山羊胚胎延髓灰質(zhì)核團發(fā)育的組織學研究

山羊胚胎延髓灰質(zhì)核團發(fā)育的組織學研究

與脊柱相比，延髓的結(jié)構和功能更加復雜。它不僅具有整合核心和生命中心等重要結(jié)構，還具有接收和調(diào)節(jié)關于特殊教育和其他特定感覺的核心聚集。延髓內(nèi)各灰質(zhì)核團的形成和發(fā)育除了受到中胚層對神經(jīng)軸的區(qū)域化作用外,其他影響因素和其發(fā)育反饋影響的作用和范圍都很復雜。有關不同動物延髓內(nèi)核團多種物質(zhì)的定位與發(fā)育的研究已有報道,有關山羊腦干內(nèi)灰質(zhì)結(jié)構的形成和發(fā)育的資料還未見報道。本研究的目的在于闡明山羊胚胎延髓灰質(zhì)核團的形成和發(fā)育變化規(guī)律,為進一步研究山羊中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育機制提供形態(tài)學資料。1u3000定期存活劑自屠宰場取第6周齡～第21周齡的山羊胚胎,各時間段(周齡)最少3只、共取得山羊胚胎60只。生理鹽水沖洗心臟,然后用含4%甲醛的pH7.2～7.4磷酸鹽緩沖液心臟灌注固定,于4%中性甲醛溶液中后固定保存。取出延髓,流水沖洗12h后,經(jīng)梯度乙醇溶液脫水,常規(guī)石蠟包埋,切片,片厚6～8μm,HE染色,中性樹膠封片,光鏡下觀察延髓后索核、下橄欖核、舌下神經(jīng)核、疑核、迷走神經(jīng)背核、孤束核、三叉神經(jīng)脊束核、延髓網(wǎng)狀結(jié)構等核團的形成和發(fā)育。2結(jié)果2.1室管膜和延髓腹側(cè)的神經(jīng)元胞體第6周的山羊胚胎延髓處于組織發(fā)生末期和核團形成初期。第6周初期,延髓內(nèi)在迷走神經(jīng)背核(圖1)、孤束核、三叉神經(jīng)脊束核、下橄欖核等少數(shù)核區(qū)出現(xiàn)細胞密集區(qū),細胞核深染或淡染,網(wǎng)狀結(jié)構的區(qū)域可以識別;其他區(qū)域仍呈現(xiàn)室管膜層、套層和邊緣層的3層結(jié)構。室管膜層有較多的細胞,如閉合部翼板的細胞可達10～15層,在近管腔面有少量分裂相核。延髓閉合部背側(cè)正中室管膜正在融合,其兩側(cè)有較多的分裂相核。邊緣層很薄。第6周末,延髓腹側(cè)出現(xiàn)錐體束,其余核團逐漸出現(xiàn),如后索核的薄束核、舌下神經(jīng)核、中介核、舌下神經(jīng)前置核、疑核等。多數(shù)核區(qū)內(nèi)細胞密集,細胞核以深染或淡染的小圓形核為主。舌下神經(jīng)核內(nèi)出現(xiàn)較多的胞質(zhì)少、著色淡、輪廓模糊的神經(jīng)元胞體,多數(shù)細胞核直徑達8～10μm,為深染的圓形、橢圓形核(圖2)。舌下神經(jīng)前置核內(nèi)細胞核多數(shù)稍大,淡染,呈圓形。孤束核區(qū)細胞圍繞孤束聚集成群。網(wǎng)狀結(jié)構內(nèi)細胞散在分布,小圓形細胞核深染。疑核由數(shù)個輪廓模糊的小神經(jīng)元胞體組成,細胞核稍大,呈紫紅色。延髓中縫兩側(cè),出現(xiàn)少量的三角形神經(jīng)元胞體,圓形細胞核淡染。下橄欖核呈囊狀(圖3)。2.2骨髓中灰質(zhì)核團的形成和發(fā)育2.2.1神經(jīng)元胞體數(shù)量的變化山羊胚胎的后索核出現(xiàn)于第6周末,具有密集的小圓形細胞,核多深染。隨著胚齡增加,細胞密度降低,第10周時,后索核內(nèi)出現(xiàn)少量輪廓模糊的小神經(jīng)元胞體。以后,輪廓模糊的神經(jīng)元胞體逐漸增多,變大。第14周時,輪廓模糊的神經(jīng)元胞體較多,細胞核較大,少數(shù)具有明顯的中央核仁。細胞間的突起交織成網(wǎng)狀。第16周時,后索核的神經(jīng)元胞體輪廓清楚,以梭形為主,多具有淡染的泡狀細胞核。