儀器分析課件4液相色譜

第四章高效液相色譜分析概述高效液相色譜法的類(lèi)型及分離原理HPLC固定相HPLC流動(dòng)相HPLC儀器HPLC檢測(cè)器HPLC分離類(lèi)型的選擇HPLC使用、保養(yǎng)及應(yīng)用舉例液相制備色譜毛細(xì)管電泳

教學(xué)目標(biāo)及要求

1、掌握高效液相色譜法的特點(diǎn)及適用范圍，與GC及經(jīng)典LC的異同。2、掌握高效液相色譜儀的主要部件及基本流程。3、理解常用檢測(cè)器的原理、適用的分析對(duì)象及適用范圍。4、理解各種分離方式的原理及選擇原則。5、了解制備色譜高效毛細(xì)管電泳基本原理、儀器及特點(diǎn)。第一節(jié)概述

高效液相色譜（HPLC）是一種以液體為流動(dòng)相的快速分離分析色譜技術(shù)，采用細(xì)微粒固定相、高壓輸液泵和高靈敏度檢測(cè)器，具有高壓、高速、高效、高靈敏度的特點(diǎn)，對(duì)于那些沸點(diǎn)高，熱穩(wěn)定性差，相對(duì)分子質(zhì)量大的有機(jī)化合物如烷烴、烯烴、芳烴、染料、甾族化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸等均可進(jìn)行分離分析。

按照固定相不同分為：液液分配色譜；吸附色譜（液固色譜）；離子交換色譜；尺寸排阻色譜（凝膠滲透色譜）；離子色譜、平板色譜（薄層色譜）等。1.高效液相色譜特點(diǎn)高壓：HPLC供液壓力和進(jìn)樣壓力都很高（150～350×105Pa）。高壓是的一個(gè)突出特點(diǎn)。高速：HPLC采用高壓輸液設(shè)備，流速大增加，分析速度極快，只需數(shù)分鐘；而經(jīng)典方法靠重力加料，完成一次分析需時(shí)數(shù)小時(shí)。高效：填充物顆粒極細(xì)且規(guī)則，固定相涂漬均勻、傳質(zhì)阻力小，因而柱效很高?？梢栽跀?shù)分鐘內(nèi)完成數(shù)百種物質(zhì)的分離。高靈敏度：檢測(cè)器靈敏度極高：UV——10-9g,熒光檢測(cè)器——10-11g。2.HPLC與GC的比較分析對(duì)象及范圍：GC分析只限于氣體和低沸點(diǎn)的穩(wěn)定有機(jī)化合物（占總數(shù)的20%）；HPLC可分析高沸點(diǎn)、高分子量的穩(wěn)定或不穩(wěn)定有機(jī)化合物（占80%）。流動(dòng)相的選擇：GC采用的流動(dòng)相為幾種“惰性”氣體，只起運(yùn)載作用，對(duì)組分作用?。籋PLC采用的流動(dòng)相為液體或各種液體的混合（供選擇的機(jī)會(huì)多）。它除了起運(yùn)載作用外，還可與組分作用，并與固定相對(duì)組分的作用產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，即流動(dòng)相對(duì)分離的貢獻(xiàn)很大，可通過(guò)溶劑來(lái)控制和改進(jìn)分離。操作溫度：GC需高溫；HPLC通常在室溫下進(jìn)行。從速率理論各項(xiàng)的差別看HPLC與GC的區(qū)別1）渦流擴(kuò)散項(xiàng)AA=2dp2）分子擴(kuò)散項(xiàng)B/uB=2Dl3）傳質(zhì)阻力項(xiàng)包括固定相傳質(zhì)阻力系數(shù)和流動(dòng)相傳質(zhì)阻力系數(shù)改進(jìn)固定相成為提高液相色譜柱效的一個(gè)重要問(wèn)題結(jié)論：要提高液相色譜分離效率：提高填料均勻性，減小粒度，促進(jìn)傳質(zhì)實(shí)心核+多孔硅膠：大孔徑+淺孔道選用低黏度的流動(dòng)相，有利于提高傳質(zhì)速率流速降低→傳質(zhì)阻力降低、縱向擴(kuò)散增強(qiáng)、分析時(shí)間增加通過(guò)H－u曲線：HPLC比GC板高極小值小一個(gè)數(shù)量級(jí)，對(duì)應(yīng)的最佳流速也小一個(gè)數(shù)量級(jí)。其它影響因素柱前：進(jìn)樣位置，方式柱后：連接管、檢測(cè)器、死體積、死角等一、分配色譜（液－液分配色譜）原理

