激光掃描共聚焦顯微鏡下對(duì)孤束核表達(dá)fos的兒茶酚胺能神經(jīng)元的觀(guān)察

激光掃描共聚焦顯微鏡下對(duì)孤束核表達(dá)fos的兒茶酚胺能神經(jīng)元的觀(guān)察

獨(dú)裁核（nts）是心臟感覺(jué)的初級(jí)引入，包括各種神經(jīng)活性物質(zhì)。在NTS的中尾段分布有大量?jī)翰璺影纺苌窠?jīng)元和終末。大部分胸腹腔臟器的初級(jí)傳入經(jīng)VII、IX和X腦神經(jīng)投射于NTS,向上主要投射至臂旁核(PB)。形態(tài)學(xué)和生理學(xué)都表明,NTS和PB廣泛參與包括傷害性信息的內(nèi)臟感覺(jué)信息的傳遞和處理。c-fos原癌基因是早期基因家族中的一員,當(dāng)細(xì)胞接受刺激后,核內(nèi)的c-fos原癌基因被激活,它的表達(dá)產(chǎn)物FOS在胞漿內(nèi)合成后進(jìn)入胞核調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)其它基因的轉(zhuǎn)錄活性,從而將刺激與遠(yuǎn)期效應(yīng)耦聯(lián)起來(lái)。c-fos表達(dá)方法引入神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域可檢測(cè)受到包括傷害性刺激激活的神經(jīng)中樞內(nèi)多級(jí)神經(jīng)元傳導(dǎo)通路,從而可以將神經(jīng)元的形態(tài)定位與機(jī)能研究結(jié)合起來(lái)。本文應(yīng)用四甲基羅達(dá)明(TMR)逆行追蹤,將福爾馬林溶液給予胃粘膜引起傷害性刺激并結(jié)合FOS及酪氨酸羥化酶(TH)的免疫熒光組織化學(xué)反應(yīng),在激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)下,對(duì)大鼠NTS內(nèi)向PB投射的可能參與內(nèi)臟傷害性信息傳遞的兒茶酚胺能神經(jīng)元進(jìn)行了研究。免疫組化反應(yīng)SD大鼠,雌雄不拘,體重190～250g。戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉后,開(kāi)顱,在立體定位儀上用微量注射器將0.1～0.3μl的10%TMR定向注入右側(cè)臂旁外側(cè)核(LPB),注射時(shí)間為15～20min,注畢留針15min。動(dòng)物于安靜、避強(qiáng)光和適宜溫度(15～18℃)的環(huán)境中喂養(yǎng)6d。12只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為實(shí)驗(yàn)組(n=8)和對(duì)照組(n=4)。實(shí)驗(yàn)組于術(shù)前禁食12h,在乙醚吸入麻醉下,用細(xì)塑料管向胃內(nèi)注入2%甲醛溶液2ml。動(dòng)物于數(shù)十秒內(nèi)清醒,置于與刺激前相同環(huán)境中存活2h后,在戊巴比妥鈉深麻醉下開(kāi)胸,經(jīng)左心室插管,先以100ml的生理鹽水迅速?zèng)_洗血液,然后用500ml含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸緩沖液(PB,pH7.4)灌注固定,持續(xù)30～50min。灌畢立即取腦,置入上述固定液中后固定4～6h,再移入含30%蔗糖的PB中至沉底(4℃)。冰凍連續(xù)冠狀切片,片厚20μm,隔2片取1片,切片分3套收集于0.025mol/LPBS(pH7.4)中。在熒光顯微鏡下選擇注射區(qū)局限于LPB的切片進(jìn)行免疫熒光組織化學(xué)雙重反應(yīng)。第一套切片反應(yīng)步驟如下:(1)入兔IgG抗TH血清(1∶1000,INC)和綿羊IgG抗FOS血清(1∶1000,本教研室李金蓮教授惠贈(zèng))的混合液中室溫孵育18～24h;(2)Cy5標(biāo)記的驢抗兔IgG(1∶200,Chemicon)和DTAF標(biāo)記的驢抗羊IgG(1∶100,Chemicon)的混合液室溫孵育3h。各孵育液均用含0.3%TritonX-100、1%正常驢血清和0.03%NaN3的PBS稀釋。上述各步驟之間,均用PBS洗滌切片3×10min。裱片,干燥,甘油和PBS(1:1)混合液封片。LSCM下觀(guān)察、拍照并粗略計(jì)數(shù)。第2套切片進(jìn)行Nissl染色,以便對(duì)照觀(guān)察和定位免疫熒光組化反應(yīng)和TMR逆標(biāo)細(xì)胞的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)組的第3套切片用PBS替代一抗血清孵育,同上法進(jìn)行FOS免疫組化反應(yīng)。對(duì)照組動(dòng)物又分2組。第一組(n=2)將在術(shù)前環(huán)境內(nèi)喂養(yǎng)的大鼠進(jìn)行FOS免疫組化反應(yīng),以觀(guān)察動(dòng)物在基礎(chǔ)狀態(tài)下c-fos表達(dá)的狀況。第二組(n=2)將置于術(shù)前環(huán)境的大鼠禁食過(guò)夜,吸入乙醚麻醉,清醒狀態(tài)下存活2h后按上述方法操作。用以觀(guān)察對(duì)照麻醉和禁食兩個(gè)因素對(duì)c-fos表達(dá)的影響。細(xì)胞法上表達(dá)風(fēng)險(xiǎn)實(shí)驗(yàn)組大鼠在乙醚麻醉下向胃內(nèi)插管注入少量甲醛很快即清醒,片刻即出現(xiàn)躁動(dòng)不安以及呼吸加快、加深和弓背等行為,持續(xù)約1h。