此外還有較多深染或淡染的小圓形細胞核(膠質(zhì)細胞核)。第17周以后,后索核內(nèi)輪廓清晰的神經(jīng)元胞體繼續(xù)變大,胞體內(nèi)出現(xiàn)尼氏顆粒,并逐漸增多,變大,泡狀細胞核的中央核仁明顯,神經(jīng)元胞體之間小圓形細胞核以深染核為主。到出生前,后索核內(nèi)的神經(jīng)元胞體較大,胞體內(nèi)的尼氏顆粒粗大,有的胞體因著色較淡而周界不清楚(圖4)。2.2.2核區(qū)內(nèi)不同輪廓的神經(jīng)元胞體完善和尼氏顆粒的形成山羊胚胎延髓的下橄欖核區(qū)出現(xiàn)于第6周初。第6周末,下橄欖核細胞密集,排列成囊狀,圓形細胞核深染。第7周時,下橄欖核內(nèi)出現(xiàn)少量輪廓模糊的細胞。以后,核區(qū)內(nèi)輪廓模糊的神經(jīng)元胞體逐漸增多。到第14周時,有少量神經(jīng)元胞體輪廓清楚,有些神經(jīng)細胞核著色較淡(圖5)。隨后,輪廓清楚的神經(jīng)元胞體逐漸增多,少數(shù)神經(jīng)細胞核為具中央核仁的淡染的泡狀核。到第18周時,核內(nèi)多數(shù)神經(jīng)元胞體內(nèi)出現(xiàn)細小尼氏顆粒。以后,隨著神經(jīng)元胞體增大,胞體內(nèi)的尼氏顆粒變大增多。到出生前,下橄欖核內(nèi)多數(shù)神經(jīng)元胞體較大,胞體內(nèi)的粗大的尼氏顆粒豐富,有的胞體因著色較淡而周界不清楚(圖6)。2.2.3腦損傷核團的發(fā)育2.2.3.神經(jīng)元胞體和尼氏顆粒的變化山羊胚胎舌下神經(jīng)核在第6周末出現(xiàn),核區(qū)內(nèi)的神經(jīng)元胞體輪廓模糊、胞質(zhì)少、著色淡,圓形、橢圓形的細胞核深染,長徑可達8～10μm。隨著胚齡增加,輪廓模糊的神經(jīng)元胞體變大,數(shù)量增多,細胞核著色變淡。第8周時,核區(qū)內(nèi)出現(xiàn)少量輪廓可辨的神經(jīng)元胞體。以后隨著神經(jīng)元胞體增大,可見到具有中央核仁的泡狀細胞核的神經(jīng)元胞體。第10周,少量神經(jīng)元胞體著色較深,輪廓清楚。以后,舌下神經(jīng)核的神經(jīng)元胞體不斷變大,輪廓清楚的神經(jīng)元增多。第15周時,核區(qū)內(nèi)的神經(jīng)元胞體較大,胞體內(nèi)出現(xiàn)細小的尼氏顆粒(圖7)。隨著神經(jīng)元胞體增大,胞質(zhì)內(nèi)細小的尼氏顆粒變大增多。第17周時,在神經(jīng)元胞體邊緣也可見到較大的尼氏顆粒。以后,神經(jīng)元胞體不斷變大,胞體內(nèi)的尼氏顆粒變大增多。有的神經(jīng)元胞體因胞質(zhì)著色較淡而周界不清楚,但尼氏顆粒深染,神經(jīng)元胞體之間的神經(jīng)纖維可辨。到出生前,舌下神經(jīng)核內(nèi)的神經(jīng)元胞體較大,富含粗大的尼氏顆粒,胞體之間的神經(jīng)纖維清楚(圖8)。2.2.3.疑核神經(jīng)元胞體及周界的模糊特征疑核出現(xiàn)于第6周末。以后神經(jīng)元胞體不斷增大。第8周時,疑核神經(jīng)元胞體輪廓清楚,細胞核呈淡染的橢圓形。第11周,疑核神經(jīng)元胞質(zhì)著色較淡,細胞核為淡染的泡狀核,中央核仁明顯。隨著胚齡增加,疑核神經(jīng)元胞體逐漸增大。到第15周,疑核神經(jīng)元胞體內(nèi)出現(xiàn)尼氏顆粒。以后,神經(jīng)元胞體不斷增大,胞質(zhì)內(nèi)的尼氏顆粒變大增多,著色漸深,神經(jīng)元胞體的周界變得模糊。到第19周,疑核神經(jīng)元胞體內(nèi)的尼氏顆粒粗大,胞體周界不清楚。出生前,疑核神經(jīng)元胞體較大,胞體內(nèi)富含粗大的尼氏顆粒。2.2.3.神經(jīng)元胞體變山羊胚胎迷走神經(jīng)背核出現(xiàn)于第6周初。