根據(jù)各待測(cè)物在互不相溶的兩溶液中的溶解度不同，因而具不同的分配系數(shù)。在色譜柱中，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，這種分配平衡需進(jìn)行多次，造成各待測(cè)物的遷移速率不同，從而實(shí)現(xiàn)分離的過(guò)程。第二節(jié)高效液相色譜法的類(lèi)型及分離原理2.流動(dòng)相根據(jù)流動(dòng)相與固定相極性的差別程度，可將液液色譜分為正相液-液色譜和反相液-液色譜。正相液-液色譜：流動(dòng)相極性小于固定相極性，極性小的先流出，適于極性組分分離。反相液-液色譜：流動(dòng)相極性大于固定相極性，極性大的先流出，適于非極性組分分離。3.固定相原則上，用于GC的固定相也可用于HPLC作固定相。但HPLC固定液易流失，因此常用的只有幾種，按極性由高到低為：

,’-氧二丙腈（ODPN)、聚乙二醇（PEM）、角鯊?fù)椋⊿Q）。早期通過(guò)在擔(dān)體上涂漬一薄層固定液制備固定相,現(xiàn)多為化學(xué)鍵合固定相（通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合在載體表面所形成的柱填充劑，具有穩(wěn)定、流失小、適于梯度淋洗等特點(diǎn)

）。正相色譜低極性流動(dòng)相反相色譜高極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相時(shí)間時(shí)間時(shí)間時(shí)間待測(cè)物極性：A>B>C正、反相色譜中極性和保留時(shí)間的關(guān)系二、吸附色譜（液－固吸附色譜）是基于各組分在固體吸附劑表面上具有不同吸附能力而進(jìn)行分離。以固體吸附劑為固定相，如極性的硅膠、氧化鋁、分子篩和非極性的活性炭等（較常使用硅膠）。流動(dòng)相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。宜于分離極性不同或含極性基團(tuán)相同但數(shù)目不同的試樣，也適于分離異構(gòu)體，但不宜于分離同系物。

三、離子對(duì)色譜法（IPC）主要用來(lái)分離強(qiáng)極性有機(jī)酸和有機(jī)堿。原理：將與待測(cè)物離子A電荷相反的離子B（稱(chēng)為對(duì)離子或反離子）加入到流動(dòng)相中，使待測(cè)離子與對(duì)離子形成離子對(duì)AB，該AB離子對(duì)的性質(zhì)與A離子或B離子的性質(zhì)不同，即間接改變了待測(cè)離子的保留特性。還可借助離子對(duì)的生成給試樣引入紫外吸收活發(fā)熒光的基團(tuán)，以提高檢測(cè)的靈敏度。四、離子交換色譜此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)相結(jié)合，測(cè)定各類(lèi)陰、陽(yáng)離子的分離分析方法。它既適于無(wú)機(jī)離子，也適于有機(jī)物分離，如蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸等。1.

