使其遭受應(yīng)激,也不讓其看到其它大鼠遭應(yīng)激的場面。2.3.5血漿acth濃度檢測于實驗開始1小時前檢查靜脈插管是否通暢。在實驗前即刻、開始后15min、30min、60min、90min和120min時分別從靜脈插管中采取血樣1ml,放入EDTA抗凝試管,以3000rpm轉(zhuǎn)速離心20min。取上清血漿凍冷藏于-20℃冰箱,后用放射免疫方法測定血漿ACTH濃度。在采血1ml后即刻,回注入1ml肝素生理鹽水,以避免其循環(huán)血容量的減少。2.3.6多聚甲醛腦塊的制備對各組大鼠在末次採血后用戊巴比妥鈉深麻醉,經(jīng)左心室-升主動脈快速灌注37℃生理鹽水150ml,接著用4℃固定液(4%多聚甲醛,0.1MPBS配制,PH7.4)200~250ml灌流,持續(xù)30min以上。剝離鼠腦,修塊,用相同的固定液后固定24小時以上后放入30%蔗糖溶液(0.1MPBS配制),4℃保存。經(jīng)脫水后的腦塊,用干冰快速冷凍后放入-80℃低溫冰箱保存。染色前使用冰凍切片機(jī)連續(xù)冠狀切片,片厚40μm,片距120μm(隔三取一),收集于0.01MPBS中。2.3.7免疫組化染色切片分為2組,分別進(jìn)行常規(guī)的Nissl染色和c-Fos的免疫組織化學(xué)染色。Nissl染色用于確認(rèn)內(nèi)嗅皮質(zhì)神經(jīng)核團(tuán)損毀的正確性和有效性,剔除損毀不成功例。c-Fos的免疫組化染色采用自由漂浮法,具體步驟:0.3%雙氧水/甲醇孵育30min,以除去內(nèi)源性過氧化物酶;0.3%Triton-X-100/PBS孵育20min;一抗(兔多克隆c-Fos抗體,用PBS/4%正常山羊血清1∶1000稀釋),4℃孵育24h;二抗(生物素化的羊抗兔IgG,用PBS1∶100稀釋),室溫孵育1h;ABC復(fù)合物(用PBS1∶100稀釋),室溫孵育1h;DAB顯色5~10min;各步驟間均用PBS(0.01MPH7.4)液漂洗3次,每次5min。脫水、透明、中性樹膠封固。PBS代替一抗作陰性對照。2.3.8fos陽性細(xì)胞數(shù)測定c-Fos染色陽性為細(xì)胞核著棕黃色。顯微鏡下在下丘腦室旁核區(qū)域選取視野,計算每100μm2組織內(nèi)的Fos陽性細(xì)胞數(shù)。每張切片測3個視野范圍(10×10倍),每只大鼠測3張切片,陽性顆粒數(shù)/切片/視野的平均值作為該大鼠的數(shù)值。2.3.9正交試驗結(jié)果每組數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(M±SD)表示。每組n=4~6只大鼠。對ACTH實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行正交多項式比較,按重復(fù)測量單因素方差分析(One-wayANOVA),post-hoc測試采用Fisher’sPLSD處理。c-Fos實驗數(shù)據(jù)實行非參數(shù)檢驗的Kruskal-WallisH檢驗。以p<0.05為判斷差異顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。3結(jié)果3.1內(nèi)嗅皮質(zhì)內(nèi)嗅皮質(zhì)中神經(jīng)元的變化與用生理鹽水注射雙側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)相比,使用鵝羔氨酸損毀雙側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)后大鼠內(nèi)嗅皮質(zhì)處神經(jīng)元數(shù)量明顯減少,并伴有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的明顯增加。詳見圖1。3.2應(yīng)激大鼠雙側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)超氧化應(yīng)激試驗es與用生理鹽水注射后應(yīng)激組(EC)相比,使用鵝羔氨酸損毀大鼠雙側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)后應(yīng)激組(ES)在遭受束縛應(yīng)激1小時后下丘腦PVN的c-Fos表達(dá)明顯減少(p<0.01),而與正常對照組之間無明顯差異。詳見圖2、表1。3.3質(zhì)后應(yīng)激組與正常組血漿acth濃度動態(tài)變化情況比較束縛應(yīng)激組(I)和生理鹽水注射雙側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)后應(yīng)激組(EC)在遭受束縛應(yīng)激后數(shù)分鐘內(nèi)即出現(xiàn)血漿ACTH濃度的上升,并一直持續(xù),到解除束縛1小時后還不能恢復(fù)到應(yīng)激前水平;與此相比,使用鵝羔氨酸損毀雙側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)后應(yīng)激組(ES)在遭受束縛應(yīng)激后血漿ACTH濃度的動態(tài)變化過程明顯受到抑制,與正常對照組(C)相比無顯著差異性。