粉防己堿的生物活性及對(duì)肝纖維化及腸易激綜合征的影響

粉防己堿的生物活性及對(duì)肝纖維化及腸易激綜合征的影響

防止承認(rèn)堿是千金藤科植物防止秘密行為的主要活性成分，化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于異羥色胺類化合物。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外對(duì)其藥理作用機(jī)制進(jìn)行了較為廣泛的研究。資料表明,Tet具有多種生物學(xué)效應(yīng),在治療纖維化、門靜脈和肺動(dòng)脈高壓,免疫機(jī)能調(diào)節(jié)及腫瘤防治等方面具有很好的應(yīng)用前景。1基本藥物機(jī)制1.1tet的調(diào)節(jié)作用Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)異常,細(xì)胞漿Ca2+濃度升高是多種疾病的病理生理基礎(chǔ)。Tet通過(guò)抑制細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流,干預(yù)細(xì)胞內(nèi)Ca2+分布,維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài),從而阻斷有關(guān)病理過(guò)程。利用膜片鉗記錄技術(shù)表明Tet可劑量和時(shí)間依賴性地阻滯嗜鉻細(xì)胞膜電壓依賴性Ca2+通道,較高濃度Tet(1×10-4mol·L-1)可抑制誘生肌醇三磷酸(inositoltrisphosphate,IP3)藥物引起的大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞內(nèi)Ca2+動(dòng)員;而在較低濃度時(shí)(1×10-5mol·L-1)即可阻滯高濃度K+(3×10-2mol·L-1)誘導(dǎo)的細(xì)胞漿Ca2+濃度持續(xù)性升高和部分抑制緩激肽誘導(dǎo)的細(xì)胞漿Ca2+升高。我們研究結(jié)果表明Tet在阻斷肝細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流的同時(shí),還可促進(jìn)線粒體對(duì)Ca2+的攝取、抑制線粒體Ca2+動(dòng)員;但在維持肝細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)過(guò)程中,阻斷Ca2+內(nèi)流起著主要作用。Tet對(duì)于靜止期神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞漿內(nèi)Ca2+濃度無(wú)明顯影響,但可劑量和時(shí)間依賴性地抑制毒胡蘿卜素(bombesin)及鈴蟾肽(thapsigargin,TG)導(dǎo)致IP3積聚和細(xì)胞內(nèi)Ca2+動(dòng)員,降低Ca2+濃度升高峰值和持續(xù)時(shí)間。Bickmeyer等研究發(fā)現(xiàn)5×10-2mol·L-1KCl處理1min可使神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系108-15細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度一過(guò)性升高,1×10-4mol·L-1Tet預(yù)處理7min后再給予同樣濃度的K+以去極化,Ca2+內(nèi)流則被阻斷。緩激肽可通過(guò)激活第二信使IP3誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存Ca2+釋放,1×10-4mol·L-1Tet預(yù)處理7min可顯著下調(diào)NG108-15細(xì)胞對(duì)緩激肽的反應(yīng),Tet還能夠顯著抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)IP3生成及Ca2+釋放,提示Tet除阻滯細(xì)胞膜電壓門控通道介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流外,還可通過(guò)阻滯受體門控通道干預(yù)細(xì)胞內(nèi)Ca2+分布。1×10-4mol·L-1Tet能夠阻滯毒胡蘿卜素誘導(dǎo)NIH/3T3纖維母細(xì)胞和腮腺腺泡細(xì)胞Ca2+內(nèi)流,但不能抑制抗CD3抗體OKT3或TG誘導(dǎo)白血病T細(xì)胞Ca2+內(nèi)流;能夠阻斷HL-60細(xì)胞非電壓門控Ca2+通道的激活,但可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+動(dòng)員。Xuan等用熒光指示劑Fura-2/AM觀察到谷氨酸鹽、血清素及組織胺可劑量依賴性的誘導(dǎo)視網(wǎng)膜細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流,3×10-5mol·L-1Tet可使上述3種物質(zhì)誘導(dǎo)Ca2+內(nèi)流分別減少28%、46.8%和29%;但在無(wú)Ca2+培養(yǎng)液中,Tet不能阻滯血清素和組織胺誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高,結(jié)果說(shuō)明Tet可通過(guò)N-甲酰D-門冬氨酸、血清素及組織胺(H1)受體調(diào)控的Ca2+通道阻滯Ca2+內(nèi)流,但對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放無(wú)明顯影響。