原理：利用不同待測(cè)離子對(duì)固定相的親和能力（或離子交換能力）的差別來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的。五、離子色譜（IC）

以無(wú)機(jī)、特別是無(wú)機(jī)陰離子混合物為主要分析對(duì)象。原理:采用交換容量非常低的特制離子交換樹(shù)脂為固定相；在分離柱后，用另外一支抑制柱來(lái)消除淋洗液的高本底電流;采用電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)流出組分?？焖俜蛛x分析微量無(wú)機(jī)離子混合物;各種抑制裝置及無(wú)抑制方法的出現(xiàn)，發(fā)展迅速。例如：分析陽(yáng)離子時(shí)，以無(wú)機(jī)酸為流動(dòng)相，抑制柱為高容量的強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂，則發(fā)生下列反應(yīng)：R+—OH+HCl(流動(dòng)相)——R+—Cl-+H2OR+—OH+MCl(待測(cè)物)——R+—Cl+M+OH-

可見(jiàn)，不僅大量酸轉(zhuǎn)化為低電導(dǎo)的水，而且待測(cè)離子轉(zhuǎn)化為具有更大淌度的堿。特點(diǎn)：分析速度快：可在數(shù)分鐘內(nèi)完成一個(gè)試樣的分析；分離能力高：在適宜的條件下，可使常見(jiàn)的各種陰離子混合物分離；

分離混合陰離子（NO3—、NO2－、SO42－、PO43－等）惟一快速、靈敏、準(zhǔn)確的最有效分析方法。缺點(diǎn)：抑制柱要定期再生、譜峰在經(jīng)過(guò)抑制柱后會(huì)展寬，降低分離度。六、空間排阻色譜法又稱(chēng)凝膠（滲透）色譜，主要用于大分子的分子分離。它是基于待測(cè)物分子的尺寸和形狀不同來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的。1、分離原理：固定相為化學(xué)惰性的多孔凝膠，它類(lèi)似于分子篩，但孔徑更大。凝膠內(nèi)有一定大小的空穴，分子體積大的待測(cè)物不能滲入孔穴中而被排阻，較早地被淋洗出來(lái)，中等的部分滲透，小分子則完全滲透，最后流出色譜柱。即待測(cè)物分子按分子大?。ǚ肿恿看笮。┫群髲闹辛鞒觥O性增加不溶于水溶于水非極性離子非離子極性吸附反向分配分配正向分配離子交換尺寸排阻凝膠滲透凝膠過(guò)濾分子量第三節(jié)HPLC固定相一、液-液色譜法、鍵合相色譜法及離子對(duì)色譜法固定相全多孔型擔(dān)體表層多孔型擔(dān)體化學(xué)鍵合固定相：用化學(xué)反應(yīng)方法通過(guò)化學(xué)鍵把有機(jī)分子結(jié)合到擔(dān)體表面化學(xué)鍵合固定相特點(diǎn)：無(wú)液坑、無(wú)流失、選擇性可靈活改變、有利于梯度洗提、有利于配用靈敏的檢測(cè)器和餾分收集器二、液-固吸附色譜法固定相多孔型、薄殼型三、離子交換色譜法固定相薄膜型離子交換樹(shù)脂離子交換鍵合固定相：鍵合薄殼型、鍵合微粒擔(dān)體型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂：強(qiáng)酸性、弱酸性樹(shù)脂陰離子交換樹(shù)脂：強(qiáng)堿性、弱堿性樹(shù)脂微孔型大孔型微孔微孔薄膜型表面多孔型離子交換層惰性核惰性核離子交換劑硅膠層涂覆按固定相制作方法可分為：四、排阻色譜法固定相軟質(zhì)凝膠：水為流動(dòng)相，孔徑大小由交聯(lián)劑控制半硬質(zhì)凝膠：適用于非極性有機(jī)溶劑，不能隨意更換溶劑，能耐較高壓力，流速不宜大硬質(zhì)凝膠：多孔硅膠、多孔玻珠；多孔硅膠化學(xué)穩(wěn)定性好，熱穩(wěn)定性好，機(jī)械強(qiáng)度高，吸附問(wèn)題需要進(jìn)行特殊處理。選擇填料時(shí)首先要考慮相對(duì)分子質(zhì)量排阻極限第四節(jié)HPLC流動(dòng)相流動(dòng)相選擇注意事項(xiàng)純度避免對(duì)固定相的影響對(duì)試樣要有適宜的溶解度黏度小與檢測(cè)器匹配2.流動(dòng)相選擇依據(jù)常用溶劑極性順序：水，甲酰胺，乙腈，甲醇，乙醇，丙醇，丙酮，二氧六環(huán)，四氫呋喃，甲乙酮，正丁醇，醋酸乙酯，乙醚，異丙醚，二氯甲烷，氯仿，溴乙烷，苯，氯丙烷，甲苯，四氯化碳，環(huán)己烷，己烷，庚烷，煤油3.離子交換色譜在含水介質(zhì)中進(jìn)行用流動(dòng)相中鹽的濃度和pH來(lái)控制組分的保留值，增加鹽的濃度可以降低保留值。陽(yáng)離子交換柱流動(dòng)相pH增加，保留值降低。4.排阻色譜法流動(dòng)相排阻色譜法所用溶劑必須與凝膠本身非常相似。軟質(zhì)凝膠時(shí)，溶劑必須能溶脹凝膠。溶劑的黏度高將限制擴(kuò)散作用而損害分辨率。第五節(jié)HPLC儀器數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)HPLC的組成-由幾個(gè)獨(dú)立的系統(tǒng)組成數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)HPLC儀器包括：高壓輸液裝置→進(jìn)樣系統(tǒng)→分離系統(tǒng)→檢測(cè)系統(tǒng)此外還配有梯度淋洗、自動(dòng)進(jìn)樣和數(shù)據(jù)處理裝置。梯度淋洗1.高壓輸液系統(tǒng)1）貯液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶劑過(guò)濾器(Ni合金)，其孔徑約2m，可防止顆粒物進(jìn)入泵內(nèi)。2）脫氣：超聲波脫氣或真空加熱脫氣。溶劑通過(guò)脫氣器中的脫氣膜，相對(duì)分子量小的氣體透過(guò)膜從溶劑中除去。3）高壓泵：要求：密封性好、輸液流量穩(wěn)定無(wú)脈動(dòng)、可調(diào)范圍寬、耐腐蝕。輸液泵種類(lèi)：恒壓型和恒流型。4）梯度淋洗裝置：作用是在分離過(guò)程中，按一定的程序連續(xù)改變流動(dòng)相中多種不同性質(zhì)溶劑的配比，以改變流動(dòng)相的極性、離子強(qiáng)度或酸度等，從而提高試樣的分離效率，縮短分析時(shí)間，使色譜峰形得到改善，提高測(cè)定的靈敏度和定量的準(zhǔn)確度。混合器低壓梯度比例閥

