膠體金免疫層析檢測法的建立與優(yōu)化

膠體金免疫層析檢測法的建立與優(yōu)化

近年來，河口、內(nèi)灣和沿海水域的紅潮發(fā)生率和破壞程度顯著增加。目前已知能夠產(chǎn)生毒素的赤潮生物有70多種。腹瀉性貝毒(DSP)作為主要的赤潮毒素,包括鰭藻毒素(DTX)和軟海綿酸(OA)兩類,主要由鰭藻屬和底棲甲藻利瑪原甲藻等產(chǎn)生。DSP中毒癥狀為腹瀉和嘔吐,而OA導(dǎo)致體內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化,且能促進(jìn)腫瘤形成。目前DSP檢測標(biāo)準(zhǔn)方法是采用小鼠生物法,不僅耗時(shí),而且靈敏度低,迫切需要改進(jìn),其他檢測方法包括生物傳感器法、免疫法、酶活性抑制分析法等,各種方法的檢測成本、時(shí)間和特異性相差較大。建立快速簡便的檢測技術(shù)可為赤潮研究、生態(tài)環(huán)境監(jiān)測以及食品安全檢驗(yàn)提供簡便、快捷的技術(shù)支持。膠體金免疫層析法(GICA)檢測耗時(shí)較少,且無需檢測儀器,特別適用于現(xiàn)場大批量樣品篩查。本研究對(duì)自制單克隆抗體進(jìn)行膠體金標(biāo)記,通過競爭免疫層析反應(yīng),初步研制出OA膠體金檢測試紙條,可用于OA快速檢測。1材料和方法1.1kco3-tis/bsaOA標(biāo)準(zhǔn)品(北京伊普瑞斯),OA-OVA包被抗原及OA單克隆抗體制備參照文獻(xiàn),1.0mg/mL羊抗鼠HRP-IgG(美國Sigma),1%氯金酸(HAuCl4)、1%枸櫞酸三鈉、0.2mol/LK2CO3、含1%BSA的0.02mol/LTris、0.01mol/LPBS(國藥集團(tuán));M135硝酸纖維素膜(德國Millipore),iMark酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad),ZX1000噴膜機(jī)和CM4000切條機(jī)(美國BioDot)。1.2抗體檢測參照文獻(xiàn)制備不同直徑大小的膠體金顆粒,分別標(biāo)記鼠抗OA單克隆抗體,按工藝組裝試紙條,以1例陽性標(biāo)本及PBS加樣,比較不同顆粒大小金標(biāo)結(jié)合物的檢測效果。陽性標(biāo)本OA濃度為50ng/mL,要求5min內(nèi)不出現(xiàn)檢測線,PBS要求顯色強(qiáng),下同。1.3抗體沉淀方法取單抗0.5mL,加0.01mol/LPBS(pH7.2)0.5mL,混勻;加飽和硫酸銨1mL,4℃混勻靜置30min。離心力11100g離心15min,取沉淀用0.01mol/LPBS(pH7.2)0.6mL溶解。相同方法用飽和硫酸銨(0.40、0.33mL)沉淀抗體2次,沉淀用PBS0.5mL溶解。溶解液用PBS作1∶10稀釋,測定A260和A280,按如下公式計(jì)算鹽析單抗?jié)舛?鹽析單抗?jié)舛?mg/mL)=A280×1.45-A260×0.74。1.4離心沉淀取膠體金2mL,加50～400μg/mL單抗0.2mL,攪拌混勻1h,再加20mgBSA,繼續(xù)攪拌30min,離心力11100g離心30min,取沉淀用20mmol/LTris-HCl(pH7.4)100μL溶解,加BSA至終濃度為10mg/mL,4℃保存?zhèn)溆?。用噴金機(jī)按2.5μL/cm均噴不同濃度金標(biāo)鼠抗OA,干燥后組裝試紙,以50ng/mLOA陽性標(biāo)本和PBS加樣比較不同單抗量對(duì)檢測靈敏度的影響。1.5抗鼠抗自身藥物敏感試驗(yàn)用噴金機(jī)對(duì)金標(biāo)單抗進(jìn)行包被,噴不同噴量,干燥后按工藝組裝試紙,以陽性標(biāo)本和PBS加樣比較不同包被濃度的靈敏度。調(diào)整鼠抗OA-OVA包被濃度,按制備工藝組裝試劑條,以陽性標(biāo)本和PBS加樣比較不同包被濃度的靈敏度。調(diào)整羊抗鼠IgG抗體濃度,按制備工藝組裝試劑條,以PBS加樣比較不同包被濃度對(duì)照線顯色時(shí)間。制備的膠體金試劑條加入50ng/mLOA標(biāo)準(zhǔn)品,觀察檢出時(shí)間。以各最佳試驗(yàn)條件制備金標(biāo)測試條,對(duì)各濃度OA作靈敏度檢測。