詳見圖3。重復(fù)測量單因素方差分析(One-wayANOVA)表明四組間比較具有顯著性差異(p<0.01),Fisher’sPLSDpost-hoc測試顯示正常對照組(C)和束縛應(yīng)激組(I)、生理鹽水注射雙側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)后束縛應(yīng)激組(EC)和鵝羔氨酸損毀雙側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)后束縛應(yīng)激組(ES)差別具有非常顯著性意義(p<0.01),而正常對照組(C)和鵝羔氨酸損毀雙側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)后束縛應(yīng)激組(ES)、束縛應(yīng)激組(I)和生理鹽水注射雙側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)后束縛應(yīng)激組(EC)的差別無顯著性意義(p>0.05)。4內(nèi)嗅皮質(zhì)參與應(yīng)激應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)內(nèi)嗅皮質(zhì)位于人腦的腹內(nèi)側(cè),相當(dāng)于Brodmann第28區(qū)。其頭端始于顳極后,頭端內(nèi)側(cè)與杏仁核相鄰,尾端結(jié)束于外側(cè)膝狀體頭端平面,內(nèi)側(cè)緊連海馬的前下托、旁下托,外側(cè)以側(cè)副溝為界與嗅旁皮質(zhì)相接。由于內(nèi)嗅皮質(zhì)和海馬之間存在著豐富的雙相性神經(jīng)纖維投射,因此,內(nèi)嗅皮質(zhì)被認(rèn)為是海馬和大腦新皮質(zhì)聯(lián)系的“橋梁”部位。已有研究證明內(nèi)嗅皮質(zhì)和海馬共同參與記憶的形成過程,臨床研究也提示內(nèi)嗅皮質(zhì)和情感性疾病及老年性癡呆有關(guān)。已有很多研究報道海馬參與應(yīng)激時HPA軸功能的調(diào)節(jié),但有關(guān)內(nèi)嗅皮質(zhì)在應(yīng)激反應(yīng)中的作用相對研究較少。Sunanda等研究發(fā)現(xiàn),損毀雙側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)可以抑制由慢性束縛應(yīng)激引起的海馬神經(jīng)元損傷,Uehara等報道損毀雙側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì)可以改變杏仁核內(nèi)由足底電擊或心理應(yīng)激引起的多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的分泌。這說明內(nèi)嗅皮質(zhì)參與應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)。研究證明,當(dāng)個體處于應(yīng)激狀態(tài)時,位于下丘腦的PVN便合成和釋放多種多肽激素如促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)和加壓素,CRH促進(jìn)垂體前葉分泌ACTH,ACTH使腎上腺皮質(zhì)合成、分泌糖皮質(zhì)激素增加,從而有利于機(jī)體進(jìn)行應(yīng)激反應(yīng),以保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡。由此可見,應(yīng)激時下丘腦PVN的激活是末梢血中ACTH濃度變化的前提條件。在預(yù)實驗中我們發(fā)現(xiàn),與未遭應(yīng)激的對照組相比,束縛應(yīng)激1小時后,下丘腦PVNc-Fos的表達(dá)明顯增高,同時,外周血中ACTH濃度也出現(xiàn)了動態(tài)的變化,這與其它此方面的研究報道一致,說明急性應(yīng)激造模是成功的(數(shù)據(jù)省略)。在此基礎(chǔ)上,用化學(xué)的方法損毀雙側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì),與用生理鹽水“損毀”的對照組相比,損毀內(nèi)嗅皮質(zhì)后再遭束縛應(yīng)激者,下丘腦PVNc-Fos的表達(dá)和外周血中ACTH的升高均出了明顯的抑制(圖2,3所示)。由此可見損毀內(nèi)嗅皮質(zhì)的大鼠,對束縛應(yīng)激的敏感性降低,說明內(nèi)嗅皮質(zhì)功能和急性應(yīng)激時下