pcr-sscp檢測結(jié)核分支桿菌耐藥基因的臨床應用

pcr-sscp檢測結(jié)核分支桿菌耐藥基因的臨床應用

近年來，抗癲癇藥物（ih）和李福平（racema）的發(fā)病率顯著增加，影響了抗癲癇藥物（mdr-t）的化療效果，給控制淋巴結(jié)帶來了困難。而傳統(tǒng)的結(jié)核分支桿菌培養(yǎng)藥敏不僅耗時長,在藥物敏感性測定方面也存在一些問題,因此從結(jié)核分支桿菌耐藥分子機制入手,了解其耐藥情況,對指導治療有重要的意義。本文通過Bactec-960儀快速培養(yǎng)增菌,聚合酶鏈反應—單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-SSCP)檢測結(jié)核分支桿菌臨床分離株的rPOB、katG和rPSL耐藥基因,聯(lián)合藥敏試驗初步分析了臨床應用情況,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。1菌株鑒定和藥敏試驗1·1病人及標本來源114例病人均為結(jié)核科住院病人,其中男性79人,平均年齡(45.05±16.18)歲。女性35人。平均年齡(43.38±19.43)歲。病程1.5個月~26年,平均1.2年。均為繼發(fā)性肺結(jié)核,其中輕度36例,中度46例,重度32例。均為痰涂片抗酸染色陽性,初治肺結(jié)核病人33例(入院前均未使用抗結(jié)核藥物),復治肺結(jié)核病人81例,其中70例治療不規(guī)范(化療方案不合理,療程不夠,不規(guī)律用藥,單藥調(diào)整等)。全部病人清晨留痰,經(jīng)Bactec-960增菌培養(yǎng)和7H9培養(yǎng)基培養(yǎng),并按結(jié)核病診斷細菌學檢驗規(guī)程進行菌種鑒定和不同梯度的藥敏試驗。INH高濃度10mg/L,低濃度1mg/L;RFP高濃度250mg/L,低濃度25mg/L;SM高濃度100mg/L,100ng/L;EB高濃度50mg/L;低濃度5mg/L;K高濃度6mg/L,低濃度0.6mg/L;PZA高濃度50mg/L,低濃度5mg/L;O(氧氟沙星)2mg/L;PAS6mg/L。左旋氧氟沙星高濃度5mg/L,低濃度0.5mg/L,聯(lián)合藥敏濃度HR(H1mg/L+R50mg/L);HRS(H1mg/L+R50mg/L+S10mg/L);HRE(H1mg/L+R50mg/L+E5mg/L)。1·2試劑結(jié)核桿菌rPOB.katG,rPSL基因檢測試劑盒由本院結(jié)核病研究室分子生物學實驗室提供。7H9培養(yǎng)基由美國DB公司提供。藥敏試劑本室自配。1·3方法1·3·1痰標本經(jīng)前處理后,經(jīng)Bactec-960儀培養(yǎng)3~7d,部分培養(yǎng)菌做藥敏梯度試驗,部分培養(yǎng)菌提取DNA。1·3·2DNA制備:采用本院結(jié)核病研究室自制的試劑盒提取DNA,置-20℃保存?zhèn)溆谩?·3·3PCR擴增:按試劑盒說明書進行操作,擴增結(jié)核分支桿菌耐RFP基因rPOB產(chǎn)生307bp片段,擴增結(jié)核分支桿菌耐INH基因katG產(chǎn)生245bp片段,擴增結(jié)核分支桿菌耐SM基因rPSL產(chǎn)生267bp片段。耐藥基因完全缺失,PCR擴增為陰性。1·3·4SSCP分析:將引物擴增陽性的基因產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳,溴化乙錠染色后照相觀察結(jié)果。1·3·5結(jié)果判定:根據(jù)凝膠上顯現(xiàn)的不同帶型,通過與野生型RFP、INH和SM標準株DNA擴增產(chǎn)物對照,即可確定突變基因型。2復治肺結(jié)核病人符合耐藥情況分析2·1初治和復治肺結(jié)核病人結(jié)核分支桿菌耐藥情況比較見表1。初治肺結(jié)核病人結(jié)核分支桿菌對藥物耐藥頻率自高往低排列是RFP(5/11),INH(5/11),SM(4/11),PZA(4/11),EB(3/11),K(2/11),O(1/11),PAS(1/11)和左旋氧氟沙星(1/11)。其中RFP(高耐1例,低耐4例),INH(低耐5例),SM(高耐1例,低耐3例),PZA(低耐3例),EB(高耐1例,低耐2例),K(低耐2例),左旋氧氟沙星1例為低耐。復治肺結(jié)核病人結(jié)核分支桿菌對藥物耐藥頻率自高往低排列是:INH(65/81),RFP(63/81),EB(57/81),SM(55/81),K(44/81),PZA(43/81),PAS(36/81),O(17/81)和左旋氧氟沙星(16/81)。其中INH(高耐45例,低耐20例),RFP(高耐52例,低耐11例),EB(高耐27例,低耐30例),SM(高耐32例,低耐23例),K(高耐18例,低耐26例),PZA(高耐31例,低耐12例),左旋氧氟沙星(高耐4例,低耐12例)。有7例結(jié)核分支桿菌臨床分離株HRE或HRS單藥均耐藥,但聯(lián)合藥敏敏感。2·2結(jié)核分支桿菌濃度與耐藥基因突變關(guān)系分析見表2。