1.6樣品處理和蒸發(fā)洗凈蛤蜊樣品,去殼后瀝干,用高速分散均質(zhì)器將生物體勻漿;稱取勻漿樣品5g,置離心管中,加入一定量OA標(biāo)準(zhǔn)液,隨后按1∶2(m/v)的比例加入80%(v/v)弱酸性甲醇溶液,渦旋混勻5min;3500r/min離心10min,取上清按1∶1(v/v)加入正己烷進(jìn)行脫脂,收集合并正己烷相用于后續(xù)水解處理;向脫脂樣品的甲醇相中按1∶1(v/v)加入氯仿溶液,收集氯仿提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干,用100μL甲醇溶解殘余物,經(jīng)PBST(含吐溫-20的PBS)稀釋混勻后以0.45μm濾膜過濾;用膠體金試劑條檢測提取液。1.7貝組織的提取將蛤蜊置于密度約為106/mL的利馬原甲藻培養(yǎng)液中,分別在攝食0、2、48、96h后取樣;清洗后稱量2g蛤蜊樣品,每個(gè)樣品稱量3份,按1∶2(m/v)的比例加入80%(v/v)甲醇水溶液,用組織勻漿機(jī)處理5min;以3500r/min離心10min,取上清液;按照1∶1(v/v)加入正己烷進(jìn)行脫脂,收集合并正己烷相用于后續(xù)水解處理;向脫脂樣品的甲醇相中按1∶1(v/v)加入氯仿溶液,收集氯仿提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干,并以1mL甲醇溶解(相當(dāng)于每毫升甲醇提取2g貝組織);用膠體金試劑條檢測提取液。2結(jié)果2.1s標(biāo)本檢測顯色顆粒大小必須同時(shí)滿足試紙條檢測線(T線)陽性標(biāo)本檢測不顯色和PBS標(biāo)本檢測顯色明顯2個(gè)要求。試驗(yàn)結(jié)果顯示,在直徑大小分別為5、18、30、50nm4種膠體金顆粒中,僅30nm金顆粒可同時(shí)滿足上述2個(gè)要求,且具有較高穩(wěn)定性,可用于抗體標(biāo)記和試紙條制備。2.2膠體金對(duì)濃度的影響用PBS對(duì)鹽析單抗作1:10稀釋,測定A260=0.2496,A280=0.4273,計(jì)算單抗?jié)舛葹?.35mg/mL,以膠體金對(duì)濃度分別為50、100、200、300、400μg/mL單抗進(jìn)行標(biāo)記,分別制備試紙條檢測陽性標(biāo)本及PBS標(biāo)本,結(jié)果顯示單抗?jié)舛葹?00、300μg/mL時(shí),陽性與PBS標(biāo)本檢測結(jié)果均符合上述2個(gè)要求,考慮試劑成本,選擇單抗?jié)舛?00μg/mL。2.3試紙條的檢測按金標(biāo)單抗噴量1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5μL/cm制備試紙條,并檢測陽性標(biāo)本和PBS標(biāo)本,結(jié)果顯示當(dāng)噴量為2.5μL/cm時(shí),檢測結(jié)果符合上述2個(gè)要求。2.4bs標(biāo)本檢測以0.1、0.25、0.5、0.75、1.0mg/mL作為OA-OVA包被濃度包被T線,分別制備試紙條并進(jìn)行陽性標(biāo)本和PBS標(biāo)本檢測,結(jié)果顯示包被濃度為0.75mg/mL,包被量為0.5μL/cm時(shí),檢測結(jié)果符合上述2個(gè)要求。以0.4、0.8、1.0、1.4、1.8mg/mL作為羊抗鼠IgG多克隆抗體包被濃度包被C線,分別制備試紙條并進(jìn)行陽性標(biāo)本和PBS標(biāo)本檢測,結(jié)果顯示羊抗鼠IgG多克隆抗體包被濃度為1.0mg/mL,包被量為0.5μL/cm時(shí),檢測結(jié)果符合上述2個(gè)要求。2.5in內(nèi)觀察檢測結(jié)果以所制備試紙條分別對(duì)50ng/mLOA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測,分別在檢測2、3、5、10min內(nèi)觀察檢測結(jié)果;結(jié)果顯示反應(yīng)時(shí)間為2min時(shí),T線無條帶,C線顯色弱,測試不合格;反應(yīng)時(shí)間為3、5min時(shí),T線無條帶,C線顯色強(qiáng),測試合格;反應(yīng)時(shí)間為10min時(shí),T線有條帶,C線顯色強(qiáng),測試不合格。