登革病毒2型感染人靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株eahy926對(duì)細(xì)胞自噬的影響

登革病毒2型感染人靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株eahy926對(duì)細(xì)胞自噬的影響

病毒登格病毒（dv）是一種重要的害蟲(chóng)病毒，通過(guò)堿性蚊子傳播。每年大約有100萬(wàn)人感染該病毒，并嚴(yán)重威脅到亞熱帶和亞熱帶國(guó)家的公共衛(wèi)生安全。其中，登格病毒2型（dv2）最受歡迎。登革病毒可引起人類(lèi)登革熱(denguefever,DF),嚴(yán)重者可出現(xiàn)登革出血熱(denguehemorrhagicfever,DHF)和登革休克綜合征(dengueshocksyndrome,DSS)。DHF/DSS最主要的特征為出血及血管滲漏,表明登革病毒在一定程度上會(huì)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞造成損傷。因此DV誘導(dǎo)血管內(nèi)皮損傷機(jī)制的研究一直是我們關(guān)注的焦點(diǎn)。自噬,是廣泛存在于真核細(xì)胞中的生命現(xiàn)象,是生物在其發(fā)育、老化過(guò)程中均存在的一種凈化自身多余或受損細(xì)胞器的共同機(jī)制,但過(guò)度的自噬可以導(dǎo)致細(xì)胞的程序性死亡,因此自噬又被稱(chēng)為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡。作為Ⅰ型程序性細(xì)胞死亡的凋亡與自噬之間復(fù)雜的動(dòng)態(tài)關(guān)系尚未完全清楚,一般認(rèn)為自噬作為細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制,先于凋亡發(fā)生。我們前期研究表明,DV感染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinsendotheliumcell,HUVEC)會(huì)誘導(dǎo)凋亡,在48h細(xì)胞凋亡達(dá)到高峰;DV也能誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EAhy926發(fā)生凋亡,出現(xiàn)細(xì)胞凋亡高峰時(shí)間在60h。DV誘導(dǎo)的EAhy926細(xì)胞凋亡在達(dá)到高峰之前,細(xì)胞已發(fā)生了顯著的自噬,但發(fā)生自噬的機(jī)制及與凋亡之間的相互關(guān)系不明。為了解登革病毒誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬情況,本實(shí)驗(yàn)利用流式細(xì)胞儀技術(shù)在DV2感染EAhy926細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)發(fā)生自噬的細(xì)胞百分率與酸性自噬泡平均熒光密度,以此探討登革病毒感染對(duì)EAhy926自噬的影響,為進(jìn)一步研究血管內(nèi)皮細(xì)胞引起血管滲漏綜合癥及利用自噬抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的可能性提供一定的理論參考依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1血管內(nèi)皮細(xì)胞EAhy926是由人肺腺癌細(xì)胞株A549與原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC融合構(gòu)建而成的永生化細(xì)胞株,具有血管內(nèi)皮細(xì)胞的特性,為中山醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞教研室惠贈(zèng)。1.1.2病毒DV2病毒株來(lái)自中山醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室,本實(shí)驗(yàn)室已進(jìn)行病毒擴(kuò)增和定量保存。1.1.3主試劑DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗等為Gibco產(chǎn)品。吖啶橙(acridineorange,AO)為Sigma產(chǎn)品。1.2方法1.2.1血清及青鏈霉素雙抗EAhy926用100mL/L胎牛血清及青鏈霉素雙抗為1.0×105U/L的DMEM/F12培養(yǎng)液,37℃,體積分?jǐn)?shù)為5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。1.2.2胎牛血清中eayn986的表達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EAhy926按1×106個(gè)/孔接種于6孔板,待細(xì)胞培養(yǎng)24h后,PBS洗滌2次。感染組的EAhy926取已定量好的2型登革病毒液(106pfu/mL)加入EAhy926細(xì)胞培養(yǎng)板中吸附2h,棄去上清,加入含20mL/L胎牛血清的培養(yǎng)液,同時(shí)設(shè)立對(duì)照組(未吸附病毒,用含20mL/L胎牛血清的培養(yǎng)液維持培養(yǎng)),37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng),于12、24、36、48h各時(shí)間點(diǎn)棄去培養(yǎng)液,收集細(xì)胞。1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的制備同一批EAhy926細(xì)胞分成對(duì)照組和感染組,感染組在DV2感染EAhy926細(xì)胞后12、24、36、48h分別收集細(xì)胞,500×g5min離心,用PBS洗滌2遍。用buffer重懸并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106cells/mL吸取100μL轉(zhuǎn)移至5mL的流式離心管中,加入終濃度為0.5μg/mL的吖啶橙溶液混勻,室溫避光孵育10min,PBS洗滌2遍后用buffer200μL重懸,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞做同樣處理做以對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。