高壓梯度低壓梯度脫氣機(jī)高壓/低壓梯度系統(tǒng)二元泵工作原理Damper阻尼器PurgevalveMixerABInletvalveOutletvalveWasteInletvalveOutletvalve2.進(jìn)樣系統(tǒng)1）注射進(jìn)樣：使用微量注射器進(jìn)樣。裝置簡(jiǎn)單、死體積小。但進(jìn)樣量小且重現(xiàn)性差。2）高壓進(jìn)樣閥：目前最常用的為六通閥。由于進(jìn)樣量可由樣品管控制，因此進(jìn)樣準(zhǔn)確，重復(fù)性好。裝入樣品出口進(jìn)樣采樣環(huán)泵入溶劑進(jìn)色譜柱自動(dòng)進(jìn)樣器特點(diǎn)靈活的進(jìn)樣方式：全定量部分定量攜帶進(jìn)樣全定量（更準(zhǔn)確）

部分定量（靈活，不需更換定量環(huán)）

攜帶進(jìn)樣（節(jié)省樣品使用量）

3.分離系統(tǒng)1）要求：內(nèi)壁光滑的優(yōu)質(zhì)不銹鋼柱，柱接頭的死體積盡可能小。柱長(zhǎng)多為15~30cm，內(nèi)徑為4~5mm；2）柱的填充：主要采用勻漿法。填充方法：填充時(shí)，將制作好的勻漿液，用流動(dòng)相充滿色譜柱及其延長(zhǎng)管中，然后將勻漿液倒入勻漿填充器，在較高壓力下迅速將其注入色譜柱內(nèi)。要求填充速度快（防凝聚、沉降或結(jié)塊）、且無(wú)空氣進(jìn)入（影響填充均勻性）。4.檢測(cè)系統(tǒng)

靈敏度高，重現(xiàn)性好，響應(yīng)快，線性范圍寬，適用范圍廣。對(duì)流動(dòng)相流量和溫度波動(dòng)不敏感，死體積小。紫外光度檢測(cè)器光電二極管陣列檢測(cè)器熒光檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器電導(dǎo)檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器5.記錄分析系統(tǒng)第六節(jié)HPLC檢測(cè)器紫外光度檢測(cè)器熒光檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器電導(dǎo)檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器幾種常用檢測(cè)器主要性能比較1.紫外檢測(cè)器

依據(jù)被分析組分對(duì)特定紫外光的選擇性吸收。最小檢測(cè)量10-9g·mL-1，對(duì)流量和溫度的波動(dòng)不敏感，可用于梯度洗脫。對(duì)溫度和流速不敏感，可用于梯度洗脫，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單不適用于對(duì)紫外光完全不吸收的試樣，溶劑的選用受限制為擴(kuò)大應(yīng)用范圍和提高選擇性可應(yīng)用可變波長(zhǎng)檢測(cè)器可通過(guò)短時(shí)間中斷液流進(jìn)行快速掃描得到紫外吸收光譜紫外普通檢測(cè)器和光電二極管陣列檢測(cè)器的比較普通檢測(cè)器光電二極管陣列檢測(cè)器光電二極管陣列檢測(cè)器波長(zhǎng)可的松氟美松皮質(zhì)酮快速掃描—光電二極管陣列（PDA）檢測(cè)所獲得的三維色譜-光譜圖波長(zhǎng)范圍190～1015nm同時(shí)檢測(cè)掃描快，無(wú)需停流保留值與光譜圖結(jié)合定性可根據(jù)每個(gè)色譜峰的指定位置實(shí)時(shí)光譜比較，判斷當(dāng)時(shí)所出樣品的純度及分離狀況。2.熒光檢測(cè)器

根據(jù)某些物質(zhì)受激后能產(chǎn)生一定強(qiáng)度熒光的性質(zhì)，可制成靈敏度極高的熒光檢測(cè)器。它是一種選擇性很強(qiáng)的檢測(cè)器，其靈敏度比UV檢測(cè)器高2~3個(gè)數(shù)量級(jí)。但線性范圍僅約10-3.適合于稠環(huán)芳烴、甾族化合物、酶、氨基酸、維生素、色素、蛋白質(zhì)等熒光物質(zhì)的測(cè)定。

利用可調(diào)諧的激光做光源（激光熒光光譜）可使檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度都得到提高。原理：利用兩束相同角度的光照射溶劑相和樣品+溶劑相，利用二者對(duì)光的折射率不同。為通用型檢測(cè)器，靈敏度為10-7g/mL。但對(duì)溫度變化敏感，且不適于梯度淋洗。光源調(diào)零光學(xué)零參比樣品平面鏡透鏡光電轉(zhuǎn)換記錄儀放大器遮光板3.示差折光檢測(cè)器4.電導(dǎo)檢測(cè)器主要用于離子色譜的檢測(cè)。

原理：基于待測(cè)物在一些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生的電導(dǎo)（電阻的倒數(shù)）變化來(lái)測(cè)量電離物質(zhì)的含量。受溫度影響較大，要求嚴(yán)格控制溫度，要監(jiān)測(cè)。5.蒸發(fā)光散射檢測(cè)器