隨著胚齡增加,核區(qū)出現(xiàn)較多輪廓模糊的神經(jīng)元胞體,胞質(zhì)少,淡染的圓形、橢圓形細胞核稍大。第7周,有的神經(jīng)元胞體輪廓可辨,細胞核較大。以后,迷走神經(jīng)背核內(nèi)的神經(jīng)元胞體逐漸變大。第9周,有的神經(jīng)細胞核內(nèi)出現(xiàn)中央核仁。第11周,核區(qū)內(nèi)出現(xiàn)一些較大的輪廓清晰的神經(jīng)元胞體,淡染的泡狀細胞核具有中央核仁,還有一些輪廓模糊的小神經(jīng)元胞體。隨著迷走神經(jīng)背核輪廓清晰的神經(jīng)元胞體變大,數(shù)量增多,具有核仁的淡染的泡狀神經(jīng)元細胞核增多,胞體之間小圓形細胞核數(shù)量增多,淡染細胞核增多。第15周,有的神經(jīng)元胞體內(nèi)出現(xiàn)較大的尼氏顆粒。以后,迷走神經(jīng)背核神經(jīng)元胞體不斷增大,尼氏顆粒變大增多。到出生前,迷走神經(jīng)背核內(nèi)神經(jīng)元胞體較大,胞體輪廓清晰,胞體內(nèi)粗大的尼氏顆粒豐富,神經(jīng)元胞體之間有許多深染的小圓形細胞核。2.2.3.神經(jīng)元胞體及核型孤束核出現(xiàn)于第6周初。第6周末,孤束出現(xiàn),孤束核細胞圍繞聚集成群。隨胎齡增加,孤束核的細胞密度變低,神經(jīng)元胞體逐漸發(fā)育。第9周,孤束核內(nèi)出現(xiàn)少量輪廓模糊的小神經(jīng)元胞體,圓形細胞核深染。第12周,少量神經(jīng)細胞核著色變淡,呈圓形、橢圓形。第14周,孤束核內(nèi)出現(xiàn)少量輪廓可辨的神經(jīng)元胞體,輪廓模糊的小神經(jīng)元胞體較多。隨著胚齡增加,神經(jīng)元胞體增大,輪廓可辨的神經(jīng)元胞體數(shù)量增多。第16周,有的神經(jīng)元胞體輪廓清楚,細胞核呈淡染的泡狀核。并且隨著胚齡增加,此類神經(jīng)元胞體數(shù)量逐漸增多。第19周,孤束核內(nèi)輪廓清楚的神經(jīng)元胞體較大,數(shù)量較多,神經(jīng)元細胞核多為淡染的泡狀核。第20周,神經(jīng)元胞體內(nèi)出現(xiàn)少量尼氏顆粒。到出生前,孤束核內(nèi)的神經(jīng)元胞體較大,胞體內(nèi)的尼氏顆粒較多。2.2.3.叉神經(jīng)脊束密度和胚齡對神經(jīng)元胞體的影響三叉神經(jīng)脊束核出現(xiàn)于第6周初。第7周,核區(qū)內(nèi)出現(xiàn)個別輪廓模糊的小神經(jīng)元胞體,多數(shù)細胞胞質(zhì)不著色,細胞核以深染的圓形核為主。隨著胚齡增加,三叉神經(jīng)脊束核內(nèi)細胞密度逐漸降低,輪廓模糊的神經(jīng)元胞體逐漸增多,細胞核逐漸增大。第13周,三叉神經(jīng)脊束核內(nèi)出現(xiàn)少量輪廓可辨的神經(jīng)元胞體。第14周,三叉神經(jīng)脊束核內(nèi)出現(xiàn)少量輪廓清楚的小神經(jīng)元胞體。隨著胚齡增加,核區(qū)內(nèi)輪廓清楚的神經(jīng)元胞體逐漸變大,數(shù)量增多。到第19周,三叉神經(jīng)脊束核多數(shù)神經(jīng)元胞體較大,胞體內(nèi)出現(xiàn)細小的尼氏顆粒,細胞核多為具中央核仁的淡染泡狀核。以后,核區(qū)內(nèi)的神經(jīng)元胞體逐漸變大,胞體內(nèi)的尼氏顆粒變大增多。到出生前,三叉神經(jīng)脊束核內(nèi)神經(jīng)元胞體較大,胞體內(nèi)較大的尼氏顆粒較多。2.2.4小神經(jīng)元胞體的出現(xiàn)延髓網(wǎng)狀結(jié)構的區(qū)域出現(xiàn)于第6周初。第8周,此區(qū)出現(xiàn)少量輪廓模糊的神經(jīng)元胞體,可見束狀的神經(jīng)纖維。以后,輪廓模糊的神經(jīng)元胞體變大,數(shù)量增多。第10周,出現(xiàn)少量輪廓可辨的小神經(jīng)元胞體。