最終確定反應(yīng)時(shí)間3～5min觀察檢測結(jié)果效果最佳。2.6ua濃度檢測以上述最佳試驗(yàn)條件制備試紙條,對(duì)濃度分別為6.25、12.5、25、50、100、200、300、400ng/mL的OA標(biāo)準(zhǔn)品及PBS標(biāo)本進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示OA濃度小于或等于12.5ng/mL時(shí),T線均顯色;OA濃度大于或等于25ng/mL時(shí),T線均未顯色。以肉眼不可見T線顯色為標(biāo)準(zhǔn),確定所制備試紙條檢測靈敏度可達(dá)25ng/mL。2.7試紙條檢測結(jié)果將不同濃度OA標(biāo)準(zhǔn)液加入貝肉樣品中,每組設(shè)5個(gè)平行樣品進(jìn)行膠體金試紙條檢測,檢測結(jié)果見表1。當(dāng)加標(biāo)濃度為25ng/mL時(shí),T線顏色較C線淺,即檢測結(jié)果為陽性。樣品模擬提取法的平均回收率為92.04%,即檢測濃度為23.01ng/mL,與試紙條靈敏度基本一致。2.8膠體金檢測結(jié)果分別取處理0、2、48、96h染毒貝類樣品進(jìn)行膠體金檢測,結(jié)果顯示處理2h樣品呈陰性反應(yīng),即毒素濃度理論上低于檢測靈敏度,處理48、96h樣品呈陽性反應(yīng),即毒素濃度理論上高于檢測靈敏度。3膠體金顆粒及其與作用機(jī)理的互變檢測本試驗(yàn)以平均粒徑30nm的膠體金顆粒標(biāo)記抗OA單克隆抗體,以O(shè)A-OVA作為檢測帶,羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質(zhì)控帶,依據(jù)免疫層析競爭原理,建立了快速OA快速檢測方法,靈敏度為25ng/mL,反應(yīng)3～5min即可目測判斷結(jié)果。GICA檢測OA的原理是將待檢樣品溶液滴加在試紙條的一端,通過毛細(xì)作用向上移動(dòng),樣品中的OA先與膠體金標(biāo)記抗OA單抗特異性結(jié)合,隨后免疫復(fù)合物上移至T線(噴有OA-OVA);如樣品中的OA足夠多,則金標(biāo)抗體位點(diǎn)全部被結(jié)合,因此免疫復(fù)合物在T線不停留,即T線不顯色,免疫復(fù)合物繼續(xù)移動(dòng)至噴有羊抗鼠IgG多克隆抗體的C線,包被抗體可與免疫復(fù)合物結(jié)合,使C線顯紅色;如樣品中不含OA或OA濃度低于檢測靈敏度時(shí),2條線均顯紅色,可根據(jù)T線顏色深淺初步判斷樣品OA濃度。膠體金顆粒本身帶紫色,而顆粒大小將直接影響試紙條檢測效果。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果,若樣品OA>25ng/mL,T線不顯色,為陽性結(jié)果;反之,T線顯紅色,為陰性結(jié)果。加標(biāo)貝肉檢測結(jié)果表明,OA濃度稍高于或接近檢測靈敏度(25ng/mL)的樣品,一定要嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間為3～5min。若延長反應(yīng)時(shí)間,可能會(huì)由于少量金標(biāo)抗體抗原復(fù)合物的長時(shí)間附著積累,以及其他一些非特異性吸附反應(yīng)等的作用,干擾結(jié)果判斷,因?yàn)镚ICA畢竟僅可實(shí)現(xiàn)半定量檢測。影響GICA檢測性能的關(guān)鍵因素首先是抗體特異性,只有制備了高特異性抗體,才能生產(chǎn)出具有實(shí)用價(jià)值的檢測產(chǎn)品。本研究制備的抗OA單克隆抗體,特異性高,最大抑制率達(dá)90%以上,因此所建立的GICA靈敏度較高,能夠滿足實(shí)際樣品安全閾值檢測,具有很高的實(shí)用價(jià)值。其次是包被抗原結(jié)合率。本研究以O(shè)A-OVA作為包被抗原包被在T線上,只有具備較高結(jié)合率的OA-OVA才能使競爭結(jié)合的金標(biāo)抗體產(chǎn)生肉眼可識(shí)別的顏色變化,從而達(dá)到檢測目的。此外,膠體金顆粒大小以及均一性,溶液pH值及所用容器潔凈程度等因素可影響檢測靈敏度;硝酸纖維素膜質(zhì)量,特別是膜孔徑大小和均勻度,會(huì)影響抗體結(jié)合的表面積及樣本層析速度