由此可見(jiàn),Tet對(duì)不同組織類型細(xì)胞Ca2+通道阻滯的作用機(jī)制不同,可分別或同時(shí)阻滯電壓門控通道和受體門控通道,且可激發(fā)某些腫瘤細(xì)胞內(nèi)Ca2+動(dòng)員,升高細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。1.2小鼠骨髓中nf-b的表達(dá)臨床上,植物粉防己常被用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病,其主要生物活性成分Tet具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能。研究表明Tet通過(guò)下調(diào)T細(xì)胞蛋白激酶C信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,抑制T細(xì)胞增殖,減少IL-2的分泌及下調(diào)T細(xì)胞激活抗原CD71的表達(dá),這一作用與Ca2+通道阻滯無(wú)關(guān)。Shen等發(fā)現(xiàn)10-7～10-5mol·L-1Tet可顯著抑制N-甲?；鞍滨Ａ涟滨１奖彼?N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine)、氟波醇豆蔻酸鹽乙酸酯(phorbol-myristate-acetate,PMA)誘導(dǎo)嗜中性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1表達(dá)上調(diào)、自由基聚集及對(duì)纖維蛋白原粘附。10-7～10-4mol·L-1Tet可劑量和時(shí)間依賴性地引起小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、豚鼠肺巨噬細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系J774細(xì)胞活性喪失;能夠抑制巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā),減少氧自由基的生成,下調(diào)多種炎性細(xì)胞因子的合成與釋放。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活與致炎因子的表達(dá)呈正相關(guān)。Tet可劑量依賴性抑制內(nèi)毒素、PMA及二氧化硅誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞NF-κB的激活及NF-κB依賴報(bào)告基因(reportergene)的表達(dá),但對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子Sp-1的DNA結(jié)合活性及Sp-1依賴報(bào)告基因的表達(dá)無(wú)影響,這一作用與抑制IκB降解的某些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、清除羥自由基有關(guān)。1.3tet的誘導(dǎo)Lai等發(fā)現(xiàn)Tet時(shí)間和劑量依賴性抑制人白血病細(xì)胞系U937增殖及細(xì)胞克隆形成,其最適濃度為2.5×10-6mol·L-1。光鏡下可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)具有凋亡特征,凝膠電泳見(jiàn)DNA梯形條帶,同時(shí)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)U937細(xì)胞具有磷脂酰絲氨酸外翻。結(jié)果提示Tet可通過(guò)非Ca2+依賴途徑誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡。Tet可劑量依賴性地抑制人白血病HL-60細(xì)胞增殖。鏡下見(jiàn)細(xì)胞膜皺縮,凋亡小體形成;凝膠電泳可見(jiàn)清晰的DNA梯形條帶。Tet處理BM13674細(xì)胞8h后即可見(jiàn)細(xì)胞凋亡形態(tài)特征和典型DNA梯形條帶形成,作用較糖皮質(zhì)激素更加迅速?？杀涣字岷铣擅敢种苿锼?okadaicacid)所阻斷;表明其作用機(jī)制可能為轉(zhuǎn)錄后蛋白質(zhì)修飾。1.4tet的糖活腫瘤細(xì)胞MDR是影響癌癥化學(xué)治療效果的關(guān)鍵所在,其主要機(jī)制之一是細(xì)胞膜P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)過(guò)度表達(dá)。P-gp是一種細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,可把抗癌藥物泵出腫瘤細(xì)胞,降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度;最終導(dǎo)致抗腫瘤藥物的細(xì)胞毒性下降。