大鼠處死后解剖發(fā)現(xiàn),胃腸道明顯腫脹充血,胃壁粘膜有脫落面和點(diǎn)狀出血,但未見(jiàn)穿孔。TMR注射中心大部分局限于LPB的外外側(cè)、外內(nèi)側(cè)、中央外側(cè)和背外側(cè)亞核。雙側(cè)NTS內(nèi)均見(jiàn)TMR逆標(biāo)神經(jīng)元分布,注射側(cè)多于對(duì)側(cè)。在適當(dāng)波長(zhǎng)的激光束激發(fā)下,在LSCM下可見(jiàn)NTS內(nèi)標(biāo)記Cy5、DTAF和TMR的神經(jīng)元分別發(fā)出藍(lán)、綠和紅色熒光。采集的標(biāo)本在熒屏上可單獨(dú)顯示一種熒光,也可同時(shí)疊加顯示三種熒光。在NTS中尾段的內(nèi)側(cè)、膠質(zhì)、小細(xì)胞亞核和連合亞核等處可見(jiàn)到7種類(lèi)型的陽(yáng)性反應(yīng)神經(jīng)元,即3種單一陽(yáng)性神經(jīng)元TMR、TH、FOS,3種雙重陽(yáng)性神經(jīng)元TMR/FOS、TMR/TH、FOS/TH和TMR/FOS/TH三重陽(yáng)性神經(jīng)元,其中FOS標(biāo)記胞核,TMR和TH標(biāo)記神經(jīng)元的胞漿(Fig.1)。TMR和TH陽(yáng)性神經(jīng)元胞體呈梭形、橢圓形和三角形,胞體直徑約10～30μm,突起較長(zhǎng),多呈水平方向分布。TH樣陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量最多,TMR逆標(biāo)神經(jīng)元次之,FOS陽(yáng)性神經(jīng)元最少。選取3只反應(yīng)良好的材料且大體位于NTS相同平面上的各3張切片進(jìn)行計(jì)數(shù),其結(jié)果為T(mén)MR/TH、FOS/TH雙重陽(yáng)性和TMR/FOS/TH三標(biāo)神經(jīng)元數(shù)量占NTS內(nèi)TH樣陽(yáng)性神經(jīng)元總數(shù)的百分比分別為44.2%(68/154)、26.6%(41/154)和12.3%(19/154)。此外在NTS上述亞核內(nèi)還可見(jiàn)TH樣陽(yáng)性纖維終末分布,部分TH終末與TMR逆標(biāo)神經(jīng)元有接觸現(xiàn)象。由于與TH樣陽(yáng)性神經(jīng)元胞體(如TMR/TH,FOS/TH以及TMR/FOS/TH神經(jīng)元)同為藍(lán)色熒光,其接觸關(guān)系尚難判定。對(duì)照組大鼠的胃腸道無(wú)明顯變化。安靜飼養(yǎng)和乙醚吸入組在NTS內(nèi)可見(jiàn)少量散在的FOS蛋白表達(dá),后者稍多于前者。一抗替代組未見(jiàn)到陽(yáng)性細(xì)胞。nts內(nèi)部分兒茶酚胺能神經(jīng)元對(duì)內(nèi)臟傷害性信息的表達(dá)LSCM具有高分辨率和高敏感性,能夠同時(shí)觀(guān)察到多種熒光標(biāo)記物。這項(xiàng)技術(shù)的成熟為進(jìn)行神經(jīng)元之間的通訊和連接研究提供了方便。但由于熒光標(biāo)記物在強(qiáng)光激發(fā)下容易發(fā)生淬滅現(xiàn)象,較難進(jìn)行精確的細(xì)胞計(jì)數(shù)。本研究在觀(guān)察時(shí)只能快速粗略地對(duì)多種標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),實(shí)際標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量應(yīng)高于計(jì)數(shù)結(jié)果。形態(tài)學(xué)研究已經(jīng)表明,胃腸道的感覺(jué)初級(jí)傳入主要終止于NTS中尾段的內(nèi)側(cè)、背內(nèi)側(cè)、膠質(zhì)亞核和連合亞核等處,向上大部分投射至LPB的外內(nèi)側(cè)、外外側(cè)、中央外側(cè)和背外側(cè)等亞核。本實(shí)驗(yàn)中TMR注射中心大部分局限于LPB上述亞核內(nèi),其逆標(biāo)細(xì)胞分布與上述結(jié)果大體一致。NTS和PB都參與包括傷害性的內(nèi)臟感覺(jué)信息的傳遞和處理。在給予胃腸道傷害性刺激后,NTS和PB的上述亞核都被誘導(dǎo)而發(fā)生大量FOS的表達(dá)。結(jié)合熒光免疫組化方法,在本實(shí)驗(yàn)中也觀(guān)察到約26.6%的TH樣陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)FOS蛋白,其中約12.3%表達(dá)FOS的TH樣陽(yáng)性神經(jīng)元投射至PB。有研究結(jié)果證明,NTS內(nèi)表達(dá)FOS的部分兒茶酚胺能神經(jīng)元投射至中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)腹外側(cè)區(qū),其中約31.4%的兒茶酚胺能神經(jīng)元呈FOS陽(yáng)性,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其大體一致。以上結(jié)果說(shuō)明NTS內(nèi)部分兒茶酚胺能神經(jīng)元參與內(nèi)臟傷害性信息的傳遞。5-HT能纖維和終末和迷走神經(jīng)初級(jí)傳入纖維終末在NTS內(nèi)與向PB