從表中可以看出利福平、異煙肼和鏈霉素三種耐藥基因突變率隨著耐藥濃度的增高而增加。3痰菌陰轉(zhuǎn)和聯(lián)合耐藥基因檢測選擇資料完整的26例病例進行初步分析。3例初治病人開始使用HRZ治療,2個月痰菌不陰轉(zhuǎn),藥敏和聯(lián)合耐藥基因檢測發(fā)現(xiàn)HR高耐并有耐藥基因突變,改用力克肺疾、左旋氧氟沙星、乙胺丁醇等藥物和免疫調(diào)節(jié)劑治療,1月后痰菌陰性。9例復治病人藥敏和聯(lián)合耐藥基因檢測發(fā)現(xiàn)HRS高耐,HRS均有耐藥基因突變,停用HRS,改用力克肺疾、氧氟沙星、丙硫異煙胺、丁胺卡那霉素和免疫調(diào)節(jié)劑等治療3個月后,7例病人痰菌陰轉(zhuǎn)。4例復治病人藥敏和聯(lián)合耐藥基因檢測發(fā)現(xiàn)HR其中有一藥低耐,但無耐藥基因突變,堅持HR聯(lián)合用藥,并加用O、K、P等藥物及免疫調(diào)節(jié)劑治療,2個月后痰菌陰轉(zhuǎn)。3例復治病人藥敏和聯(lián)合耐藥基因檢測發(fā)現(xiàn)HRS均低耐,S或H有耐藥基因突變,但HRE或HRS聯(lián)合藥敏敏感,在HRE或HRS基礎上,加用氧氟沙星、丙硫異煙胺、PAS和免疫調(diào)節(jié)劑等藥物,3個月后2例痰菌陰轉(zhuǎn),1例痰菌量明顯減少。藥敏和聯(lián)合耐藥基因檢測發(fā)現(xiàn)H低耐,R高耐,均有耐藥基因突變,E、Z也耐藥。于是停用HREZ,改用O、P、K、力克肺疾和免疫調(diào)節(jié)劑等藥物治療,痰菌陰轉(zhuǎn)。4例復治病人藥敏和聯(lián)合耐藥基因檢測發(fā)現(xiàn)H、R低耐,均有耐藥基因突變,HR聯(lián)合藥敏耐藥,停用HR,改用其它敏感藥物,2個月后3例痰菌陰轉(zhuǎn)。2例復治病人藥敏和聯(lián)合耐藥基因檢測發(fā)現(xiàn)H、R低耐,均有耐藥基因突變,堅持H、R、O、P、Z、K等藥物治療,1例痰菌陰轉(zhuǎn)。4耐藥基因檢測4·1有關(guān)結(jié)核分支桿菌耐藥的分子機制的基礎研究已有不少報道,認為耐利福平主要是由于靶分子RNA聚合酶β亞單位的編碼基因rPOB突變所致,耐異煙肼主要與編碼基因katG和inhA操縱子有關(guān),耐鏈霉素則是編碼基因rPSL,rrs突變。但臨床標本經(jīng)Bactec-960快速增菌,將耐藥基因檢測聯(lián)合藥敏試驗用于臨床指導治療的文獻很少,本文就這一問題進行了初步研究。研究結(jié)果表明,利福平、異煙肼和鏈霉素敏感株同樣存在著耐藥基因突變,突變率分別為6.5%、11.4%和27.2%,有關(guān)文獻也有類似現(xiàn)象報道。解釋這一現(xiàn)象的可能原因為耐藥是每一種藥物靶編碼基因突變是逐漸積累的結(jié)果,PCR-SSCP很敏感,有很少量耐藥菌也能擴增陽性而藥敏表型不一定出現(xiàn)耐藥。文獻報道結(jié)核分支桿菌耐利福平、異煙肼和鏈霉素的rPOB、katG和rPSL基因突變率分別為96%~98%、47%~58%和52%~59%。本文研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)rPOB、katG和rPSL耐藥基因突變率分別為60.2%、45.7%和62.7%,65%的病人為耐多藥結(jié)核病人(MDR-TB),基因突變率報道的差異可能與各地區(qū)用藥和菌株地區(qū)分布差異有關(guān)。耐藥基因突變率隨著耐藥濃度增高而增加,表明隨著不規(guī)律用藥時間的延長,使突變率增高,耐藥性增強。4·2本文研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)藥敏梯度試驗中部分結(jié)核分支桿菌對利福平、異煙肼和鏈霉素耐藥,但未發(fā)現(xiàn)rPOB、katG和rPSL基因突變,提示我們結(jié)核分支桿菌的rPOB、katG和rPSL基因未突變并不意味著沒有其它基因突變,可能存在其它耐藥機制。4·3本組結(jié)果顯示初治肺結(jié)核病人中有1/3的病人對一種以上抗結(jié)核藥物耐藥。這說明由于受到耐藥結(jié)核桿菌感染,部分初治肺結(jié)核病人未治療前已經(jīng)耐藥,如果對這些病人按常規(guī)化療方案治療,不做藥敏和耐藥基因檢測,就會影響治療效果。4·4臨床治療中發(fā)現(xiàn)一些肺結(jié)核病人盡管藥敏試驗提示H、R、或S部分低耐或全部低耐,但HRS或HRE敏感,在上述藥物的基礎上加用一些其他敏感藥物和免疫調(diào)節(jié)劑也取得了較好的治療效果。這可能有兩方面的原因:⑴藥敏試驗RFP、INH、SM耐藥只能證明病灶菌群中有耐藥菌株存在,但并不全是耐藥菌,如果耐藥菌數(shù)量不多,繼續(xù)使用RFP、INH效果就比較好;⑵使用RFP、INH的情況下,耐藥菌活力和毒力可能較弱,強毒力的敏感菌也不易繁殖。4·5將常規(guī)藥敏試驗結(jié)果和耐藥基因檢測聯(lián)合應用可以互相彌補,提供詳盡的結(jié)核分支桿菌耐藥情況,幫助臨床醫(yī)生制定合理的化療方案,特別對MDR-TB病人治療指導意義