研究表明非細(xì)胞毒濃度的Tet可以增加阿霉素(doxorubicin,Dox)對(duì)三尖杉酯(harringtonine)耐受HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制,集落形成抑制率增加300倍,阻滯于G2M期的細(xì)胞比率增多,細(xì)胞內(nèi)Dox聚集增加;但Tet不能增加Dox敏感HL-60的細(xì)胞毒性。Choi等發(fā)現(xiàn)3×10-6mol·L-1Tet可使paclitaxel對(duì)P-gp陽(yáng)性HCT15細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度下降3100倍,Dox的半數(shù)抑制濃度下降36倍;但對(duì)P-gp陰性的SK-OV-3細(xì)胞,Tet不能增加上述藥物的細(xì)胞毒性。上述資料提示Tet可通過(guò)調(diào)節(jié)P-gp增強(qiáng)MDR相關(guān)性藥物的細(xì)胞毒性。此外,Tet還可抑制血小板聚集及釋放血小板因子,抑制血栓素TXB2的形成及磷脂酶A2激活,從而減少血栓的形成;阻斷血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derivedgrowthfactor,PDGF)促細(xì)胞增殖,抑制DNA合成,同時(shí)可使抑癌基因p53的表達(dá)增強(qiáng),可能是一種誘導(dǎo)分化劑。2預(yù)防和控制dea的疾病2.1tet的表達(dá)Chen等觀察了Tet對(duì)四氯化碳(carbontetrachloride,CCl4)致肝細(xì)胞損傷的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,1×10-9～1×10-6mol·L-1Tet可使肝細(xì)胞膜的流動(dòng)性增加71%～89%,乳酸脫氫酶釋放和丙二醛(malondialdehyde,MDA)形成顯著減少;細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度降低,提示Tet可能通過(guò)阻斷Ca2+內(nèi)流、清除自由基達(dá)到保護(hù)肝細(xì)胞作用。給予大鼠硫唑嘌呤(azathioprine,Aza)25mg·kg-1·d-1,靜脈注射2wk,可使血清轉(zhuǎn)氨酶(alanineaminotransferase,ALT)、堿性磷酸酶(alkalinephospahatase,AKP)、MDA顯著增高;還原型谷光甘肽(reductiveglutathione,GSH)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)降低;肝組織病理變化顯著。在給予Aza同時(shí)給予Tet30mg·kg-1·d-1,治療組動(dòng)物血清ALT、AKP、MDA、GSH、SOD與正常對(duì)照組無(wú)明顯差異,病理組織學(xué)變化輕微。我們采用流式細(xì)胞技術(shù)觀察1×10-5～6×10-5mol·L-1Tet對(duì)大鼠肝細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,結(jié)果表明Tet呈濃度依賴性促進(jìn)G1期向S期轉(zhuǎn)化,S期DNA含量及G1、G2期細(xì)胞蛋白質(zhì)含量顯著增加;不同濃度的Ca2+及ATP可促進(jìn)或抑制肝細(xì)胞生長(zhǎng),加入外源性Ca2+及ATP對(duì)Tet促肝細(xì)胞增值無(wú)顯著影響,提示Tet促進(jìn)肝細(xì)胞增殖作用與阻斷Ca2+內(nèi)流無(wú)關(guān)。2.2肝組織病理學(xué)檢測(cè)Tet能夠顯著減輕CCl4誘導(dǎo)大鼠實(shí)驗(yàn)性肝纖維化程度,降低纖維化大鼠血清ALT、透明質(zhì)酸(hyaluronicacid,HA)、Ⅲ型前膠原(procollagenⅢpeptide,PⅢP)含量,改善肝功能,減輕肝病理?yè)p害程度,抑制肝細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)形成,膠原沉積減少。Tet治療組大鼠肝組織中星狀細(xì)胞(hepaticstellatecell,HSC)的增殖、轉(zhuǎn)化下調(diào),結(jié)蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少,圖像分析表明單位面積肝組織膠原沉積比例明顯低于模型組,效果與陽(yáng)性對(duì)照藥物秋水仙堿相似。HSC為寄居于肝竇Diss間隙的間質(zhì)細(xì)胞。生理?xiàng)l件下,HSC處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài),其主要功能是維持ECM動(dòng)態(tài)平衡和貯存維生素A。病理狀態(tài)下,多種因素(尤其是各種細(xì)胞因子)誘導(dǎo)HSC激活、增殖、轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細(xì)胞,合成和分泌大量膠原,ECM的成分和數(shù)量發(fā)生改變。此病理過(guò)程是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。