第11周,出現(xiàn)一些多極神經(jīng)元胞體,大小不一,胞體周界不清晰,細胞核為深染或淡染的圓形核。第12周,有的多極神經(jīng)元胞體輪廓清楚,出現(xiàn)泡狀細胞核。隨著胚齡增加,此類神經(jīng)元胞體逐漸增大,數(shù)量增多。到第17周,延髓網(wǎng)狀結(jié)構內(nèi)神經(jīng)元胞體大小不一,輪廓清楚,胞體邊緣出現(xiàn)細小的尼氏顆粒,細胞核為具核仁的泡狀核。以后,神經(jīng)元胞體繼續(xù)增大,尼氏顆粒變大增多。到出生前,延髓網(wǎng)狀結(jié)構內(nèi)神經(jīng)元胞體較大,胞體內(nèi)較大的尼氏顆粒豐富,有的胞體因著色較淡而周界不清楚,但尼氏顆粒著色深。3討論3.1延髓其他核團的出現(xiàn)和發(fā)展本研究結(jié)果表明第6周初山羊胚胎延髓仍處于神經(jīng)管的組織發(fā)生后期。在此時延髓內(nèi)迷走神經(jīng)背核已出現(xiàn),而在孤束核、三叉神經(jīng)脊束核、下橄欖核區(qū)出現(xiàn)細胞密集區(qū)。到第6周末,延髓其他的核團,如背索核的薄束核、楔束核和副楔核、舌下神經(jīng)核及其周核(中介核,舌下神經(jīng)前置核)、延髓網(wǎng)狀結(jié)構、疑核,三叉神經(jīng)孤束及孤束核等都已可以區(qū)分其范圍。這提示第6周是山羊胚胎延髓內(nèi)部核團構建的關鍵時期,各個核團內(nèi)的神經(jīng)元也多在第7周以前分裂增殖形成。3.2神經(jīng)組織形態(tài)變化的表現(xiàn)很多組織化學資料表明神經(jīng)核團內(nèi)某種特定物質(zhì)的發(fā)育變化具有其自身特點,并且與神經(jīng)組織的整體發(fā)育密切相關。如,李鎮(zhèn)國等觀察大鼠腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶在三腦泡時就已出現(xiàn),此時腦內(nèi)的核團尚未形成,這說明神經(jīng)細胞的某些化學特性早在神經(jīng)細胞增殖時就已定性。饒志仁等也發(fā)現(xiàn)人胎兒5-HT樣神經(jīng)元在懷孕第7～11.5周開始增殖分化,在第16、18、22周時分別又分化數(shù)個亞群,到6個月時5-HT樣神經(jīng)元基本到達最終位置。這提示盡管某些神經(jīng)細胞的化學特性早在神經(jīng)細胞增殖時就已出現(xiàn),但大多數(shù)神經(jīng)元胞體的特征是在神經(jīng)核團形成后才逐漸出現(xiàn)的,包括在增殖期就已定性的那些類型的細胞,大多數(shù)也是在核團形成以后,逐漸分化形成的,并非由早期形成的那些細胞在以后遷移而來。在眾多的關于神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)某些核團內(nèi)某種特定物質(zhì)定位與發(fā)育的研究中,該物質(zhì)出現(xiàn)的時間規(guī)律、分布范圍的變化規(guī)律,以及該類型神經(jīng)元胞體或神經(jīng)纖維的形態(tài)學變化規(guī)律,都是人們關注的重心。如,人胎兒腦干內(nèi)5-HT免疫反應陽性細胞在核團定位以后密度明顯下降。大鼠孤束核內(nèi)NT-LI(神經(jīng)降壓肽樣免疫反應陽性)細胞均數(shù)在生后4～15d增長最快,第15天達到最高,以后也開始逐漸減少。在人胎兒和新生兒腦干內(nèi),L-ENK(亮氨酸腦啡肽)樣胞體數(shù)量的發(fā)育變化表現(xiàn)出多種形式,有隨胎齡增長而增多者,有變化不大者,有減少者,也有由少(或無)到多,最后又變少以至于消失者。雞腦中乙酰膽堿酯酶陽性神經(jīng)元、生長相關蛋白、突觸素、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶樣免疫反應產(chǎn)物在發(fā)育過程中都表現(xiàn)出快慢交替的階段規(guī)律,陽性產(chǎn)物的變化趨勢有“少到多后保持不變”,“少到多再減少”,“持續(xù)增加”三種形式。