1.3統(tǒng)計(jì)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用ue0af±s表示,運(yùn)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和配對(duì)t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1感染組在不同時(shí)間點(diǎn)自噬細(xì)胞的細(xì)胞百分率對(duì)照組EAhy926細(xì)胞4個(gè)時(shí)間點(diǎn)(12、24、36、48h)發(fā)生自噬的細(xì)胞百分率分別為:(70±7)%,(72±6)%,(71±8)%和(69±10)%。感染組EAhy926細(xì)胞4個(gè)時(shí)間點(diǎn)自噬的細(xì)胞百分率分別為(75±3)%,(78±3)%,(77±5)%,(80±7)%(圖1),感染組自噬細(xì)胞百分率增加。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次,對(duì)照組和感染組各時(shí)間點(diǎn)發(fā)生自噬的細(xì)胞百分率經(jīng)方差分析和配對(duì)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中48h對(duì)照組和感染組發(fā)生自噬的細(xì)胞百分率差異最明顯(圖2)。2.2酸性自噬泡熒光密度對(duì)照組4個(gè)時(shí)間點(diǎn)(12h,24h,36h,48h)酸性自噬泡平均熒光密度分別為:36.4±3.4,37.0±3.3,35.8±2.3,34.4±3.2。感染組酸性自噬泡平均熒光密度分別為41.1±2.3,45.0±4.8,41.3±3.3,44.5±7.5。感染組自噬泡平均熒光密度增加。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次,對(duì)照組和感染組各時(shí)間點(diǎn)EAhy926酸性自噬泡平均熒光密度經(jīng)方差分析和配對(duì)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中在48h對(duì)照組和感染組酸性自噬泡平均熒光密度差異最明顯(圖3)。3紅色熒光的熒光檢測(cè)自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種細(xì)胞分解細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞器等自身構(gòu)成成分的生理現(xiàn)象,其發(fā)生是內(nèi)因(損傷的細(xì)胞器、變異的蛋白的大量積蓄以及微生物感染等)與外因(細(xì)胞饑餓、低氧、激素刺激等)共同作用的結(jié)果。在細(xì)胞饑餓、生長(zhǎng)因子缺乏和缺氧以及一些病理狀態(tài)下,自噬對(duì)維持細(xì)胞的存活有積極的作用,由于過(guò)度自噬可以導(dǎo)致細(xì)胞的程序性死亡,因此又被稱(chēng)為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡。自噬的過(guò)程主要包括4個(gè)環(huán)節(jié):(1)底物誘導(dǎo)的自噬前體的形成;(2)自噬體形成;(3)自噬體與溶酶體融合;(4)自噬體內(nèi)容物被降解。酸性自噬泡的產(chǎn)生是自噬的特異性過(guò)程。吖啶橙是一種熒光染料,其熒光波長(zhǎng)會(huì)隨著細(xì)胞內(nèi)pH值的變化而變化。在吖啶橙染色的細(xì)胞中,胞仁和胞漿分別發(fā)亮綠和暗紅色的熒光,而酸性細(xì)胞器發(fā)亮紅色的熒光。紅色熒光的強(qiáng)度與酸性細(xì)胞器的酸度和/或容積成正相關(guān)。因此,可以通過(guò)流式細(xì)胞儀利用FL1通道檢測(cè)綠色熒光,FL3通道檢測(cè)紅色熒光以觀(guān)察紅色熒光強(qiáng)度而判斷酸性自噬泡的形成情況,吖啶橙可以作為自噬的特征性標(biāo)記物。鑒于自噬與凋亡的復(fù)雜關(guān)系,本文在前期研究的基礎(chǔ)上,繼續(xù)探討登革病毒對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的影響,以人靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株EAhy926細(xì)胞為細(xì)胞模型進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)證明,登革病毒感染EAhy926后,在12h已出現(xiàn)顯著自噬,且長(zhǎng)時(shí)間高水平維持,這可能是由于EAhy926是由人肺腺癌細(xì)胞株A549與原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC融合構(gòu)建而成的永生化細(xì)胞株,EAhy926與A549有相似的細(xì)胞增殖能力,其細(xì)胞自噬水平與A549細(xì)胞相似。有報(bào)道1-3-芳基-1氫-吡唑-5-碳水化合物的衍生物能夠誘導(dǎo)A549發(fā)生自噬性死亡,而細(xì)胞凋亡及壞死均不明顯,內(nèi)皮抑素可誘導(dǎo)EAhy926發(fā)生高水平的自噬,而只有15%~30%的細(xì)胞出現(xiàn)了凋亡,與我們的研究結(jié)果基本吻合。感染組各時(shí)間點(diǎn)EAhy926的發(fā)生自噬的細(xì)胞百分率較對(duì)照組有所升高,其中以48h最明顯,對(duì)照組發(fā)生自噬的細(xì)胞百分率為(69±10)%,感染組自噬細(xì)胞百分率為(80±7)%,P<0.05。相應(yīng)地,感染組的EAhy926細(xì)胞酸性自噬泡的平均熒光密度較對(duì)照組有所升高,其中48h最明顯,對(duì)照組34.4±3.2,感染組為44.5±7.5,P<0.05。這可能是由于登革病毒作用于EAhy926細(xì)胞時(shí),細(xì)胞發(fā)生的自噬可以將胞內(nèi)物質(zhì)降解和循環(huán)利用而使細(xì)胞得以繼續(xù)存活,高水平的自噬在惡劣環(huán)境中對(duì)其起到了一定的