是一種通用型檢測(cè)器，比示差折光檢測(cè)器靈敏度高，不受溶劑和溫度影響，可用于梯度洗脫。

不宜采用非揮發(fā)性緩沖溶液作流動(dòng)相。

響應(yīng)值與試樣質(zhì)量成正比。可以在沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品的情況下采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定未知物的近似含量。6.幾種常用檢測(cè)器的主要性能UV熒光示差折光電化學(xué)質(zhì)譜蒸發(fā)光信號(hào)流速影響溫度影響檢測(cè)限(g/ml)池體積(μl)梯度洗脫樣品破壞吸光度無(wú)小10-102~10適宜無(wú)熒光強(qiáng)度無(wú)小10-132~7適宜無(wú)折光率無(wú)大10-7––不宜無(wú)電流有大10-13＜1不宜無(wú)離子流強(qiáng)度無(wú)––適宜有散射光強(qiáng)度無(wú)小10-9––適宜無(wú)第七節(jié)色譜分離方法的選擇

一般可根據(jù)試樣相對(duì)分子質(zhì)量范圍、溶解度及分子結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分離方法的初步選擇。一、根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量選擇二、根據(jù)溶解性選擇三、根據(jù)分子結(jié)構(gòu)選擇試樣溶于水不溶于水不溶于水溶于水，不解離溶于水，可解離溶于水，離子與非離子排阻色譜，水為流動(dòng)相排阻色譜，非水流動(dòng)相異構(gòu)體多官能團(tuán)同系物分子大小差異反相色譜排阻色譜（小孔），水為流動(dòng)相堿酸反相離子對(duì)色譜相對(duì)分子質(zhì)量>2000相對(duì)分子質(zhì)量<2000正相或反相色譜吸附色譜排阻色譜陽(yáng)離子交換色譜陰離子交換色譜極性增加不溶于水溶于水非極性離子非離子極性吸附反向分配分配正向分配離子交換尺寸排阻凝膠滲透凝膠過(guò)濾分子量HPLC的日常操作條件最好是恒溫、恒濕

溫度：15—30℃

相對(duì)濕度<80%房間應(yīng)有良好的通風(fēng)空調(diào)或其他設(shè)備產(chǎn)生的氣流不要直吹儀器避免光線直射遠(yuǎn)離高電干擾、高振動(dòng)設(shè)備第八節(jié)HPLC使用、保養(yǎng)及應(yīng)用舉例1.流動(dòng)相是否過(guò)濾2.水與有機(jī)溶劑混合時(shí)溫度變化大，必須待恢復(fù)到室溫時(shí)方可使用，否則易產(chǎn)生氣泡。3.更換流動(dòng)相時(shí)注意兩種流動(dòng)相必須具有互溶性。啟動(dòng)前檢查4.更換不互溶性流動(dòng)相時(shí)應(yīng)先用異丙醇進(jìn)行置換。5.更換緩沖鹽流動(dòng)相時(shí)，用純水清洗。6.保持貯液瓶清潔，對(duì)專(zhuān)用貯液瓶應(yīng)定期清洗；用試劑瓶作貯液瓶時(shí)，要經(jīng)常更換。7.定期在稀硝酸溶液中超聲、清洗過(guò)濾器，保持過(guò)濾器暢通無(wú)阻。8.每天開(kāi)始使用儀器時(shí)注意放空排氣，確保泵頭、流動(dòng)池以及其它流路系統(tǒng)中無(wú)氣泡存在。泵的使用與維護(hù)注意事項(xiàng)1.防止任何固體微粒進(jìn)入泵體（0.2um或0.45um的微孔濾膜過(guò)濾）。2.流動(dòng)相應(yīng)先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性。3.泵工作時(shí)防止溶劑瓶?jī)?nèi)的流動(dòng)相用完，否則空泵運(yùn)轉(zhuǎn)會(huì)磨損柱塞、密封圈，導(dǎo)致漏液。4.輸液泵的工作壓力決不要超過(guò)規(guī)定的最高壓力，否則會(huì)使高壓密封環(huán)變形造成漏液。輸液系統(tǒng)5.流動(dòng)相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)。6.緩沖液使用前必須過(guò)濾。7.磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液易受到細(xì)菌和霉菌的影響，不得放置過(guò)夜，應(yīng)臨用現(xiàn)制。