通過對該物質(zhì)在動物腦內(nèi)表達時空規(guī)律的研究有助于理解其在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的作用。但在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi),灰質(zhì)結(jié)構的形成和發(fā)育不僅受到中胚層對神經(jīng)軸的區(qū)域化作用,同時還受到所在區(qū)域中其他灰質(zhì)核團、以及與其相聯(lián)系的外周其他器官組織或低級神經(jīng)中樞、高級神經(jīng)中樞的發(fā)育與功能狀態(tài)的影響,而灰質(zhì)核團的形成和發(fā)育又可以反饋地影響相應的神經(jīng)結(jié)構和組織器官的發(fā)育。對神經(jīng)系統(tǒng)核團內(nèi)某種特定物質(zhì)定位與發(fā)育研究可以獲得特定類型神經(jīng)元發(fā)育的信息,但對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育信息缺乏整體的、全面的了解。也許是HE染色技術本身太過普通,加之沒有豐富的經(jīng)驗很難發(fā)現(xiàn)神經(jīng)組織發(fā)育的特征變化?，F(xiàn)在的研究者很少運用這一技術來觀察神經(jīng)核團的發(fā)育變化。然而HE染色卻非常適合于研究神經(jīng)組織的發(fā)育變化的一般性規(guī)律。HE染色和超薄切片技術研究表明山羊脊髓運動神經(jīng)元發(fā)育變化的組織學特征與其胞體超微結(jié)構發(fā)育變化特征具有一致性,這說明神經(jīng)元發(fā)育變化的組織學特征能夠作為鑒別神經(jīng)元胞體的發(fā)育階段的指標之一。由于尼氏小體易被堿性染料著色,而細胞核內(nèi)的異染色質(zhì)著色,常染色質(zhì)不著色。光鏡下神經(jīng)細胞的發(fā)育變化主要反映在尼氏體與細胞核兩方面。在神經(jīng)細胞發(fā)育早期,各種細胞器都較少,因而發(fā)育變化以細胞核的變化為主,隨著胞體內(nèi)細胞器逐漸增多,胞體變大,細胞輪廓逐漸清晰,尼氏小體開始出現(xiàn)并發(fā)育。在神經(jīng)細胞不同發(fā)育時期,細胞核的大小、功能活動不一樣,因而也呈現(xiàn)一定的組織學變化。本研究觀察到核團中的神經(jīng)細胞的密度持續(xù)降低,但在同一核團內(nèi),較為成熟的神經(jīng)元胞體的數(shù)量存在由少到多的增長趨勢,直到全部神經(jīng)元都發(fā)育成熟。因此那些在胚胎期就發(fā)育成熟的核團內(nèi)具有相同化學特性的神經(jīng)元表現(xiàn)出“少到多后保持不變”的規(guī)律。此外,不同核團中的神經(jīng)元發(fā)育變化的規(guī)律,在時間上也有較大的差異,有的核團內(nèi)的神經(jīng)元在胎兒期并未達到成熟,在這些核團內(nèi)具有相同化學特性的神經(jīng)元的數(shù)量在胚胎期表現(xiàn)為“持續(xù)增加”的模式。在發(fā)育過程中,神經(jīng)遞質(zhì)不僅具有神經(jīng)調(diào)制物的遞質(zhì)性作用,同時還具有非遞質(zhì)作用,如促進神經(jīng)元發(fā)育、分化,誘導突觸形成、突觸修飾,營養(yǎng)等作用。尤其那些在胚胎發(fā)育早期短暫表達的神經(jīng)介質(zhì)常常具有這種作用。尼氏小體是神經(jīng)元胞體內(nèi)的特征性結(jié)構,是胞質(zhì)中合成蛋白質(zhì)的主要機構,本研究觀察到尼氏小體是在神經(jīng)元胞體的形態(tài)形成以后,逐漸出現(xiàn)的,并且也存在由