體外研究表明Tet可顯著抑制常規(guī)培養(yǎng)HSC的激活,減少DNA及膠原合成,下調(diào)Ⅰ型及Ⅲ型膠原mRNA表達(dá);阻斷PDGF促HSC增殖及膠原合成作用;減少HSC激活過(guò)程中PDGF、PDGF受體β(PDGF-Rβ)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforminggrowthfactor,TGFβ1)的自分泌;下調(diào)PDGF、PDGF-Rβ、TGFβ1及平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)的mRNA表達(dá)水平,提示Tet可能通過(guò)阻滯細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、干預(yù)細(xì)胞因子表達(dá)及減輕炎癥反應(yīng)等途徑阻斷肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。臨床研究顯示肝硬化患者口服Tet3mon后,靜脈色氨酸耐量實(shí)驗(yàn)明顯改善;服藥6～18mon后,血清PⅢP、HA含量顯著下降;肝、腎功能不同程度得以改善;肝組織穿刺活檢發(fā)現(xiàn)治療前后患者肝組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕或消失,膠原纖維沉積減少,Ⅰ型及Ⅲ型膠原含量顯著下降,療效明顯優(yōu)于肝泰樂(lè)治療組,提示具有一定的臨床應(yīng)用前景。2.3tet的應(yīng)用門靜脈高壓是各種原因所致肝硬化的主要臨床表現(xiàn),由此導(dǎo)致上消化道出血等并發(fā)癥而常為肝硬化患者的主要死亡原因。給予實(shí)驗(yàn)性肝硬化大鼠分別靜脈注射Tet2.0、6.0、20mg·kg-1·d-1,發(fā)現(xiàn)Tet可劑量依賴性降低門靜脈壓力和門靜脈血流量、平均動(dòng)脈壓及外周阻力。Huang等給予門靜脈部分結(jié)扎致門靜脈高壓模型大鼠20mg·d-1灌胃,每日2次,連續(xù)8d,能夠顯著減低門靜脈壓力,同時(shí)能夠降低正常大鼠的平均動(dòng)脈壓和外周阻力,但對(duì)腹腔臟器及腎臟血流動(dòng)力學(xué)無(wú)明顯影響。我們臨床研究表明Tet能夠顯著減低肝硬化患者門靜脈壓力,減少門靜脈血流量,降低食管曲張靜脈壓力;連續(xù)用藥患者2年內(nèi)無(wú)再次出血率達(dá)87.6%,療效顯著顯著優(yōu)于安慰劑、硝苯地平及維拉帕米。對(duì)628例肝硬化并發(fā)食管曲張靜脈破裂出血患者隨訪1～9年,發(fā)現(xiàn)口服Tet加硬化劑注射組較單純硬化劑注射組的曲張靜脈閉塞率高,再出血發(fā)生率及死亡率降低。Tet減低門靜脈壓力可能與阻滯血管平滑肌細(xì)胞電壓依賴性及受體依賴性Ca2+內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)Ca2+動(dòng)員,擴(kuò)張外周血管,減少回心血量有關(guān)。Tet在降低肝硬化大鼠門靜脈壓力的同時(shí),還可明顯增加胃粘膜前列腺素E2的含量,改善胃粘膜的屏障功能,對(duì)門脈高壓性胃病具有防治作用。3tet的應(yīng)用肺纖維化及肺動(dòng)脈高壓是多種慢性肺部炎癥病變的最終轉(zhuǎn)歸。1×10-7～1×10-4mol·L-1Tet可劑量和時(shí)間依賴性抑制內(nèi)毒素及干擾素-γ誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞環(huán)氧化酶-2(cyclo-ocygenase,COX-2)和誘生型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)產(chǎn)生和促炎因子釋放。顯著抑制人血清或血清加PDGF、表皮生長(zhǎng)因子及TNF誘導(dǎo)體外培養(yǎng)肺成纖維母細(xì)胞增殖,下調(diào)3H標(biāo)記胸腺嘧啶3H-TdRDNA參入,減少膠原合成。Tet可降低石英塵吸入大鼠的全肺干重,Ⅰ型及Ⅲ型膠原含量顯著低于模型組,還使其mRNA水平下調(diào),提示Tet可在轉(zhuǎn)錄水平抑制膠原合成;Tet單獨(dú)或與羥基磷酸哌喹聯(lián)合應(yīng)用治療矽肺,患者呼吸系統(tǒng)癥狀緩解率為55.7%～66.0%,X線胸片好轉(zhuǎn)率為3.3%～13.3%,療效明顯高于肺灌洗及安慰劑組。Tet50、100、150mg·kg-1·d-1灌胃3wk,可劑量依賴性降低實(shí)驗(yàn)性炎性肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈壓力及右心指數(shù),對(duì)全身動(dòng)脈壓無(wú)明顯影響;用Verhoff膠原染色和計(jì)算機(jī)圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)100mg·kg-1·d-1Tet可顯著降低纖維間隔厚度和面積,可使肺動(dòng)脈高壓大鼠肺腺泡內(nèi)動(dòng)脈中膜厚度、中膜厚度占血管外徑百分比、肌型動(dòng)脈數(shù)及部分肌型動(dòng)脈數(shù)分別減少16.4%、30.5%、24.3%和16.4%,并使無(wú)肌型動(dòng)脈數(shù)增加24.7%,肺腺泡動(dòng)脈內(nèi)