8.含有緩沖液的流動(dòng)相不應(yīng)保留在泵內(nèi)。使用緩沖液后用兩通管連接管路及檢測(cè)池，先用純水沖洗，然后用甲醇沖洗。管路及檢測(cè)池沖洗干凈后再?zèng)_洗色譜柱。反相柱先用含5%~7%甲醇的水沖洗色譜柱（此時(shí)不要再連接檢測(cè)池），然后用甲醇或甲醇-水混合液沖洗。緩沖液不得在色譜柱中過(guò)夜。注意：用緩沖液后不能直接換用有機(jī)溶劑

手動(dòng)進(jìn)樣器操作注意點(diǎn)：1）樣品溶液必須用0.45um的濾膜過(guò)濾2）進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣針應(yīng)插到底3）不使用時(shí)將針頭留在進(jìn)樣器內(nèi)4）進(jìn)樣應(yīng)使用液相色譜專(zhuān)用平頭進(jìn)樣針5）轉(zhuǎn)動(dòng)閥芯時(shí)不能太慢，更不能停留在中間位置6）樣品溶液pH小于10,常用密封墊的材質(zhì)適用pH<10,否則換特氟隆材質(zhì)的密封墊pH10-13定子轉(zhuǎn)子針頭密封墊彈簧不銹鋼套進(jìn)樣器的保養(yǎng)進(jìn)樣系統(tǒng)柱的保養(yǎng)8945612370xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx00000000LC-10AD:::::::輸液時(shí)不要打開(kāi)排液閥柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強(qiáng)烈震動(dòng)分離系統(tǒng)當(dāng)柱子和色譜儀連結(jié)時(shí)，閥件或管路一定要清洗干凈要注意流動(dòng)相的脫氣避免使用高粘度的溶劑作為流動(dòng)相進(jìn)樣樣品要提純控制進(jìn)樣量每天分析工作結(jié)束后，要清洗進(jìn)樣閥中殘留的樣品每天工作結(jié)束后用適當(dāng)?shù)娜軇﹣?lái)清洗柱當(dāng)分析柱長(zhǎng)期不使用，應(yīng)用適當(dāng)有機(jī)溶劑封柱保存柱的保養(yǎng)檢測(cè)器的保養(yǎng)紫外燈的保養(yǎng)：分析前，柱平衡差不多時(shí)，打開(kāi)檢測(cè)器；在分析完畢后，先關(guān)紫外燈。（頻繁的開(kāi)關(guān)燈會(huì)縮短燈的使用壽命）樣品池要保養(yǎng)1）用HPLC級(jí)溶劑2）過(guò)濾流動(dòng)相和溶劑3）脫氣檢測(cè)系統(tǒng)第九節(jié)液相制備色譜制備色譜是以色譜技術(shù)來(lái)分離，制備較大量純組分的有效方法。1.色譜柱的柱容量分析型：不影響柱效

制備型：不影響收集物純度制備色譜色譜柱常常處于超載情況，柱效將大幅度降低，峰形變寬，分離變差，保留值也隨之改變。2.液相制備色譜方法3.液相制備色譜儀第十節(jié)毛細(xì)管電泳一、基本原理1、概述在電解質(zhì)溶液中，位于電場(chǎng)中的帶電離子在電場(chǎng)力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱(chēng)之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同可實(shí)現(xiàn)分離。

毛細(xì)管電泳是以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力